专利名称：一种检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中细菌的分子生物学检测试剂盒，特别是涉及检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR试剂盒及其应用
背景技术：
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种重要的人畜共患病致病菌，在4°C能生长繁殖，能引起人和动物脑膜炎、败血症及孕妇流产等，死亡率极高，可达30% 70%。在公共卫生和食品卫生安全中越来越受到重视，已成为国家食源性疾病检测的菌种之一。长期以来对LM的检测方法主要是传统的国标培养法(GB4789. 30-2010)，采用以表型特征为特点的生化反应和血清反应对LM进行鉴定，但鉴定能力有限，常因表型特征的变异给鉴定带来困难。对于这样依靠表型特征不能准确鉴定的LM，采用分子生物学的检测方法常能得到准确的鉴定结果，尤其是抗污染能力强、特异性高、灵敏度好、容易重复的荧光定量PCR检测方法。
发明内容
为解决背景技术中的检测单核细胞增生李斯特菌的问题，本发明一方面提供了一种检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR试剂盒，试剂盒包括一对引物、一个探针以及阳性定量模板，所述引物、探针的序列为上游引物Hl 5，-gattcccattatgaacgaag-3’ (SEQ ID No. I),下游引物H2 5，-tcagttccttacagatgag-3，(SEQ ID No. 2),突光探针Pl 5，-FAM-acagccagtactagttcatcgca-TAMRA-3’ (SEQ ID No. 3),其中FAM为5’端的荧光基团，TAMRA为3’端的荧光淬灭基团，所述阳性定量模板是含有序列为catggcaccaccagcatctataggagcactcgccgccacat catcgaaaagaaacacgcggatg (SEQ ID No. 4)的 DNA 片段的 pMD18_T 重组质粒。本发明提供的试剂盒可以进一步包括荧光定量聚合酶和参比染料，如Takara公司的 Premix Ex Taq 聚合酶和 ROX Reference Dye II 染料。本发明还提供了该试剂盒在检测临床样品里存在的单核细胞增生李斯特菌中的应用。本发明提供的试剂盒的使用方法为(I)反应体系(25 μ L)为模板DNA 2. O μ L、10 μ M 引物 I. O μ L、3 μ M探针 I. O μ L、 Premix Ex Taq (2 X)荧光定量聚合酶 12. 5 μ L、ROX Reference Dye II(50X)染料
0.5 μ L、无菌水 8 μ L0反应程序为95°C预变性30秒，随后进行40个循环，每个循环程序为95°C 5秒、 60 0C 20 秒。(2)定量标准曲线制备将定量阳性模板按10倍稀释法稀释成101° IO4拷贝/ ml的7个浓度梯度，按照上述反应体系和反应程序进行Real-time PCR,反应结束后计算机自动绘制标准曲线Y = 3乂+13、1 24€6其中乂表示起始模板拷贝数的对数，￥表示0(0值。(3)样品检测从待测样品中DNA，随后按照步骤(I)反应体系和反应程序进行扩增即可。(4)结果判断设置阴性对照和空白对照，待测样品C(t)值小于35. O为阳性，大于35. O时为阴性。
图I是利用阳性质粒制作标准曲线时，不同稀释度的质粒荧光定量PCR扩增曲线， 从左至右各条曲线代表10' ΙΟ9、108、IO7, ΙΟ6、105、IO4个/ml拷贝数质粒扩增曲线。图2是荧光定量PCR标准曲线结果，标准曲线回归方程Y = -3. 4101ogX+45. 10，相关系数R2 = O. 999，扩增效率Eff = 96. 5%0图3是灵敏度检测结果，不同质粒稀释度的结果，从左至右各条曲线代表104、103、 IO2UO1U 个/μ I 质粒。
具体实施例方式实施例I :本发明所述的试剂盒的制备检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR试剂盒的组成包括上游引物Hl 5，-gattcccattatgaacgaag-3’ (SEQ ID No. I),下游引物H2 5，-tcagttccttacagatgag-3，(SEQ ID No. 2),突光探针Pl 5，-FAM-acagccagtactagttcatcgca-TAMRA-3’ (SEQ ID No. 3)阳性定量模板含有序列为catggcaccaccagcatctataggagcactcgccgccacatcatc gaaaagaaacacgcggatg (SEQ ID No. 4)的 DNA 片段的 pMD18_T 重组质粒。试剂盒还可以进一步包括荧光定量聚合酶和参比染料。