专利名称：一种防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株cs23及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物领域，涉及一种防治日光大棚黄瓜霜霉病的生防菌株CS23及其应用。
背景技术：
黄瓜霜霉病，俗称“跑马干”，是古巴假霜霉菌(Psedoperonspora cubensis (Berkis Curt) Rostov)引起的一种真菌病害，世界各地普遍发生。该病原物为专性寄生菌，对寄主植物的选择专化性很强，其孢子囊可随风雨、黄瓜甲虫、农用器具等传播， 是一种重要的气传病害。随着我国日光大棚面积急剧增加，其病菌一年四季可以侵染黄瓜；发病严重时，全叶呈黄褐色干枯，最后导致植株早死，缩短收瓜期，严重影响黄瓜产量，损失可达 20 %-60%,此病害是日光大棚黄瓜产量的主要制约因素之一。化学农药的反复使用极易导致抗药性的产生。如1979年首次报道黄瓜霜霉菌对甲霜灵存在抗性，随后有关其对乙磷铝抗性的报道也出现。目前农民主要依照经验来喷施化学药剂来防治这种病害，一周喷施一次化学药剂，交替选择不同种类药剂。这样虽然可以略微减轻抗药性，但是单剂喷施的化学农药用量依然成递增趋势。同时，消费者逐渐意识到化学农药残留问题对人体健康的影响，各界转而开始使用生物农药，如克菌康、武夷菌素、 绿盾丰、双抗等，活体的生防菌剂主要有芽孢杆菌和假单胞类，但大多处于实验室研究开发阶段。且因霜霉病是活体寄生菌，大多完成简单的室内测定试验，在我国主要黄瓜栽培区进行日光温室或者露天试验药效广谱性测试的生防研究微乎其微。综上所述，开发新的、更为高效和安全的微生物杀菌剂控制黄瓜霜霉病的发生是提高社会生产总量的需要，同时更是农业安全及可持续发展的需要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中没有对黄瓜霜霉病有较高防效的生防制剂的现状，提供一种防治黄瓜霜霉病的单一生防菌菌株及其菌剂，该菌剂对其防效可达到60%以上。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种短小芽孢杆菌CS23 (Bacillus pumilus)，于2011年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC N0. 4735。所述的保藏号为CGMCC N0. 4735的短小芽孢杆菌CS23在防治黄瓜霜霉病中的应用。优选所述的保藏号为CGMCC N0. 4735的短小芽孢杆菌CS23在防治日光大棚黄瓜
霜霉病中的应用。所述的保藏号为CGMCC N0. 4735的短小芽孢杆菌CS23制备的生防菌剂。其中，优选该生防菌剂中保藏号为CGMCC N0. 4735的短小芽孢杆菌CS23活菌总浓度为 1 X IO9-I X 10nCFU/ml，进一步优选 8. 5 X 109_6· 5 X 1010CFU/ml。一种制备所述的生防菌剂的方法，将保藏号为CGMCC NO. 4735的短小芽孢杆菌 CS23的种子菌液以1 500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，32°C、180rpm培养 44 48h，然后离心，取沉淀即得所述的生防菌剂。所述的生防菌剂中活菌总浓度为IXIO9-IXIOiiCFUAiI,优选 8. 5Χ109-6· 5X10lclCFU/ml。所述的离心条件为4000rpm离心15min。所述的保藏号为CGMCC NO. 4735的短小芽孢杆菌CS23的种子菌液制备方法为将保藏号为CGMCC NO. 4735的短小芽孢杆菌CS23菌株接种到LB培养液中32°C培养180rpm 振荡培养至600nm处的OD值为0. 8时结束培养。所述的生防菌剂稀释100-1000倍后在日光温室大棚黄瓜移栽后4叶期开始进行喷雾处理或者喷雾/灌根处理，在天气因子适合黄瓜霜霉病流行前期，7d/10d—个间隔周期使用一次，第七天统计发现在淮安丁集实验基地的黄瓜，喷雾处理和喷灌处理对黄瓜霜霉病的防达分别为65. 46%和60. 06%。本发明的有益效果是本发明是专门针对黄瓜霜霉病开发的生防制剂。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于日光大棚蔬菜的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且减少化学药剂的残留，有利于蔬菜的出口。温室实验表明该短小芽孢杆菌CS23(CGMCC NO. 4735)能显著降低黄瓜霜霉病的发生。利用该菌制备的生防菌剂稀释100倍在移栽时灌根/喷雾处理，在温室条件下对于黄瓜霜霉病生防效果可以达65. 23%以上。生物样品保藏信息一种短小芽孢杆菌CS23 (Bacillus pumilus)，于2011年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO. 4735。
