专利名称：一种用于肝细胞培养的无血清培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养用培养基，具体涉及一种用于肝细胞培养的无血清培养基。
背景技术：
肝脏作为人体中最重要的器官之一，承担着合成、分泌、代谢、解毒等多种复杂的功能。一旦由各种原因造成肝细胞的大量坏死，将会出现肝衰竭，导致机体代谢紊乱和毒性物质的堆积，而这反过来又加重了肝细胞的损伤，影响肝细胞的再生，进而形成肝衰竭的恶性循环。急性肝功能衰竭是一种严重的肝脏疾病，死亡率高达60 90%。目前，对此最有效的治疗方法为肝脏移植。然而，由于供体器官缺乏、费用高昂、需长期使用免疫抑制剂等原因，往往在等待供体过程中，病人由于病情进展而迅速死亡，极大地限制了肝移植手术的广泛开展。因此，以培养肝细胞为基础的生物型人工肝技术成为终末期肝病患者向原位肝移植顺利过渡、以及给急性肝功能衰竭患者受损肝脏提供得以再生和修复时机的重要手段。目前认为，生物人工肝要达到理想支持效果，至少需要1010以上数量级的有较好功能的细胞，同时细胞自身及其生长的环境不能对人体产生负面的影响。然而动物细胞的生长均有赖于血清的存在，在普通培养基中，如不加血清，绝大部分细胞不能增殖。血清的主要作用在于提供细胞生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，维持细胞较好的生长状态，促进细胞的生长与分裂增殖。然而经研究发现，细胞培养中使用血清存在着多种缺点首先，具有批间差异，不同批次血清间的生物活性和因子不一致，将会导致产品和实验结果的重现性差，进而需要大量验证工作；其次，血清的来源不稳定、成分不明确、以及有抑制生长的成分，不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化；再者，存在污染外源病毒和致病因子的风险，容易被病毒和支原体感染；进一步，制品中残留的牛血清易引起被接种者对血清的过敏反应，不利于动物实验或者临床试验等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于肝细胞培养的无血清培养基，其可在同等条件的肝细胞培养过程中有效地代替血清成分，提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境， 使细胞生长良好，并使细胞形态、密度、活力、功能与含血清培养基基本相同，以克服现有技术的不足。本发明的目的是通过以下技术方案实现的—种用于肝细胞培养的无血清培养基，其包含基础培养基和添加组分。其中，所述添加组分包括胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、表皮生长因子、肝细胞生长因子、纤粘连蛋白、 地塞米松和胰高血糖素。上述添加组分中的各组分在该无血清培养基中的浓度为胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠表皮生长因子肝细胞生长因子纤粘连蛋白地塞米松
说明书
0. 1 ~ lOpg/mL 0. 5 ~ lOpg/mL 5~IOpg/L 1 ~ 100ng/mL 1 ~ 100ng/mL 0.1 ~ lpg/mL 0.1 ~ 10nmol/mL
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胰高血糖素0. 05 ~ 5pg/mL该基础培养基为DMEM/F12(DMEM NUTRIENT MIX F12)培养基、DMEM高糖培养基等
培养基。在本发明中，该胰岛素可通过作用于肝细胞表面的胰岛素受体，增强肝细胞对葡萄糖的摄入和利用，同时促进肝细胞内的RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，从而增强肝细胞的活力与功能。该转铁蛋白的主要作用为调节体内铁元素的代谢，通过细胞表面的转铁蛋白受体将铁元素转移到细胞内。同时，该转铁蛋白还可以与其他微量元素，如钒等结合，从而调节肝细胞的生长增殖与功能表达。该亚硒酸钠作为人体的必需微量元素硒的存在形式，起到保护细胞免受氧化应激的作用。该表皮生长因子和肝细胞生长因子的主要作用为促进肝细胞的增殖，以及调节肝细胞的功能。该纤粘连蛋白的主要作用为促进肝细胞的粘附，及其贴壁生长。该地塞米松和胰高血糖素是体内重要的激素，参与肝细胞的糖代谢、脂类代谢等， 能调节肝细胞的增殖与功能表达。其中，该地塞米松是通过乙醇溶解获得的，具体的方法为称取地塞米松粉末 39. ang，然后加入IOml的无水乙醇溶解，再加入无菌蒸馏水稀释100倍，在4°C的温度中保
