专利名称：利用同源重组构建多基因双元表达载体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别涉及利用同源重组构建多基因双元表达载体，还涉及利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法及其应用。
背景技术：
众多基因的功能明确后，需要将大量基因聚合导入到栽培作物，以对其综合农艺性状或多种性状实施改良。因此基因大规模的遗传转化或大片段DNA的遗传转化，是植物转基因研究与利用的重要发展方向之一。目前，实现多基因转化植物主要通过多基因聚合法，包括多个表达载体多次转化法、多个表达载体共转化法、多基因单载体的一次性转化法。多个表达载体多次转化法是将一次转化的植株作为受体接受二次转化，顺序多重转化将外源基因反复多次地导入同一生物中以达到目标基因的聚合；这种方法虽然不用考虑载体的容量，但是由于转化是进行多次独立转化，其工作量大、转基因植株的稳定性差、 获得含有多个靶基因的转基因纯合系比较困难。多个表达载体共转化法是将位于不同载体上的多个基因同时转化到同一植物中，是一步法多基因转化，这种方法降低了工作量，但是实现多基因同时转化的共转化效率低。多基因单载体的一次性转化法分为多个基因融合克隆到表达载体的一个表达盒上或将多个靶基因串联在一个载体上；这种方法避免了费时费力和共转化频率低，但是，由于在构建多基因单载体大都采用酶切连接的方法，加上的目的基因受酶切位点的限制，使研究者不能按需要连入多个基因，制约了多基因载体的构建。因此，急需一种多基因双元表达载体，能够同时转入多个基因而连入的多个基因不受酶切位点的限制，具有共转化效率高的优点。同源重组是低等生物中普遍存在的DNA 重组方式。它不依赖于限制性酶酶切位点，可使两个DNA分子之间的遗传信息精确和特异性交换。利用同源重组途径，是植物基因工程研究早期建立的构建共整合Ti载体的一种方法。但是利用多重同源重组途径、逐步将基因添加进双元表达载体的T-DNA中，构建多基因双元表达载体的方法，目前尚未见报道。
发明内容
有鉴于此，为了解决上述问题，本发明的目的之一在于提供利用同源重组构建多基因双元表达载体；本发明的目的之二在于提供利用同源重组构建多基因双元表达载体的构建方法，本发明的目的之三在于提供多基因双元表达载体在植物转基因中的应用，从而为实现多基因遗传转化提供有力工具，实现对植物多种性状实施改良。本发明目的之一在于提供利用同源重组构建多基因双元表达载体，所述多基因双元表达载体包括T-DNA区、农杆菌复制子pVSl-REP、大肠杆菌复制子Cb^V、原核抗性标记基因Kan，所述T-DNA区由左边界、真核抗性标记基因ζ^ //、原核抗性标记基因、至少两个靶基因和右边界顺序串联；所述多基因双元表达载体由基本双元载体和同源重组中间载体构成，所述基本双元载体包括T-DNA区、农杆菌复制子pVSl-REP、大肠杆菌复制子Cb^Y、原核抗性标记基因◎/ ，所述T-DNA区由左边界、真核抗性标记基因/7/7 //、至少一个靶基因和右边界顺序串联；所述同源重组中间载体包括T-DNA区、原核抗性标记基因和大肠杆菌复制子Cb^Y，所述T-DNA区包括左边界、原核抗性标记基因、至少一个靶基因；所述同源重组中间载体与所述基本双元载体的所述左边界、所述原核抗性标记基因& 和所述大肠杆菌复制子Cb^Y顺序串联构成同源重组片段；所述同源重组中间载体靠近所述大肠杆菌复制子Cb^Y的所述靶基因与所述基本双元载体所述T-DNA区靠近左边界一侧的所述靶基因有1. 3-2. 2 1Λ的序列相同构成同源重组片段，所述同源重组片段在根癌农杆菌中发生同源重组。进一步，所述多基因双元表达载体所述T-DNA区由左边界，真核抗性标记基因 /τ/ //，原核抗性标记基因 rXetk, PsSym35、PsSynmlO、PsENOD 12a MPsLectin 四个靶基因和右边界顺序串联；所述基本双元载体所述T-DNA区由左边界、真核抗性标记基因/^i//部分ffHPsSy膽10、PsLectin私PsENOD 12a三个靶基因和右边界顺序串联；所述同源重组中间载体包括基于Amp筛选同源重组中间载体或基于Tc筛选同源重组中间载体，所述基于Amp筛选同源重组中间载体的所述T-DNA区由所述左边界、原核抗性标记基因基因， PsSym35和PsSynmlO'靶基因顺序串联；所述基于Tc筛选同源重组中间载体的所述T-DNA 区的由所述左边界、真核抗性标记基因fl/7i//、原核抗性标记基因TetA基因、靶基因顺序串联。本发明目的之二在于提供利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法，包括以下步骤
a.基于Amp筛选同源重组中间载体
采用限制性内切酶切除所述基本双元载体农杆菌复制子PVSl-REP和右边界序列，在所述T-DNA区插入至少一个靶基因和基因，得基于Amp筛选同源重组中间载体；
b.基于Tc筛选同源重组中间载体
采用限制性内切酶切除所述基本双元载体农杆菌复制子pVSl-REP和右边界序列，在所述基本双元载体所述T-DNA区插入TetA基因和至少一个靶基因，得基于Tc筛选同源重组中间载体；
c.构建多基因双元表达载体
将基本双元载体转化所述根癌农杆菌，得含有基本双元载体的根癌农杆菌，将步骤a 所得的基于Amp筛选同源重组中间载体转化进所得含有基本双元载体的根癌农杆菌中，所述同源重组片段发生同源重组，得含重组DNA分子的根癌农杆菌；将步骤b所得的基于Tc 筛选同源重组中间载体转化所得含重组DNA分子的根癌农杆菌，所得重组DNA分子即为多基因双元表达载体。进一步，所述基本双元载体按如下步骤制得
(1)克隆豌豆品种食荚大菜豌AZecii/ 基因，连接PMD18-T载体，得PVCT1215载体； 克隆豌豆品种食荚大菜豌/ ^ ^^ 基因，连接PMD18-T载体，得pVCT12^载体；克隆豌豆品种食荚大菜豌基因，连接pEasy-T3载体，得pVCT1227载体；
(2)克隆pBIN19载体Pnos:基因，进行酶切，同时酶切pCAMBIA1302载体，将Pnos: :/ /7 //基因与pCAMBIA1302载体酶切片段连接，得pVCT2020载体；
(3)酶切所得PVCT1215载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收；同时酶切所得pVCT2020 载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收；将PVCT1215载体与pVCT2020载体的回收片段连接，得 PVCT2105 载体；
(4)酶切所得pVCT2105载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收；同时酶切所得pVCT12^5 载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，将PVCT2105载体与pVCT12^5载体的回收片段连接， 得PVCT2120载体；
(5)酶切所得pVCT1227载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得PVCT1227酶切片段； 同时酶切PVCT2120载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得PVCT2120酶切片段；将回收的 PVCT1227酶切片段和pVCT2120酶切片进行连接，得基本双元载体pVCT2121。进一步，步骤a所述基于Amp筛选同源重组中间载体按如下步骤制得
al酶切所得基本双元载体PVCT2121载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，补平后连接，得 PVCT1210 载体；
