专利名称：基因突变和hiv-1耐药突变位点检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，涉及PCR技术、反向杂交技术和单核苷酸延伸标记技术。
背景技术：
据中国卫生部统计结果，截至2010年，全国累计报告人获得性免疫缺陷病毒 (Human Immunodeficiency Virus, HIV)感染者禾口艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS)病人约75万例，全国每年有大量的艾滋病感染者接受免费高效联合抗逆转录病毒(HighlyActive Antiretroviral Therapy, HAART)治疗，HAART 治疗能够有效控制病毒复制，延长患者的生命，大大地降低HIV/AIDS相关疾病的发病率和病死率。但是HIV 耐药性的出现却极大地限制了抗病毒治疗的效果。选择一个能最大限度地抑制HIV-I复制的药物治疗方案已成为一个极具挑战性的任务。因此，了解HIV感染者病毒耐药变异情况， 有针对性的选择抗病毒药物组合，成为艾滋病治疗工作中的一个重要内容。HIV-I逆转录酶的不忠实性复制会造成错误碱基的掺入，同时逆转录酶不具备校正功能，所以在病毒复制过程中会产生大量变异。据文献报道，每天艾滋病人体内会产生大约IO7 IO8子代病毒，逆转录酶的错配几率约为3. 4X IO5/碱基。HIV基因全长约10kb， 因此每天会产生IO4 IO5个单点突变。在数量众多的突变中，对抗病毒药物具有抵抗作用的基因突变株在药物选择压力下逐渐成为优势病毒株，会导致病毒学治疗失败，进而发展成免疫学失败，最终导致临床失败。研究证明，根据耐药检测结果选择抗病毒治疗方案可有效地降低病毒载量，升高CD4细胞含量，从而极大地改善HIV-I感染者抗病毒治疗的效果。 1999年耐药性协作研究组(Resistance Collaborative Group,RCG)的一项用药方案与病毒耐药基因型表型之间关系的研究结果表明，有针对性的对基因型或表型预测失败者更改用药方案可以使治疗失败率降低30% 50%。因而在抗病毒治疗的过程中对每一个患者进行耐药突变检测是提高治疗效果、延长病人生命、降低发病率和病死率的重要手段。目前HIV耐药检测方法主要有3种基因型耐药检测(GART)、表型耐药检测 (PART)和虚拟耐药检测(virtual phenotype，vPT)。传统的基因型耐药检测以核酸序列测定为基础，首先通过RT-PCR扩增出HIV的蛋白酶和逆转录酶基因的核酸序列，然后与参比毒株的核酸序列比较了解耐药位点是否发生变异。以RT-PCR扩增产物测序为基础的检测方法准确性高、信息全面，是HIV耐药临床检测金标准。但是测序方法存在如下缺点检测灵敏度不高，一般要求检测样本病毒拷贝数> lOOOcp/ml ；分辨率低，不能检出相对含量小于20%的病毒突变株；不能直接提供耐药信息，且无法定量；由于耐药位点变异多且较为分散，需要同时进行多个测试反应。HIV耐药位点表型检测首先需要对HIV感染者进行病毒分离培养，然后再进行药物敏感实验。近年来出现了利用重组病毒进行HIV-I表型耐药检测。该方法主要是将HIV感染者体内的病毒蛋白酶和逆转录酶基因插入载体，同时与骨架质粒共转染细胞包装重组病毒，应用重组病毒进行耐药表型检测。表型检测具有如下优点可以对病毒耐药情况进行定量分析；对B亚型和非B亚型均可进行分析；可以检测病毒序列中所有突变的作用，结果易于解释。但是表型检测由于受到价格昂贵、周期长、生物安全级别要求高等缺点很难大范围推广使用。虚拟表型检测首先需要建立基因型和表型之间的对应的数据库，通过对比测序结果，在数据库找出与感染者体内病毒序列相同或相似的序列，即可以给出药物敏感的参考意见。虚拟表型分析的可靠性依赖于数据库资料的准确性，要求随时更新耐药位点与表型之间的对应关系。但是虚拟表型检测仍然需要进行序列测定，同样受到基因型检测适用范围的限制。许多研究表明，各种表型耐药检测和基因型耐药检测的结果具有较高的一致性，并提出用基因型代替表型耐药检测。无论是表型检测还是基因型检测目前只能在有条件的实验室中小范围使用，因此研发一种实验周期短，准确性好，灵敏度高，同时能够进行多位点检测，价格便宜，能够在基层医疗单位使用的耐药检测试剂在艾滋病防治工作中具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以同时检测多个基因突变的方法和一种HIV-I耐药突变位点基因检测试剂盒。此方法整合了基因扩增、反向杂交和单核苷酸延伸标记技术。本发明的第一方面提供一种可以同时检测多种基因突变的检测方法，该方法通过以下步骤实现1)按照突变位点的碱基将突变位点分为A/T/C/G四组；2)设计探针，探针序列3’末端与突变位点相邻但不包括突变位点，将探针按照检测位点的分组固定在杂交芯片的四个独立分区上；’3)多重PCR获得含有待检测基因突变位点的核酸片段；4)将反应3)获得的基因片段按照突变位点的分组分别与含有不同探针的芯片进行杂交；5)杂交结束后将含有标记物的四种核苷酸分别加入到芯片上，在DNA合成酶的作用下进行单核苷酸延伸；6)通过检测标记物判断待检测基因中是否含有突变位点。在一个实施方案中步骤3)中的扩增引物Tm值控制在M_56°C ；在另一个实施方案中步骤2)中的探针Tm值控制在42-45°C ；在另一个实施方案中步骤2、中的探针序列3’末端与突变位点相邻但不包括突变位点，杂交后探针可以作为延伸引物；在另一个实施方案中，待检测突变位点针对HIV耐药突变位点M184V、M41L、K70R、 T215Y、D67N、K103N、Y181C、K65R、I47A、L76V、V32I中的一个或多个(氨基酸位置编号根据 GenBank :K03455. 1)在另一个实施方案中常规克隆的方法制备以上耐药突变位点标准品质粒；本发明所列出的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向书写。本发明还涉及一种用于检测HIV耐药突变位点的寡核苷酸引物对和探针的组合物。本发明的另一方面是提供一种HIV耐药突变位点M184V、M41L、K70R、T215Y、D67N、 K103N、Y181C、K65R、I47A、L76V、V32I的一个或多个的检测试剂盒，包括扩增引物、杂交芯片、生物素标记的四种核苷酸、杂交体系和延伸体系。