存备用。该表皮生长因子是通过水溶解获得的，其具体制备方法为称取表皮生长因子 200ug，然后加入20ml灭菌蒸馏水溶解，在_20°C温度中保存备用。该肝细胞生长因子是通过水溶解获得的，其具体制备方法如下称取肝细胞生长因子25ug，然后加入IOml灭菌蒸馏水溶解，在-20°C温度中保存备用。进一步，所述无血清培养基中还可含有HEPES，即4-羟乙基哌嗪乙磺酸；N_(2_羟乙基)哌嗪-N' -2-乙烷磺酸，其浓度为lOmmol/L。该HEPES主要起到控制无血清培养基在较长的时间内保持恒定的PH值范围的作用。进一步，所述无血清培养基还可含有抗生素。所述抗生素优选为青霉素和/或链霉素。所述青霉素的量为10000U，和/或所述链霉素的量为10000U。所述抗生素的主要作用为防止细胞在培养的过程中受到污染而影响实验结果。本发明所提供的无血清培养基不含有胎牛血清及不含任何动物来源成份，能提供细胞生长增值所需的充足营养与良好环境，各添加组份能通过各种机制在肝细胞培养过程中有效地代替血清成分，细胞生长良好，细胞形态、密度、活力、功能与含血清培养基基本相同。
图IA是本发明实施例1中的实验组培养的C3A细胞(第二天)在倒置显微镜下的生长状态图。图IB是本发明实施例1中的阳性对照组培养的C3A细胞(第二天)在倒置显微镜下的生长状态图。图IC是本发明实施例1中的阴性对照组培养的C3A细胞(第二天)在倒置显微镜下的生长状态图。图2是实施例1中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞的生长曲线图。图3是实施例1中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞的MTT法测细胞活力曲线图。图4是实施例1中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞培养上清中 ALT的浓度图。图5是实施例1中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞培养上清中尿素的浓度图。图6是实施例1中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞培养上清中白蛋白的浓度图。图7是实施例2中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞的生长曲线图。图8是实施例2中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞的MTT法测细胞活力曲线图。图9是实施例2中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞培养上清中 ALT的浓度图。图10是实施例2中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞培养上清中尿素的浓度图。图11是实施例2中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞培养上清中白蛋白的浓度图。图12是实施例3中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞的生长曲线图。图13是实施例3中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞的MTT法测细胞活力曲线图。图14是实施例3中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞培养上清中ALT的浓度图。图15是实施例3中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞培养上清中尿素的浓度图。图16是实施例3中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞培养上清中白蛋白的浓度图。
具体实施例方式实施例1本实施例中，配制三组培养基，分别为无血清培养基、阳性照组培养基和阴性对照组培养基。其中，阳性对照组培养基为DMEM高糖培养基加入10%胎牛血清；阴性对照组培养基为DMEM高糖培养基。培养的细胞为人C3A细胞。以下为详细的实验及检测步骤1、培养基的配置无血清培养基每500mL的DMEM/F12培养基(由GIBCO公司提供的，货号为11330 的培养基)中添加5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。加入添加组分，
并使得添加组分在该无血清培养基中的浓度为
胰岛素5pg/mL
转铁蛋白5pg/mL
亚硒酸钠1 OpgZL
表皮生长因子(EGF)20ng/mL
肝细胞生长因子(HGF)20ng/mL
纤粘连蛋白lpg/mL
地塞米松Inmol/mL