a2酶切步骤al所得pVCT1210载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得pVCT1210酶切片段， 所述PVCT1210酶切片段与所述基因连接，得pVCT1220载体；
a3克隆豌豆品种食荚大菜豌基因，连接pEasy-T3载体，得pVCT12^载体； 克隆豌豆品种食荚大菜豌基因，连接PMD18-T载体，得pVCT1230载体；
a4分别酶切所得pVCT12^载体与pVCT1230载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定回收，连接 PVCT1229载体与pVCT1230载体回收片段，得pVCT1231载体；酶切步骤a2所得pVCT1220载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得PVCT1220酶切片段，同时酶切所得PVCT1231载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得PVCT1231酶切片段，连接所得PVCT1220酶切片段和pVCT1231酶切片段，得基于Amp筛选同源重组中间载体，命名为pVCT2125。进一步，步骤b所述基于Tc筛选同源重组中间载体，包括以下步骤
bl将pCR2. 1-T0P0载体酶切，自环化连接，得pCR2. Im载体；以pCR2. Im载体为模板， 用如SEQ ID NO :14所示序列为上游引物，如SEQ ID NO :15所示序列为下游引物，进行PCR 扩增，扩增产物自环化连接，得PVCT1191载体；以pVCT1191载体为模板，如SEQ ID NO 16 所示序列为上游引物，如SEQ ID NO :17所示序列为下游引物，进行PCR扩增；以扩增产物为模板，如SEQ ID NO 16所示序列为上游引物，如SEQ ID NO 18所示序列为下游引物，进行 PCR扩增，得ηρ //基因，所得ηρ //基因与pMD 18-T载体连接，得pVCT 1202载体；
b2酶切pCAMBIA1302载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pCAMBIA1302载体酶切片段；同时酶切所得PVCT1202载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得/^i//基因；将 PCAMBIA1302载体酶切片段与职 //基因连接，得pVCT2072载体；酶切所得pVCT2072载体， 经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收；同时酶切所得PVCT1202载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，连接PVCT2072载体与pVCT1202载体回收片段，得pVCT2102载体；
b3酶切所得pVCT2102载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT2102酶切片段，将所得pVCT2102酶切片段与所述TetA基因连接，得pVCT2U9载体；
b4酶切pUC18载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pUC18载体酶切片段；同时酶切 PBI121载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pBI121载体酶切片段，将pUC18载体酶切片段与pBI 121载体酶切片段连接，得PVCT2006载体；然后酶切所得pVCT2006载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得PVCT2006载体酶切片段；同时酶切如SEQ ID NO 13所示双链DNA 片段，将PVCT2006载体酶切片段与所得酶切双链DNA片段连接，得pVCT2079载体；
b5酶切所得pVCT2079载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT2079酶切片段，同时酶切所述PVCT1230载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得PVCT1230酶切片段，连接所述pVCT2079酶切片段和所述pVCT1230酶切片段，得pVCT1302载体；
b6酶切步骤沾所得pVCT1302载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT1302酶切片段，同时酶切步骤b3所得pVCT2U9载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得PVCT2U9酶切片段，连接PVCT1302酶切片段和pVCT2U9酶切片段，得基于Tc筛选同源重组中间载体， 命名为pVCT2127。进一步，步骤c所述构建多基因双元表达载体，包括以下步骤
将所得基本双元载体PVCT2121转化所述根癌农杆菌，所述根癌农杆菌为EHA105，在含 Rif、Str和Kan的YEB平板上筛选，得含基本双元载体的根癌农杆菌EHA105/pVCT2121，将所得同源重组中间载体PVCT2125转化所得EHA105/pVCT2121，在含Amp、Kan、Rif和Mr的 YEB平板上筛选，得含有重组DNA分子的根癌农杆菌EHA105/pVCT2U6 ；将所得同源重组中间载体pVCT2127转化所得EHA105/pVCT2126，在含Tc、Kan、Rif和Mr的YEB平板上进行筛选，得多基因双元表达载体PVCT2U8。进一步，所述基因，制备步骤如下以大肠杆菌克隆载体PBR322为模板，上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO :19所示，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID N0:20所示，进行PCR扩增，PCR产物经限制性内切酶消化后Klenow Fragment酶补平，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收1337 bp片段，得基因。进一步，所述TetA基因，制备步骤如下以大肠杆菌克隆载体PBR322为模板，上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO :19所示，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO :20所示， 进行PCR扩增，PCR产物经限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收1470 bp片段， 得TetA基因片段。本发明目的之三在于提供多基因双元表达载体用于植物转基因，所述多基因双元表达载体转化大豆。本发明的优点在于本发明利用同源重组，通过交替使用氨苄青霉素和四环素交替筛选，在农杆菌中实现同源重组，顺序将多个基因串联组合，从而使T-DNA持续延长。由于大肠杆菌质粒复制子不能对大分子量载体DNA进行复制，因此，同源重组过程被安排在农杆菌中进行，并利用根癌农杆菌Ti质粒的复制子来确保大分子量质粒或大分子量 T-DNA的合成与构建。本发明公开的多基因双元表达载体用于植物遗传改造中，能够同时转入多个基因，具有共转化效率高的优点。本发明的其它优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其它优点可以通过下面的说明书，权利要求书，以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。农杆菌介导的植物遗传转化是一个借助农杆菌将外源基因导入植物基因组的自然过程，由Ti质粒上的T-DNA区进行精确切割、包装和转运至植物细胞内，最后T-DNA区随机整合进植物基因组内。双元表达载体一般由T-DNA区、农杆菌复制子、大肠杆菌复制子、原核抗性标记基因，其中T-DNA区有两个边界，位于T-DNA左侧边界为左边界、位于T-DNA 右侧边界为右边界，在左边界和右边界之间含有真核抗性标记基因和多个靶基因。原核抗性筛选基因、TfeM基因、Kan基因，其中基因编码的蛋白具有抗氨苄青霉素(Amp)的活性，TetA基因编码的蛋白质具有抗四环素(Tc)的活性，Kan基因编码的蛋白质具有抗卡那霉素活性(Kan)。真核抗性筛选中抗卡那霉素(Kan)活性的基因称为 nptll。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中