在一个实施方案中，还包括聚合酶及其缓冲液。优选地，所述聚合酶为Taq酶。本发明的显著特点是高灵敏度和高分辨率，反向杂交结合标记延伸的方法可以检测出的突变基因；同时操作步骤相对简单，可以在一个工作日内完成。
图1是HIV耐药突变位点分布情况。黄色部分为延伸dATP区域；绿色部分为延伸 dCTP区域；蓝色部分延伸dGTP区域；红色部分为延伸dUTP区域，在检测过程中，四个区域分别加相应的底物，显色后通过显色点的有无判断是否存在某一种突变位点。图2为检测质粒样品的检测结果。如图所示，杂交膜上的特定位置与某一种突变相互对应，如图2中V32I所显示，在第一排第二列的显色点表明检测样品中含有V32I的突变，而没有其他突变体存在。
具体实施例方式下列实施例中的常规实验方法，参见Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版(北京科学出版社，2002)，仪器的使用参照仪器操作说明书。实施例1多重RT-PCR引物设计根据所选择的12种待检HIV耐药突变附近的基因序列，设计出特异的针对目标基因的扩增引物，扩增引物设计区域在中国主要流行HIV病毒株的相对保守位置。首先根据在HIV基因序列上的位置将待检测的耐药突变位点分为3组，然后分别对3组序列设计扩增引物，使扩增产物包含待检测的突变位点；如果引物序列对应基因序列存在较多基因多态性，则在相应的序列上设计定向简并，以便对中国主要流行株都能高效扩增。同时针对人 β actin基因设计一对扩增引物，在引物5’端标记生物素，作为检测方法的内参照。本发明设计的针对所述12个待检HIV耐药突变位点的扩增引物参见表1，探针序列参见表2。表1 :12个待检HIV耐药突变位点和参照基因的扩增引物。
权利要求
1.一种能够检测单核苷酸突变的方法，其特征包括1)通过PCR扩增含有单核苷酸突变位点的基因片段；2)杂交探针探针与扩增片段互补，探针3’端最后一个碱基位于突变位点的前一个碱基，所有探针退火温度控制在42至45摄氏度；3)杂交探针固定在杂交膜的特定位置；4)杂交探针能够作为引物在DNA聚合酶的作用下延伸；5)探针延伸到碱基即为检测的突变位点；6)杂交膜分为4个独立的反应区间，每个反应区间分别加入不同的标记的dNTP或 ddNTP ；7)延伸反应在杂交膜上进行；8)用四种不同标记物分别标记dATP、dCTP、dGTP、dUTP时，延伸反应也可以在同一个杂交膜上进行；9)杂交的固相载体可以是尼龙膜、硝酸纤维素膜等膜，也可以是玻璃芯片或其他高聚物；10)通过检测标记物判断样品中是否含有特定的单核苷酸突变。
2.一种能够检测HIV耐药突变位点的RT-PCR方法，其特征包括1)通过文献检索确定HIV-I耐药主要突变位点为M184V、M41L、K70R、T215Y、D67N、 K103N、Y181C、K65R、I47A、L76V、V32I 其中之一或多个；2)用序列分析软件分析序列并设计特异性扩增引物；3)设计捕获探针，探针与扩增片段互补，探针3’端最后一个碱基位于突变位点的前一个碱基，所有探针退火温度控制在44至46摄氏度；4)使用常规克隆的方法制备耐药突变位点标准品质粒；5)摸索探针点样浓度对检测灵敏度的影响；6)优化RT-PCR体系；7)建立延伸反应体系；8)对建立的方法进行灵敏度和特异性考核；9)临床考核并与其他方法进行对比。
3.根据权利要求2所述的用于检测HIV耐药突变位点的RT-PCR方法，其特征在于所述的特异性扩增引物如SEQ ID NO 1-13所示。
4.根据权利要求2所述的用于检测HIV耐药突变位点的RT-PCR方法，其特征在于所述的捕获探针如SEQ ID NO 14-25所示。
5.用于延伸反应的单核苷酸用任意一种生物素或荧光素标记，可选自FAM、VIC,HEX、 JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX 或 CY5。
6.一种用于检测HIV耐药突变位点的寡核苷酸引物对和探针的组合物。
7.一种包括权利要求5所述组合物的试剂盒。
8.权利要求6的试剂盒在检测HIV耐药突变位点的用途。
全文摘要
本发明涉及一种HIV-1耐药突变位点基因检测方法、试剂盒和应用，公开了用于基因突变特别是HIV-1耐药突变位点基因检测的核苷酸引物、探针序列及方法，以及该方法在临床上检测HIV-1耐药突变位点中的应用。本发明的方法具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的特点，适于HIV-1耐药突变位点的快速检测。
文档编号C12Q1/70GK102312004SQ20111028559
公开日2012年1月11日 申请日期2011年9月23日 优先权日2011年9月23日
发明者张晓光, 曾毅, 马晶 申请人:张晓光, 曾毅