胰高血糖素4pg/mL阳性对照组培养基每500mL的DMEM高糖培养基(由GIBCO公司提供的，货号为 10313)中添加55mL的胎牛血清、5mmol的HEPES、10000U的青霉素和10000U的链霉素。阴性对照组培养基每500mL的DMEM高糖培养基中添加5mmol的HEPES、10000U 的青霉素和10000U的链霉素。2、培养细胞的处理实验组将106_l(fC3A细胞接种至25cm2培养瓶中，首先采用5ml的阳性对照组培养基培养，两天换一次液。待C3A细胞生长稳定后，采取逐步降低血清的方法，以适应培养基的突然改变及无血清培养基的培养。首先，采用2. 5mL的阳性对照组培养基加入2. 5mL 的无血清培养基共同培养C3A细胞，即血清浓度为5%，两天换一次液。待C3A细胞传5代并稳定后，进一步降低血清的浓度，采用1. 25mL的阳性对照组培养基加入3. 75mL的无血清培养基共同培养，即血清浓度为2. 5%，两天换一次液。待C3A细胞传5代并稳定后，过渡到 100%的无血清培养基单独培养，不含任何血清成分，即采用5mL的无血清培养基长期传代培养。将稳定后的C3A细胞接种于6孔板和96孔板，继续培养8天，并进行细胞计数、细胞活力测定以及细胞功能的检测。阳性对照组将106_l(fC3A细胞接种至25cm2培养瓶中，采用5mL的阳性对照组培养基培养，两天换一次液。不进行其他处理。将稳定后的C3A细胞接种于6孔板和96孔板， 继续培养8天，并进行细胞计数、细胞活力测定以及细胞功能的检测。阴性对照组将106-l(fC3A细胞接种至25cm2培养瓶中，采用5ml的阳性对照组培养基培养，两天换一次液。待细胞生长稳定后，同样采取逐步降低血清的方法，以适应培养基的突然改变及血清的突然消失对细胞的影响。首先，采用2. 5mL的阳性对照组培养基加入2. 5mL的阴性对照组培养基共同培养C3A细胞，即血清浓度为5%，两天换一次液。待 C3A细胞传5代并稳定后，进一步降低血清的浓度，采用1. 25mL的阳性对照组培养基加入 3. 75mL的阴性对照组培养基共同培养，即血清浓度为2. 5%，两天换一次液。待C3A细胞传 5代并稳定后，过渡到100%的阴性对照组培养基单独培养，不含任何血清成分，即采用5mL 的阴性对照组培养基长期传代培养。稳定的细胞接种于6孔板和96孔板，继续培养8天， 并进行细胞计数、细胞活力测定以及细胞功能的检测。3、实验结果分析1)细胞形态学观察。在上述培养细胞的处理过程中，用倒置相差显微镜观察实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞的生长情况及形态变化，并通过显微摄像记录。请参阅图1A、1B和1C，其依序分别是实施例1中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞在倒置显微镜下(100倍)的生长形态图。图中，C3A细胞生长旺盛，胞浆透亮丰富，贴壁情况良好。2)台盘蓝计数法胰蛋白酶消化细胞后离心，制备单细胞悬液，并作适当稀释(IO6 细胞/ml)，取ImL细胞悬液移入EP中，加0. ImLO. 4%台盼蓝溶液，混勻，加入血细胞计数板，观察计数。如果细胞膜完整，细胞不为台盘蓝染色，则为正常细胞；如果细胞膜不完整、 破裂，台盘蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。该计数方法为(四大格细胞总数/4) X IO4X稀释倍数=细胞悬液细胞数/mL请参阅图2，其是实施例1中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞的生长曲线图。其中，实验组的C3A细胞生长良好，与阳性对照组中的C3A细胞密度无明显区别，高于阴性对照组中的C3A细胞。由此，说明实验组中的无血清培养基能够有效的代替血清的作用，促进细胞的增殖。3)采用MTT染色法检测细胞活力。收集对数期的C3A细胞，调整C3A细胞悬液浓度，每个孔加入IOOuL的检测液，使待测C3A细胞密度为1000-10000个/孔，并在5% CO2, 37°C的环境中孵育。然后每孔加入20uL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h。然后终止培养，吸去孔内培养液，再在每孔加入150uL的二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡 lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪0D490nm处测量各孔的吸光值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制曲线。请参阅图3，其是实施例1中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞的 MTT法测细胞活力曲线图。其中，实验组与阳性对照组中的C3A细胞活力并无明显差别，二者均高于阴性对照组。由此，说明该无血清培养基能有效代替血清的作用，能使细胞保持较高的活力。4)进行生物功能检测。将实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞分别接种于6孔板中，分别用3mL的各组的培养基各自培养，每天更换培养基同时收集留取上清样品，采用放射免疫分析法测定白蛋白(ALB)含量，同时采用全自动生化分析仪检测上清 ALT(丙氨酸转氨酶)及尿素含量。