图1为本发明PVCT1215载体结构图； 图2为本发明pVCT1216载体结构图； 图3为本发明pVCT1227载体结构图； 图4为本发明pVCT1231载体构建流程图； 图5为本发明pVCT2020载体构建流程图； 图6为本发明pVCT2079载体构建流程图； 图7为本发明pVCT2102构建流程图； 图8为本发明pVCT2105载体结构图； 图9为本发明pVCT2120载体结构图； 图10为本发明PVCT2121载体结构图； 图11为本发明PVCT1210载体结构图； 图12为本发明PVCT1220载体结构图； 图13为本发明pVCT2125载体结构图； 图14为本发明pVCT2U9载体结构图； 图15为本发明pVCT1302载体结构图； 图16为本发明PVCT2127载体结构图17为本发明同源重组的T-DNA拼接及其多基因双元表达载体的构建流程图； 图18为本发明PVCT2U6载体结构图； 图19为本发明pVCT2U8载体结构图。图20为本发明pVCT2U8载体电泳图(M为DL2000 DNA Marker5A为第1代质粒， B为第10代质粒)。
具体实施例方式以下将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述；应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1基础载体的获得
优选实例中使用的材料.MMXPisum sativum L.)品种食荚大菜豌为材料；大肠杆菌(.Escherichia coli ) 菌株DH5 α，大肠杆菌XLl-Blue，根癌农杆菌U^ro力acieriws tumefaciens)菌株EHA105由本实验室保存；pBI121质粒和pCAMBIA1302质粒由本实验室保存；pCR2. 1-T0P0 载 #( Invitrogen, US), pEasy-T3 载 #(TransGen,德国)；DNA marker、载体pBR322购自上海生工生物工程技术服务有限公司；pUC18载体、pMD18_T载体、限制性内切酶、Klenow Fragment酶、T4-DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、Prin^tar HS DNA 聚合酶购自 TaKaRa 公司(Japan) ;Ε· Ζ. N. A. Plasmid Miniprep Kit 禾Π Ε. Ζ. N. Α. Gel Exteaction Kit 购自 Omega 公司(USA)；氨节青霉素(Ampicilin，Amp)、卡那霉素(Kanamycin，Kan)、四环素(Tetracycline，！"c)、利福平(Rifampicin，Rif)、链霉素 (Streptomycin, Str)、细菌培养基购自北京鼎国生物技术发展中心；其他化学试剂为国产分析纯；引物的合成及DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。以下以豌豆凝集素基因PsLec ii/ 、豌豆结瘤素基因PsENOD 12a、PsSym35和 PsSymlO为靶基因，利用同源重组构建多基因双元表达载体。(l)pVCT1215 载体构建
以豌豆品种食荚大菜豌基因组DNA为模板，根据已报道的豌豆凝集素基因，简、效、PsLectin基因(GenBank accession No. X66368)设计弓丨物，上游弓丨物序列为5，-gttaagttctgatgatgtggtgtg-3，(SEQ ID NO 1),下游引物序列为 5‘-ttgccaagaatgggttctattagg-3‘(SEQ ID NO :2)，使用 Prin^tar HS DNA聚合酶，进行PCR 扩增，扩增条件为95°C变性2分钟，1个循环；95°C变性10秒，55°C退火20秒，72°C延伸2 分20秒，30个循环；72°C延伸10分钟；得1946 bp饱PsLectin基因片段，所得AZecii/ 片段用Taq DNA聚合酶加A后，与pMDIS-T载体连接，得含豌豆凝集素基因的pMDIS-T载体， 命名为PVCT1215载体，如附图1所示。其中所基因片段包括启动子、编码区和终止子。(2) pVCT1226 载体构建
以豌豆品种食荚大菜豌基因组DNA为模板，根据已报道的豌豆早期结瘤素基因，简称/ ^ ^^ 基因(GenBank accession No. X81366)，设计特异引物，上游引物序列为 5，-caatattgggttatgggtggctgag-3，(SEQ ID NO :3)，下游引物序列为 5’-ggtactagaatgc tttagaaatggatg-3，(SEQ ID NO :4)，使用 Prin^tar HS DNA 聚合酶，进行 PCR 扩增，扩增条件为95°C变性2分钟，1个循环；95°C变性10秒，56°C退火20秒，72°C延伸1分30秒， 30个循环；72°C延伸10分钟；得1282 bp大小的、缺失终止子的/ ^ ^^ 基因片段，所得 PsENOD 12a片段，用Taq DNA聚合酶加A，然后与pMD18_T载体连接，转化大肠杆菌XLl-Blue 感受态细胞，提取质粒酶切鉴定，得含/ ^ ^^ 基因的载体，命名为pVCT12^载体，如附图2所示。其中所得/ ^ ^^ 基因片段包括启动子(Pro)和编码区(PsENODlh)，不含有终止子。(3) pVCT1227载体构建过程
以豌豆品种食荚大菜豌基因组DNA为模板，根据报道的豌豆结瘤素基因，简攝、PsSymlO基因(GenBank accession No. AJ575250),设计特异引物，上游引物序列为 5，-ggtcaagtgctagaaatcatcttgg-3，(SEQ ID NO 5),下游引物序列为 5，-gctgacttgcatcaacattttatggg-3，( SEQ ID NO :6)，使用 PrimStar HS DNA 聚合酶，进行PCR扩增，扩增条件为95°C变性2分钟，1个循环；95°C变性10秒，58°C退火20秒，72°C延伸3分30秒，30个循环；72°C延伸10分钟；得3320 bp大小的豌豆结瘤素基因片段，所得PsSjmJO片段用Taq DNA聚合酶加A后，与pEasy-T3载体连接，转化大肠杆菌 XLl-Blue感受态细胞，提取质粒酶切鉴定，場含PsSymlO基因的载体，命名为pVCT1227， 如附图3所示。其中所得基因片段包括启动子(Pro)、编码区(SymlO)和终止子 (Ter)0(4)pVCT1229