其中，引物、探针是在Genbank中查找多种单核细胞增生李斯特菌的hly基因并分析其保守区段的基础上，使用Bacon Designer 5. O软件设计的，并按照本领域常规的方法合成。阳性定量模板采用本领域常规的方法制备提取单核细胞增生李斯特菌(ATCC 54001购自ATCODNA ;使用序列为SEQ ID No. 1、2的引物扩增出序列为SEQ ID No. 4的片段；并通过连接、转化将该片段插入PMD18-T载体；最后进行鉴定。本申请实施例中实际使用的荧光定量聚合酶Premix Ex Taq 和参比染料 ROXReference Dye II 均购自 Takara 公司。实施例2使用试剂盒检测单核细胞增生李斯特菌I.待测样品的处理从待测样品提取DNA。本申请实施例中实际使用的DNA提取试剂盒购自Takara公司。2.荧光定量PCR过程反应体系(25μ L)为模板 DNA 2. O μ L、10 μ M 引物 I. O μ L、3 μ M 探针 I. O μ L、 Premix Ex Taq (2 X)荧光定量聚合酶 12. 5 μ L、ROX Reference Dye II(50X)染料
0.5 μ L、无菌水 8 μ L0
反应程序为95°C预变性30秒，随后进行40个循环，每个循环程序为95°C 5秒、 60 0C 20 秒。本申请实施例中实际使用Roche公司的480型荧光定量PCR仪记录结果。3.标准曲线制备将定量阳性模板线性化后10倍倍比稀释，依次从101°稀释到IO4拷贝/ml。各取2μ I按照上面的步骤进行荧光定量PCR，制作标准曲线。结果见
图I和图 2。荧光定量PCR标准曲线相关系数R2 = O. 999，扩增效率Eff = 96. 5 %，回归方程Y =-3. 4101ogX+45. 10。从图2可以看出，用阳性质粒所作的标准曲线的C(t)值与初始浓度有较好的线性关系。4.特异性验证用建立的荧光定量RT-PCR方法对单核细胞增生李斯特菌(ATCC 54001购自 ATCC)、格氏李斯特菌(ATCC 700545购自ATCC)、绵羊李斯特菌(ATCC 19119购自ATCC)、肠炎沙门氏菌(本实验室保存)、大肠埃希氏菌(本实验室保存)、空白对照进行检测。单核细胞增生李斯特菌C(t)值为15. 28，而其他四种菌的样品检测结果均为阴性，表明建立的荧光定量RT-PCR方法不会受到这些类似菌株的干扰(特异性验证结果未显示)。5.灵敏度测试阳性质粒从I. OX IO5拷贝/ μ LlO倍倍比稀释，荧光定量PCR检测。显示于图3的结果表明本发明提供的试剂盒灵敏度可达I拷贝/y L。上述实施例的实验结果表明，本发明提供的检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR试剂盒特异性强、灵敏度高、组成简单、操作方便，可以实现对单核细胞增生李斯特菌的快速检测。
权利要求
1.一种检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR试剂盒，包括一对引物、一个探针以及阳性定量模板，所述引物、探针的序列为上游引物 Hl 5，-gattcccattatgaacgaag-3’ (SEQ ID No. I),下游引物 H2 5，-tcagttccttacagatgag-3，(SEQ ID No. 2),突光探针 Pl 5，-FAM-acagccagtactagttcatcgca-TAMRA-3’ (SEQ ID No. 3),其中FAM为5’端的荧光基团，TAMRA为3’端的荧光淬灭基团，所述阳性定量模板是含有序列为 catggcaccaccagcatctataggagcactcgccgccacatcatcgaaaagaaacacgcggatg (SEQ ID No. 4)的DNA片段的pMD18-T重组质粒。
2.权利要求I所述的试剂盒，其进一步包括荧光定量聚合酶和参比染料。
3.权利要求2所述的试剂盒在检测临床样品里存在的单核细胞增生李斯特菌中的应
全文摘要
本发明提供了一种检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR试剂盒，试剂盒包括一对引物、一个探针以及阳性定量模板，引物、探针的序列分别为SEQ ID No.1、2、3，阳性定量模板是含有序列为SEQ ID No.4的DNA片段的pMD18-T重组质粒；试剂盒可以进一步包括荧光定量聚合酶和参比染料；还提供了该试剂盒在检测临床样品里存在的单核细胞增生李斯特菌中的应用。实验结果表明，本发明提供的检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR试剂盒特异性强、灵敏度高、组成简单、操作方便，可以实现对单核细胞增生李斯特菌的快速检测。
文档编号C12Q1/68GK102586413SQ20111027656
公开日2012年7月18日 申请日期2011年9月9日 优先权日2011年9月9日
发明者吕爱杰, 朱丽萍, 颜世敢 申请人:山东轻工业学院