请参阅图4，其是实施例1中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞培养上清中ALT的浓度图。在为期8天的培养中，实验组培养上清中的ALT含量低于阳性对照组，且二者均明显低于阴性对照组，由此说明本发明的无血清培养基具有较好的C3A细胞保护作用，能减轻各种培养因素对肝细胞所致的损伤。 请参阅图5，其是实施例1中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞培养上清中尿素的浓度图。在为期8天的培养中，实验组在培养上清中尿素含量明显优于阳性对照组及阴性对照组，由此说明本发明的无血清培养基能提供给C3A细胞生长的良好环境，减少C3A细胞的损伤，增强C3A细胞的功能。请参阅图6，其是实施例1中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞培养上清中白蛋白的浓度图。在为期8天的培养中，除第三天至第五天中，阳性对照组中的白蛋白含量明显高于其余两组外，实验组培养上清中白蛋白含量与阳性对照组及阴性对照组相比无明显差异，由此说明本发明的无血清培养基能提供C3A细胞生长的良好环境，减少 C3A细胞的损伤，维持C3A细胞的功能。实施例2实施例2的阳性对照组培养基和阴性对照组培养基、细胞培养处理方法及实验结果分析方法均与实施例1相同，其区别仅在于无血清培养基中的添加组分在该无血清培养基中的浓度替换为
胰岛素0.5pg/mL
转铁蛋白lpg/mL
亚硒酸钠5昭/L
表皮生长因子(EGF)5ng/mL
肝细胞生长因子(HGF)5ng/mL
纤粘连蛋白O.lpg/mL
地塞米松0.5nmol/mL
胰高血糖素0.3pg/mL 请参阅图7，其是实施例2中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞的生长曲线图。其中，实验组的C3A细胞生长良好，与阳性对照组中的C3A细胞密度无明显区别，二者均高于阴性对照组中的C3A细胞。由此，说明实验组中的无血清培养基能够有效的代替血清的作用，促进细胞的增殖。请参阅图8，其是实施例2中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞的 MTT法测细胞活力曲线图。其中，实验组与阳性对照组中的C3A细胞活力并无明显差别，二者均高于阴性对照组。由此，说明该无血清培养基能有效代替血清的作用，能使细胞保持较高的活力。请参阅图9，其是实施例2中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞培养上清中ALT的浓度图。在为期8天的培养中，实验组培养上清中的ALT含量低于阳性对照组，且二者均明显低于阴性对照组，由此说明本发明的无血清培养基具有较好的C3A细胞保护作用，能减轻各种培养因素对肝细胞所致的损伤。请参阅图10，其是实施例2中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞培养上清中尿素的浓度图。在为期8天的培养中，实验组在培养上清中尿素含量明显优于阳性对照组及阴性对照组，由此说明本发明的无血清培养基能提供给C3A细胞生长的良好环境，减少C3A细胞的损伤，增强C3A细胞的功能。 请参阅图11，其是实施例2中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞培养上清中白蛋白的浓度图。在为期8天的培养中，除第三天至第五天中，阳性对照组中的白蛋白含量明显高于其余两组外，实验组培养上清中白蛋白含量与阳性对照组及阴性对照组相比无明显差异，由此说明本发明的无血清培养基能提供C3A细胞生长的良好环境，减少 C3A细胞的损伤，维持C3A细胞的功能。实施例3实施例3的阳性对照组培养基和阴性对照组培养基、细胞培养处理方法及实验结果分析方法均与实施例1相同，其区别仅在于无血清培养基中的添加组分在该无血清培养基中的浓度替换为
胰岛素lOpg/mL
转铁蛋白lOpg/mL
亚硒酸钠1 OpgZL
表皮生长因子(EGF)100 ng/mL
肝细胞生长因子(HGF)100 ng/mL
纤粘连蛋白lpg/mL
地塞米松10nmol/mL
胰高血糖素5pg/mL请参阅图12，其是实施例3中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞的生长曲线图。其中，实验组的C3A细胞生长良好，与阳性对照组中的C3A细胞密度无明显区别，二者均高于阴性对照组中的C3A细胞。由此，说明实验组中的无血清培养基能够有效的代替血清的作用，促进细胞的增殖。请参阅图13，其是实施例3中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞的 MTT法测细胞活力曲线图。其中，实验组与阳性对照组中的C3A细胞活力并无明显差别，二者均高于阴性对照组。由此，说明该无血清培养基能有效代替血清的作用，能使细胞保持较高的活力。