以豌豆品种食荚大菜豌基因组DNA为模板，根据报道的豌豆结瘤素基因上游片段，命名为基因(GenBank accession No. AJ493063)，设计特异引物，上游引物序列为 5，-catttcctcaagaccaactgtctcgc-3，( SEQ ID NO :7)，下游引物序列为 5' -ccatctcttcccaacaacaaaaccac -3' (SEQ ID NO :8),使用 PrimStar HS DNA 聚合酶， 进行PCR扩增，扩增条件为95°C变性2分钟，1个循环；95°C变性10秒，60°C退火20 秒，72°C延伸2分钟20秒，30个循环；72°C延伸10分钟。经琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增出2159 bp饱PsSyin35 up基因片段，所得基因片段用Taq DNA聚合酶加A，然后与pEasy-T3载体连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，提取质粒酶切鉴定，得含 PsSym35up片段的pEasy-T3，命名为pVCT12^载体，如附图4所示。軌PsSym35up片段包括启动子(Pro)和上游部分编码区序列(￡sSym35p\(5)pVCT1230
以豌豆品种食荚大菜豌基因组DNA为模板，根据报道的豌豆结瘤素基因下游片段，简称/ 基因(GenBank accession No. AJ493063)，设计特异引物，上游引物序列为 5，-ctctcaccttctaatattctctctc-3，( SEQ ID NO :9)，下游引物序列为 5‘-tatctaggaagatggactgctactg-3‘ (SEQ ID NO 10)，使用 I^rin^tar HS DNA聚合酶，进行 PCR扩增，扩增条件为95°C变性2分钟，1个循环；95°C变性10秒，56°C退火20秒，72°C 延伸3分20秒，30个循环；72 °C延伸10分钟。经琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增出3203 bp的 PsSym35Lp基因片段，W*PsSym35Lp基因片段用Taq DNA聚合酶加A后，与pMD18_T载体连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，提取质粒酶切鉴定，得含基因片段的 PMD18-T，命名为pVCT1230载体，如附图4所示。其中基因片段包括下游部分编码区序列，但没有终止子(Ter)。PsSym35up基因片段和基因片段构成基因的启动子和编码区。(6) pVCT1231载体构建过程
所得pVCT12^载体含有基因片段，所得pVCT1230载体含有基因片段，用限制性内切酶BstX I和Sal I分别酶切PVCT1229载体和pVCT1230，经琼脂糖凝胶电泳鉴定回收，分别回收pVCT12^载体2132bp的片段和pVCT1230载体5583bp的片段，按其摩尔比为3 :1，在T4 DNA连接酶作用下16°C过夜连接，然后将连接产物转入大肠杆菌DH5 α感受态细胞，在含有Amp (50 mg/L)的LB平板上筛选，提取质粒，经酶切验证，得 PVCT1231载体，如附图4所示。在载体构建过程中PsSym35Lp基因插入基因片段的下游，因此PVCT1231载体中PsSym35up片段和片段构成基因，含有启动子和编码区，但无终止子。(7) pVCT2020 载体构建
根据报道的pBmi9载体序列(GenBank accession U09365)，设计含启动子/iZ7O1S和卡那霉素基因/W//编码区(简称Pnos: /？辦//基因)的特异引物，上游引物序列为 5' -cggaattcagggagtcacgttatgac-3' ( SEQ ID NO :11)，下划线为 EcoR I 酶切位点，下游引物序列为 5，-cgctcgagtcccgctcagaagaac-3，(SEQ ID NO 12)，划线处为)(ho I 酶切位点，使用I^rin^tar HS DNA聚合酶，进行PCR扩增，PCR反应条件95°C变性2分钟，1个循环；95°C变性10秒，54°C退火20秒，72°C延伸1分10秒，30个循环；72°C延伸10分钟。 经琼脂糖凝胶电泳鉴定回收，回收片段经EcoR I和B10 I酶切后，回收1107 bp片段，得 Pnos: :/ /7 //酶切片段；用EcoR I和Xho I酶消化载体pCAMBIA1302，回收8425 bp片段，得 PCAMBIA1302酶切片段；连接I^nos \nptll酶切片段和pCAMBIA1302酶切片段，得pVCT2020 载体，如附图5所示。(8) pVCT2079 载体构建
用EcoRI/Hindlll同时双酶切pUC18载体和pBI121载体，回收pUC18载体2635 bp片段，得pUC18载体酶切片段，回收PBI121载体的含β -葡萄糖苷酸酶基因gus的表达盒， 得pBI121载体酶切片段，将pUC18载体酶切片段与pBI121载体酶切片段用T4 DNA连接酶连接，反应条件为16°C过夜，得pVCT2006载体。用Ecll36 11/Xba I酶切pVCT2006载体 (Ecll36 II与Me I为同位异裂酶，即识别序列相同)，弃1894 bp片段，电泳回收3773bp 片段，得PVCT2006载体酶切片段；人工合成如SEQ ID NO 13所示双链DNA片段，该DNA片段为138 bp，在3，端含有)(ba I酶切位点，)(ba I酶切人工合成的双链DNA片段，回收131 bp酶切片段，得含)(ba I粘性末端的双链DNA片段；将pVCT2006载体酶切片段与含)(ba I 粘性末端的双链DNA片段用T4 DNA连接酶连接，反应条件为16°C过夜，得pVCT2079载体， 构建过程如附图6所示。(9) pVCT2102 载体构建
将pCR2. 1-T0P0载体用EcoR I，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收3913 bp片段，将回收片段T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，Amp和Kan抗性筛选，提取质粒酶切鉴定，得PCR2. Im载体。根据pCR2. Im载体序列设计引物，上游引物为序列为pCR2. Im F 5，-tcatgaccaaaatccct-3，(SEQ ID NO 14),下游引物序列为 pCR2. Im R 5‘-ttcagaagaactcgtcaagaagg -3，(SEQ ID NO 15);以 pCR2. Im 载体为模板，用 Prin^tar HS DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR反应条件95°C变性2分钟，1个循环；95°C变性10秒， 50°C退火20秒，72°C延伸3分钟，30个循环；72°C延伸10分钟。经琼脂糖电泳鉴定，回收四42 bp目的片段，将回收片用T4 DNA连接酶连接，反应条件为16°C过夜，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，在含Kan的LB固体培养基上抗性筛选，提取质粒酶切验证，得 PVCT1191载体，pVCT1191载体上pCR2. Im载体的Amp抗性基因得到删除，并使/？辦//基因末端带上原核基因终止子，简称/ ^//基因，该基因能编码新霉素磷酸转移酶，使大肠杆菌具有Kan抗性。根据pVCT1191载体，设计引物，上游引物序列为pVCT1191 Fl 5' -atactcgagctactgggctatctgg-3' (SEQ ID NO : 16)，划线处为 Xho I 位点，下游引物序列为pVCT1191 Rl 5'-cattatacgaagttatcctgcaggcggccgcccagggccctggtagctcttgatccg gc-3，(SEQ ID NO 17)，用 Prin^tar HS DNA 聚合酶进行 PCR扩增，PCR 反应条件为95°C预变性2分钟，95 0C变性10秒，52 0C退火20秒，72 °C延伸1分钟20秒，3个循环，再经95 °C变性10秒，60°C退火20秒，720C延伸1分钟20秒，27个循环，最后72°C延伸10分钟；扩增出 1265 bp大小的职 //基因，将所得PCR扩增产物为模板，以SEQ ID Ν0:15所示序列为上游引物，下游引物序列为pVCT1191 R2 5'-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttatcc-3' (SEQ ID NO: 18)，进行PCR扩增，反应条件为:95°C预变性2分钟，95°C变性10秒，46°C退火20秒，72°C延伸1分钟20秒，3个循环，再经95°C变性10秒，60°C退火20秒，72°C延伸1分钟20秒，27个循环，最后72°C延伸10分钟；经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收1283 bp 片段，用Taq DNA聚合酶加“A”尾后，TA克隆进T载体pMD18_T中，得pVCT1202载体。用Bio I酶切pCAMBIA1302载体，弃1094 bp片段，回收9455 bp片段，得 PCAMBIA1302载体骨架；同时用Β ο I和Ml I酶切pVCT1202载体，弃沈93 bp片段，回收1284 bp片段，得/？辦//基因编码区；将pCAMBIA1302载体骨架与/？辦//基因编码区用 T4 DNA连接酶连接，得pVCT2072载体。所得pVCT2072载体相当于职 //基因编码区替换 PCAMBIA1302载体上潮霉素抗性标记基因，即构建含..nptll·. 表达盒pVCT2072 载体；所得PVCT2072载体经农杆菌介导转化烟草，得到具有卡那霉素抗性的植株，结果表明2x35S: \nptll·. :T35s基因表达正常。用PmaC I禾Π Xba I酶切载体pVCT2072，弃413 bp和1124 bp片段，电泳回收 8475bp片段；同时用Not I酶切所得pVCT1202载体，用Klenow Fragment酶补平后再用)(ba I酶切，弃1250 bp片段，回收2732 bp片段；将回收片段用T4 DNA连接酶连接，反应条件为16°C过夜，得pVCT2102载体，构建过程如附图7所示。本实施例以豌豆早期结瘤素基因PsSym35、PsSynmlO、PsENOD 12a和豌豆凝集素基因^Zaiiz7为例，构建含有靶基因的基本载体，还可以为其他靶基因，载体也可以为其他双元植物表达载体。实施例2 基本双元载体构建 (l)pVCT2105载体的构建
用EcoR I和Hind III酶切载体pVCT1215，琼脂糖凝胶电泳鉴定，弃沈35 bp片段，回收2007 bp片段；用相同的酶酶切pVCT2020载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定，弃51 bp片段，回收 9481 bp片段；将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，反应条件为16°C过夜，得PVCT2105 载体。如附图8所示，所得pVCT2105载体含有AZecii/ 靶基因。(2) pVCT2120 载体的构建
用PmaC I和Hind III酶切载体所得pVCT2105，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，弃413 bp和 1118 bp片段，回收9957 bp片段；用Xba I酶切pVCT1226，Klenow Fragment酶补平后，再用Hind III酶切割，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，弃沈84 bp片段，回收1297 bp片段；将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，反应条件为16°C过夜，得PVCT2120载体，如附图9所示。 所得pVCT2120载体含有Zj1SZecii/ 私PsEN0D12a两个靶基因，/ ^ ^^ 基因位于pVCT2105 载体的胭脂碱合成酶基因终止子Tnos之前，使不含终止子的/^JVflWA基因表达能够终止。(3) pVCT2121 载体的构建
用限制性内切酶Mil酶切所得PVCT1227载体，经Klenow Fragment酶补平，再用 NcoI酶切，弃^66bp片段，回收3395bp大片段，得pVCT1227酶切片段；同时用136 II(Ecl 136 II与Me I为同位异裂酶，即识别序列相同)和NcoI酶切pVCT2120载体，弃874bp 片段，回收10383bp片段，得pVCT2120酶切片段。将回收的pVCT1227酶切片段和pVCT2120 酶切片段在jM DNA连接酶作用下，16°C过夜连接，得基本双元载体PVCT2121，如附图10所
7J\ οpVCT2121为本实施例中的基本双元载体，pVCT2121载体包括T-DNA区、农杆菌复制子pVSl-REP、STA区、大肠杆菌复制子Cb^V、原核抗性标记基因◎/ ，其中T-DNA区由左边界、真核抗性标记基因npt II银分序V\\、PsSymlO、PsLectin和PsENOD 12a三个靶基因和右边界所组成；其中左边界、原核抗性标记基因Kan和大肠杆菌复制子Cb^Y构成同源重组片段，位于T-DNA区的靠左边界一侧的基因的部分序列，构成另一同源重组片段。基于Amp筛选同源重组中间载体构建 (l)pVCT1210载体的构建
用限制性内切酶AvrII /EheI双酶切所得基本双元载体pVCT2121，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，弃9008bp条带，回收大小为4684bp的片段，得pVCT2121酶切片段，pVCT2121酶切片段用Klenow Fragment酶补平，补平后在T4 DNA连接酶作用下16°C过夜连接，得自环化载体PVCT1210，如附图11所示；其中，由原基本双元载体PVCT2121保留下来的左边界、原核抗性标记基因Kan和大肠杆菌复制子Cb^V顺序串联位于T-DNA区的左边界外侧序列构成同源重组片段，基因的部分序列构成另一同源重组片段。⑵Amp基因或TetA基因片段获得
以大肠杆菌克隆载体PBR322为模板，采用I^rin^tar HS DNA聚合酶，基因或TfeM 基因(以下简称-.AmplTetA基因)特异引物，上游引物为p9 :5，-tttctcgagttggtagctcttgat cc-3，(SEQ ID No :19)，下游引物为 plO :5，-gactcgagcacgatcatgcgcac_3， (SEQ ID No: 20)，进行PCR扩增，扩增条件95°C预变性2分钟；95°C变性10秒，50°C退火15秒， 720C延伸3分钟，循环3次；95°C变性10秒，59°C退火15秒，72°C延伸3分，循环27次； 最后72°C延伸10分钟，PCR反应结束后，进行电泳检测，回收^18bp大小的条带，得 TetA基因片段。所得Amp/TetA基因片段用限制性内切酶BioI/EcoR I进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，分别回收大片段和小片段，其中小片段约1337bp，得基因片段；大片段约为 1470bp，得TfeM基因片段。(3) pVCT1220 载体的构建
用限制性内切酶AseI酶切所得PVCT1210载体，再用Klenow Fragment酶补平，补平后进行胶回收，得PVCT1210酶切补平片段。将所得基因片段，用Klenow Fragment酶补平，得Amp基因补平片段，将PVCT1210酶切补平片段与基因补平片段在T4 DNA连接酶作用下连接，16 °C过夜连接，得载体ρVCT1220，如附图12所示。(4)pVCT2125 的构建