请参阅图14，其是实施例3中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞培养上清中ALT的浓度图。在为期8天的培养中，实验组培养上清中的ALT含量低于阳性对照组，且二者均明显低于阴性对照组，由此说明本发明的无血清培养基具有较好的C3A细胞保护作用，能减轻各种培养因素对肝细胞所致的损伤。请参阅图15，其是实施例3中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞培养上清中尿素的浓度图。在为期8天的培养中，实验组在培养上清中尿素含量明显优于阳性对照组及阴性对照组，由此说明本发明的无血清培养基能提供给C3A细胞生长的良好环境，减少C3A细胞的损伤，增强C3A细胞的功能。请参阅图16，其是实施例3中的实验组、阳性对照组及阴性对照组中的C3A细胞培养上清中白蛋白的浓度图。在为期8天的培养中，除第三天至第五天中，阳性对照组中的白蛋白含量明显高于其余两组外，实验组培养上清中白蛋白含量与阳性对照组及阴性对照组相比无明显差异，由此说明本发明的无血清培养基能提供C3A细胞生长的良好环境，减少 C3A细胞的损伤，维持C3A细胞的功能。综上，本发明的无血清培养基能通各种机制提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，添加组份中的各组分能通过各种机制在肝细胞培养过程中有效地代替血清成分，细胞生长良好，细胞形态、密度、活力、功能与含血清培养基基本相同。虽然本发明已经参考具体的实施方式进行描述，但是本领域技术人员通过阅读上述描述后，将可以对本发明做出显而易见的修改和修饰，而不违背本发明的意图和本质。本发明有意将这些修改和修饰包括在权利要求的范围内。
权利要求
1.一种用于肝细胞培养的无血清培养基，其特征在于包含基础培养基和添加组分， 其中，所述添加组分包括胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、表皮生长因子、肝细胞生长因子、纤粘连蛋白、地塞米松和胰高血糖素。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于所述添加组分中的各组分在该无血清培养基中的浓度范围为胰岛素0. 1 10 μ g/mL、转铁蛋白0. 5 10 μ g/mL、亚硒酸钠5 10 μ g/L、表皮生长因子1 100ng/mL、肝细胞生长因子1 100ng/mL、纤粘连蛋白 0. 1 1 μ g/mL、地塞米松0. 1 lOnmol/mL和胰高血糖素0. 05 5 μ g/mL。
3.根据权利要求2所述的无血清培养基，其特征在于所述添加组分中的各组分在该无血清培养基中的浓度为胰岛素5 μ g/mL、转铁蛋白5 μ g/mL、亚硒酸钠10 μ g/L、表皮生长因子20ng/mL、肝细胞生长因子20ng/mL、纤粘连蛋白1 μ g/mL、地塞米松Inmol/mL和胰高血糖素4 μ g/mL。
4.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
5.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于所述培养基还含有HEPES。
6.根据权利要求5所述的无血清培养基，其特征在于所述HEPES的浓度为lOmmol/L。
7.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于所述培养基还含有抗生素。
8.根据权利要求7所述的无血清培养基，其特征在于所述的抗生素为青霉素和/或链毒素。
9.根据权利要求8所述的无血清培养基，其特征在于所述青霉素的量为10000U，和/ 或所述链霉素的量为10000U。
10.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于将地塞米松粉末溶解于无水乙醇中，然后加入无菌蒸馏水进行稀释，备用。
全文摘要
本发明公开了一种用于肝细胞培养的无血清培养基，其包含基础培养基和添加组分。其中，所述添加组分包括胰岛素0.1～10μg/mL、转铁蛋白0.5～10μg/mL、亚硒酸钠5～10μg/L、表皮生长因子1～100ng/mL、肝细胞生长因子1～100ng/mL、纤粘连蛋白0.1～1μg/mL、地塞米松0.1～10nmol/mL和胰高血糖素0.05～5μg/mL。本发明所提供的无血清培养基不含有胎牛血清及不含任何动物来源成份，能提供细胞生长增值所需的充足营养与良好环境，各添加组份能通过各种机制在肝细胞培养过程中有效地代替血清成分，细胞生长良好，细胞形态、密度、活力、功能与含血清培养基基本相同。
文档编号C12N5/071GK102311938SQ201110276700
公开日2012年1月11日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者张志 , 汪艳, 潘明新, 简国登, 赵逸超, 高毅 申请人:南方医科大学珠江医院