用限制性内切酶》ιοΙ酶切所得pVCT1220质粒DNA，经Klenow Fragment酶补平，再用 NotI酶切，经琼脂糖凝胶电泳回收大片段，得pVCT1220片段；同时，用限制性内切酶Sma I/ NotI双酶切所得含有靶基因的载体pVCT1231，经琼脂糖凝胶电泳回收大片段，得 PVCT1231酶切片段。连接pVCT1220片段和pVCT1231酶切片段，在T4 DNA连接酶作用下 16 V过夜连接，得载体PVCT2125，如附图13所示。
pVCT2125载体为本发明实施例的基于Amp筛选同源重组中间载体，含有T-DNA区、 原核抗性标记基因Kan和大肠杆菌复制子Cb^V，其中T-DNA区由左边界、原核抗性标记基因加/7、/^5> ^靶基因和1757bp的/州基因部分片段(S卩/^5> 7 ’)从左至右顺序串联，但不含有基本双元载体所含有的农杆菌复制子pVSl-REP和右边界。PsSymlO，位于 T-DNA区的右侧，因此同源重组中间载体T-DNA区的靠右侧与基本双元载体T-DNA区靠近左边界一侧有/^5> 7 ’的1757bp的相同基因序列，构成同源重组片段。pVCT2125载体与 PVCT2121载体的左边界、所述原核抗性标记基因&和所述大肠杆菌复制子Cb^V顺序串联构成含有2338bp相同序列的片段，构成另一个同源重组片段。pVCT2125载体与pVCT2121 载体同时存在于根癌农杆菌中时，将通过两个同源重组片段介导而发生同源重组，形成含重组DNA分子的根癌农杆菌。本实施例以pVCT2121载体为基本双元载体，以AmP基因为原核抗性标记基因为例，基本双元载体还可以为其他双元载体，抗性基因也可以为其他基本双元载体上不含有的抗性基因，如氯霉素抗性基因。基于Tc筛选同源重组中间载体构建 (l)pVCT2129载体的构建
用限制性内切酶MlI/^boR I双酶切所得PVCT2102载体，经琼脂糖凝胶电泳回收 8503bp大小的片段，得pVCT2102酶切片段，将pVCT2102酶切片段与所得的TetA基因片段用T4 DNA连接酶连接，反应条件为16°C过夜，得PVCT2U9载体，如附图14所示。(2) pVCT1302 载体的构建
用限制性内切酶Hind III酶切所得pVCT2079载体，经Klenow Fragment酶补平，再用 NheI酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳回收^59bp的片段，得pVCT2079酶切片段；同时用限制性内切酶EcoR I酶切所得pVCT1230质粒DNA，经Klenow Fragment酶补平，再用限制性内切酶^CbaI酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳回收1333bp的片段，得PVCT1230酶切片段。将回收的pVCT2079酶切片段与pVCT1230酶切片段在T4 DNA连接酶作用下连接，16°C过夜连接， 得PVCT1302载体，如附图15所示。(3) pVCT2127 载体的构建
用限制性内切酶EcoR I酶切所得pVCT1302载体，经Klenow Fragment酶补平，再用 NdeI酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳回收1874bp的片段，得pVCT1302酶切片段；同时用限制性内切酶BstE II酶切所得pVCT2129载体，经Klenow Fragment酶补平，再用NdeI酶切， 经1%琼脂糖凝胶电泳回收^37bp的片段，得pVCT2U9酶切片段。将pVCT1302酶切片段和PVCT2U9酶切片段在T4 DNA连接酶作用下连接，16°C过夜连接，得载体pVCT2127，如附图16所示。载体pVCT2127为本发明本实施例的基于Tc筛选同源重组中间载体，含有T-DNA 区、原核抗性标记基因和大肠杆菌复制子ColEl，其中T-DNA区由左边界、真核标记基因 npt //、原核抗性标记基因TfeM、/^5> J5Z/7’从左至右顺序串联，但是不含有基本双元载体所含有的农杆菌复制子pVSI-REP和右边界，靶基因PsSym35Lp部分序列(简称，) 位于同源重组中间载体T-DNA区的右侧。T-DNA区的左边界、原核抗性标记基因和大肠杆菌复制子的2227bp序列构成同源重组片段，1324bp的靶基因/^5> J5Z/7’构成另一同源重组片段。
本实施例以TetA基因为原核抗性标记基因，作为同源重组筛选重组载体的标记基因，原核抗性标记基因还可以为重组子上没有的其他抗性筛选基因，如氯霉素抗性基因。实施例3同源重组多基因双元表达载体的构建
如附图17所示，将所得基本双元载体PVCT2121采用冻融法转化根癌农杆菌EHA105 感受态细胞，在含Rif (100mg/L), Str (100mg/L)和Kan (50mg/L)的YEB固体培养基上抗性筛选，获得含有基本双元载体PVCT2121的农杆菌EHA105，命名为EHA105/ pVCT2121。 将基于Amp筛选同源重组中间载体pVCT2125冻融法转化EHA105/ pVCT2121感受态细胞， 在含 Kan (50mg/L)、Amp (100mg/L)、Rif (100mg/L)*Mr (100mg/L)的 YEB 固体培养基上筛选，获得发生同源重组的含重组DNA分子pVCT2U6的农杆菌EHA105，命名为EHA105/ PVCT2U6，pVCT2U6如附图18所示。pVCT2125载体和pVCT2121载体上的两个同源重组片段在根癌农杆菌中发生同源重组。由于PVCT2125载体上不含有农杆菌复制子pVSl-REP，只有发生同源重组的重组子才能在含Kan (50mg/L)、Amp (100mg/L)、Rif (100mg/L)和Str (100mg/L)的YEB抗性培养基上生长。将EHA105/ pVCT2U6制备感受态细胞，采用冻融法将基于Tc筛选同源重组中间载体PVCT2127转入农杆菌感受态细胞中，转化后将菌液移到含Kan (50mg/L)、Tc (IOOmg/ L)、Rif (100mg/L)和Mr (100mg/L)的YEB抗性平板上筛选，获得发生二次同源重组的多基因双元表达载体PVCT2U8的农杆菌EHA105，命名为EHA105/ pVCT2128, pVCT2128如附图19所示。同源重组中间载体PVCT2127与pVCT2U6载体具有两段相同的基因片段构成同源重组片段，一段相同片段为由左边界、原核标记基因Kan和大肠杆菌复制子Cb^Y构成 2227bp的同源重组片段，另一段相同片段为/^5> J5Z/7’靶基因13Mbp构成的同源重组片段。同源重组片段在根癌农杆菌中发生同源重组，由于PVCT2127载体上不含有农杆菌复制子pVSl-REP，不能在根癌农杆菌中复制，因此不能在根癌农杆菌中遗传，只有同源重组形成多基因双元表达载体PVCT2U8后才能在含Kan (50mg/L)、Tc (100mg/L)、Rif (IOOmg/ L)和Mr (100mg/L)的YEB抗性培养基上生长。所得多基因双元表达载体pVCT2U8含有 T-DNA区、农杆菌复制子pVSl-REP、大肠杆菌复制子、原核抗性标记基因Kan，T-DNA区包括左边界、真核抗性标记基因职 #、原核抗性标记基因TetA以及豌豆凝集素基因AZecii/ 、 早期结瘤素基因PsSymlO、PsSym35和PsENOD12a四个靶基因。重复以上实验步骤，利用Amp和Tc交替筛选，能插入更多的靶基因，使T-DNA得到持续延伸，完成多基因聚合，构建含有更多基因的双元表达载体，插入基因的数量以根癌农杆菌复制子PVSl-REP的复制极限为度(pVSl-REP的复制极限为200 kb左右)。在最后一次同源重组时，不使用^^基因作为原核抗性标记基因，而使用四环素抗性基因Tfei儿且要加入/？辦IlJiptllipat等抗性基因作为真核标记基因，整合进植物后用于对转基因植株的筛选。将本发明构建的带有豌豆凝集素基因AZ^ii/ 和早期结瘤素基因队 PsSym35热PsENOD12a以及/ ^-/ ^//卡那霉素抗性基因和TfeM四环素抗性基因等多基因双元表达载体PVCT2U8，经农杆菌介导转化大豆，培育能同时被大豆根瘤菌和豌豆根瘤菌侵染形成根瘤的、固氮性能得到改善的转基因大豆新材料。本实施例同源重组以农杆菌EHA105转化大豆为例，也可以为农杆菌的其他株系，如LBA4404等，转化受体也可以根据研究选择不同植物作为受体，如烟草、拟南芥等。实施例4多基因双元表达载体的遗传稳定性
将 EHA105/ pVCT2128 接种于 5mL 含 Rif (100mg/L)、Str (100mg/L)禾口 kan (50mg/ L)、Tc (100mg/L)的YEB液体培养基中，28°C、225 rpm振荡培养过夜，培养后的菌液为第一代。取第一代的菌液1 μ L接种于5mL新鲜的与上述相同抗生素的YEB液体培养基中，进行第二代菌液的培养，培养条件同上。依次培养10代，分别用1. 5 mL Eppendorf管收集第1 代和第10代的菌体。对收集的菌提取质粒DNA，电泳检测所提取pVCT2U8质粒DNA，检测结果如附图20所示。结果表明第1代和第10代菌体提取的pVCT2U8质粒DNA，条带大小一致，说明PVCT2U8载体能在根癌农杆菌EHA105中稳定遗传。以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
权利要求
1.利用同源重组构建多基因双元表达载体，其特征在于所述多基因双元表达载体包括T-DNA区、农杆菌复制子pVSl-REP、大肠杆菌复制子Cb^Y、原核抗性标记基因Kan，所述T-DNA区由左边界、真核抗性标记基因/7/7 //、原核抗性标记基因、至少两个靶基因和右边界顺序串联；所述多基因双元表达载体由基本双元载体和同源重组中间载体构成，所述基本双元载体包括T-DNA区、农杆菌复制子pVSl-REP、大肠杆菌复制子Cb^V、原核抗性标记基因仏/7，所述T-DNA区由左边界、真核抗性标记基因/7/7 //、至少一个靶基因和右边界顺序串联；所述同源重组中间载体包括T-DNA区、原核抗性标记基因和大肠杆菌复制子Cb^Y，所述T-DNA区包括左边界、原核抗性标记基因、至少一个靶基因；所述同源重组中间载体与所述基本双元载体的所述左边界、所述原核抗性标记基因& 和所述大肠杆菌复制子Cb^Y顺序串联构成同源重组片段；所述同源重组中间载体靠近所述大肠杆菌复制子Cb^Y的所述靶基因与所述基本双元载体所述T-DNA区靠近左边界一侧的所述靶基因有 1. 3-2. 2 kb的序列相同构成同源重组片段，所述同源重组片段在根癌农杆菌中发生同源重组。
2.根据权利要求1所述利用同源重组构建多基因双元表达载体，其特征在于所述多基因双元表达载体所述T-DNA区由左边界，真核抗性标记基因/7/7 //，原核抗性标记基因 TetA ,PsSym35,PsSynmlO,PsLectin和PsENOD 12a四个靶基因和右边界顺序串联；所述基本双元载体所述T-DNA区由左边界、真核抗性标记基因职 //部分序列、PsLectin 私PsENOD12a三个靶基因和右边界顺序串联；所述同源重组中间载体包括基于Amp筛选同源重组中间载体或基于Tc筛选同源重组中间载体，所述基于Amp筛选同源重组中间载体的所述T-DNA区由所述左边界、原核抗性标记基因加/7 -,PsSyna^和PsSynmlO’靶基因顺序串联；所述基于Tc筛选同源重组中间载体的所述T-DNA区的由所述左边界、真核抗性标记基因职 //、原核抗性标记基因TetA基因、靶基因顺序串联。
3.权利要求1所述利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法，其特征在于，包括以下步骤a.基于Amp筛选同源重组中间载体采用限制性内切酶切除所述基本双元载体农杆菌复制子pVSl-REP和右边界序列，在所述T-DNA区插入基因和至少一个靶基因，得基于Amp筛选同源重组中间载体；b.基于Tc筛选同源重组中间载体采用限制性内切酶切除所述基本双元载体农杆菌复制子pVSl-REP和右边界序列，在所述基本双元载体所述T-DNA区插入TetA基因和至少一个靶基因，得基于Tc筛选同源重组中间载体；c.构建多基因双元表达载体将基本双元载体转化所述根癌农杆菌，得含有基本双元载体的根癌农杆菌，将步骤a 所得的基于Amp筛选同源重组中间载体转化进所得含有基本双元载体的根癌农杆菌中，所述同源重组片段发生同源重组，得含重组DNA分子的根癌农杆菌；将步骤b所得的基于Tc 筛选同源重组中间载体转化所得含重组DNA分子的根癌农杆菌，所得重组DNA分子即为多基因双元表达载体。
4.根据权利要求3所述利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法，其特征在于， 所述基本双元载体按如下步骤制得(1)克隆豌豆品种食荚大菜豌AZecii/ 基因，连接pMD18-T载体，得pVCT1215载体； 克隆豌豆品种食荚大菜豌/ ^ ^^ 基因，连接PMD18-T载体，得pVCT12^载体；克隆豌豆品种食荚大菜豌基因，连接pEasy-T3载体，得pVCT1227载体；(2)克隆pBIN19载体Pnos:基因，进行酶切，同时酶切pCAMBIA1302载体，将 Pnos: :/ /7 //基因与pCAMBIA1302载体酶切片段连接，得pVCT2020载体；(3)酶切步骤(1)所得pVCT1215载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收；同时酶切步骤(2) 所得pVCT2020载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收；将PVCT1215载体与pVCT2020载体的回收片段连接，得PVCT2105载体；(4)酶切步骤(3)所得pVCT2105载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收；同时酶切步骤 (1)所得pVCT12^载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，将PVCT2105载体与pVCT12^载体的回收片段连接，得PVCT2120载体；(5)酶切步骤(1)所得PVCT1227载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT1227酶切片段；同时酶切步骤(4)所得pVCT2120载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT2120 酶切片段；将回收的PVCT1227酶切片段和pVCT2120酶切片进行连接，得基本双元载体 PVCT2121。
5.根据权利要求3所述利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法，其特征在于， 步骤a所述基于Amp筛选同源重组中间载体按如下步骤制得al酶切所得基本双元载体PVCT2121载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，补平后连接，得 PVCT1210 载体；a2酶切步骤al所得pVCT1210载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得pVCT1210酶切片段，所述PVCT1210酶切片段与所述基因连接，得pVCT1220载体；a3克隆豌豆品种食荚大菜豌基因，连接pEasy-T3载体，得pVCT12^载体； 克隆豌豆品种食荚大菜豌基因，连接PMD18-T载体，得pVCT1230载体；a4分别酶切步骤a3所得pVCT12^载体与pVCT1230载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定回收，连接pVCT12^载体与pVCT1230载体回收片段，得pVCT1231载体；酶切步骤a2所得 PVCT1220载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得PVCT1220酶切片段，同时酶切所得pVCT1231 载体，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得PVCT1231酶切片段，连接所得PVCT1220酶切片段和 PVCT1231酶切片段，得基于Amp筛选同源重组中间载体，命名为pVCT2125。
6.根据权利要求3所述利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法，其特征在于 步骤b所述基于Tc筛选同源重组中间载体，包括以下步骤bl将pCR2. 1-T0P0载体酶切，自环化连接，得pCR2. Im载体；以pCR2. Im载体为模板， 用如SEQ ID NO :14所示序列为上游引物，如SEQ ID NO 15所示序列为下游引物，进行PCR 扩增，扩增产物自环化连接，得PVCT1191载体；以pVCT1191载体为模板，如SEQ ID NO 16 所示序列为上游引物，如SEQ ID NO :17所示序列为下游引物，进行PCR扩增；以扩增产物为模板，如SEQ ID NO :16所示序列为上游引物，如SEQ ID NO :18所示序列为下游引物，进行 PCR扩增，得ηρ //基因，所得ηρ //基因与pMD 18-T载体连接，得pVCT 1202载体；b2酶切pCAMBIA1302载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pCAMBIA1302载体酶切片段；同时酶切步骤bl所得pVCT1202载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得/^i//基因； 将pCAMBIA1302载体酶切片段与职 //基因连接，得pVCT2072载体；酶切所得pVCT2072载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收；同时酶切所得PVCT1202载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，连接PVCT2072载体与pVCT1202载体回收片段，得pVCT2102载体；b3酶切所得pVCT2102载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT2102酶切片段，将所得pVCT2102酶切片段与所述TetA基因连接，得pVCT2U9载体；b4酶切pUC18载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pUC18载体酶切片段；同时酶切 PBI121载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pBI121载体酶切片段，将pUC18载体酶切片段与pBI 121载体酶切片段连接，得PVCT2006载体；然后酶切所得pVCT2006载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得PVCT2006载体酶切片段；同时酶切如SEQ ID NO 13所示双链DNA 片段，将PVCT2006载体酶切片段与所得酶切双链DNA片段连接，得pVCT2079载体；b5酶切步骤b4所得pVCT2079载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT2079酶切片段，同时酶切步骤a3所得pVCT1230载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT1230酶切片段，连接所述PVCT2079酶切片段和所述PVCT1230酶切片段，得pVCT1302载体；b6酶切步骤沾所得pVCT1302载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得pVCT1302酶切片段，同时酶切步骤b3所得pVCT2U9载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，得PVCT2U9酶切片段，连接PVCT1302酶切片段和pVCT2U9酶切片段，得基于Tc筛选同源重组中间载体， 命名为pVCT2127。
7.根据权利要求3所述利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法，其特征在于， 步骤c所述构建多基因双元表达载体，包括以下步骤将所得基本双元载体PVCT2121转化所述根癌农杆菌，所述根癌农杆菌为EHA105，在含 Rif、Str和Kan的YEB平板上筛选，得含基本双元载体的根癌农杆菌EHA105/pVCT2121，将所得同源重组中间载体PVCT2125转化所得EHA105/pVCT2121，在含Amp、Kan、Rif和Mr的 YEB平板上筛选，得含有重组DNA分子的根癌农杆菌EHA105/pVCT2U6 ；将所得同源重组中间载体pVCT2127转化所得EHA105/pVCT2126，在含Tc、Kan、Rif和Mr的YEB平板上进行筛选，得多基因双元表达载体PVCT2U8。
8.根据权利要求3所述利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法，其特征在于， 所述基因，制备步骤如下以大肠杆菌克隆载体PBR322为模板，上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO 19所示，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO 20所示，进行PCR扩增，PCR 产物经限制性内切酶消化后Klenow Fragment酶补平，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收1337 bp 片段，得基因。
9.根据权利要求3所述利用同源重组构建多基因双元表达载体的方法，其特征在于， 所述TfeM基因，制备步骤如下以大肠杆菌克隆载体PBR322为模板，上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO :19所示，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO :20所示，进行PCR扩增， PCR产物经限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收1470 bp片段，得TetA基因片段。
10.权利要求1所述多基因双元表达载体用于植物转基因，其特征在于所述多基因双元表达载体转化大豆。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，特别涉及利用同源重组构建多基因双元表达载体，所述多基因双元表达载体通过多克隆酶切位点，将单个基因或多个基因连成多基因聚合体形成同源重组中间载体，然后通过同源重组将单个基因或多基因聚合体加进基本双元载体中，所述同源重组可以多次进行，使基本双元载体的T-DNA的长度逐步加大，构成含有多基因的双元表达载体；本发明还公开了多基因双元表达载体的构建方法以及在植物转基因中的应用，本发明公开的多基因双元表达载体用于植物遗传改造中，能够同时转入多个靶基因，具有共转化效率高的优点。
文档编号C12N15/66GK102329812SQ20111028113
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月21日 优先权日2011年9月21日
发明者万发香, 张兴国, 杜小兵, 苏承刚, 谢玉会, 钱春, 陈友龙 申请人:西南大学