具体实施例方式实施例1菌株来源CS23由江苏省扬州市黄瓜根围土壤中分离得到。菌株分离方法平板稀释法(中国科学院南京土壤所微生物室.土壤微生物研究法[M].北京科学出版杜，1985.)菌株筛选依据水解五种酶活性(蛋白酶、几丁质酶、纤维素酶、嗜铁素、 IAA 测定 Yang J. -H.，Liu H. X.，Zhu G. -M.，Xu L. -P.，Pan Y. -L.，and Guo J. -H.氺· 2008. Diversity analysis of antagonists from rice associated bacteria and their application in biocontrol of rice diseases. Journal of Applied Microbiology. 104(1) :91 104.)和对疫霉菌颉颃作用(对峙培养法，林福呈，李德堡.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对植物病原真菌的溶菌作用[J].植物病理学报，2003， 33 (2) 174 177.)，通过细菌的赋值评估(Faltin等，2004)，最终选择CS23作为有效细菌成分。菌株鉴定方法鉴定方法为16S r DNA基因片段序列测序。鉴定结果见表1 表1 测序比对结果
菌株最相似菌株相似度侈)CS23Bacillus pumilus99CS23形态学特征短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CS23为芽孢杆菌属，菌体细杆状，0. 6 0. 7ymX2. 0 3. 0 μ m，革兰氏阳性。B. pumilus存在半透明型和不透明型两种不同的菌落形态，对两种菌落分别进行传代，半透明菌落能产生半透明和不透明型菌落， 且基本各占一半。而不透明菌落在传代过程中只产生少许的半透明菌落，且传至第4代时半透明型菌落消失。实施例2CS23生防菌剂的制备将短小芽孢杆菌CS23 (CGMCC NO. 4735)菌株接种到LB培养液中32°C培养180rpm 振荡培养I^i后，每隔在超净工作台中取样测600nm处的OD值，当OD值为0. 8时结束培养作为种子菌液。把种子菌液以1 500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，32°C、 ISOrpm培养48h，然后4000rpm离心15min，取沉淀即得所述的CS23生防菌剂。所得生防菌剂中活菌总浓度为8. 5X 109CFU/ml。实施例3实验室温室试验本实验黄瓜品种采用“津优30”。待长出8片真叶时开始喷施处理药剂，设3个处理组，处理药剂分别为A 用清水40倍稀释的实施例2制备的CS23生防菌剂；B :20%霜霉威水剂；C:清水对照。每处理设4个重复，每个重复M棵苗。喷施处理药剂后5d接种霜霉病菌孢子囊，浓度为IO5个孢子囊/ml，接种后8d时对照组发病。霜霉病病原菌 Pseudoperonospora cubensis (Berkely et Curtis) Rosto wzew, 公知公用，见参照文献“汤钿.葡萄霜霉病离体接种方法的研究[J]微生物学通报，1994， (06).，，。病菌孢子囊悬浮液制备方法(参考文献杜兴兰.葡萄霜霉病和白粉病生物防治的研究[D]河北农业大学，2008)傍晚采集发病严重的新鲜黄瓜霜霉病病叶(近几天未施过农药)，用冰壶带回实验室，冲去叶面上的杂物和原有的孢子囊，用浸水的脱脂棉包住叶柄，置于18°C培养箱中黑暗保湿培养，24h后待长出新鲜孢子囊。用无菌水刷取新长出的孢子囊，双层纱布过滤，12000rpm 15min离心，弃去上清液，用灭菌水稀释至IO5个孢子囊/ ml，在18°C培养箱中黑暗培养2-3h，待有大量游动孢子囊出现时使用。调查病害严重度并计算防效，生防效果为65. 23%，如表2。表2 :CS23菌剂对黄瓜霜霉病生防效果
权利要求
1.一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CS23，于2011年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO. 4735。
2.权利要求1所述的保藏号为CGMCCNO. 4735的短小芽孢杆菌CS23在防治黄瓜霜霉病中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的保藏号为CGMCCNO. 4735的短小芽孢杆菌CS23在防治温室大棚黄瓜霜霉病中的应用。
4.用权利要求1所述的保藏号为CGMCCNO. 4735的短小芽孢杆菌CS23制备的生防菌剂。
5.根据权利要求4所述的生防菌剂，其特征在于该生防菌剂中保藏号为CGMCC NO. 4735的短小芽孢杆菌CS23活菌总浓度为1 X IO9-I X 10nCFU/mL·
6.根据权利要求5所述的生防菌剂，其特征在于该生防菌剂中保藏号为CGMCC NO. 4735的短小芽孢杆菌CS23活菌总浓度为8. 5X109-6. 5 X 10lclCFU/ml。
7.一种制备权利要求4所述的生防菌剂的方法，其特征在于将保藏号为CGMCC NO. 4735的短小芽孢杆菌CS23的种子菌液以1 500体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，32°C、ISOrpm培养44 48h，然后离心，取沉淀即得所述的生防菌剂。
8.根据权利要求7所述的制备权利要求4所述的生防菌剂的方法，其特征在于所述的生防菌剂中活菌总浓度为 IX IO9-I X IoiiCFUAiI,优选 8. 5X109_6. 5 X 1010CFU/ml。
9.根据权利要求7所述的制备权利要求4所述的生防菌剂的方法，其特征在于所述的离心条件为4000rpm离心15min。
10.根据权利要求7所述的制备权利要求4所述的生防菌剂的方法，其特征在于所述的保藏号为CGMCC N0. 4735的短小芽孢杆菌CS23的种子菌液的制备方法为将保藏号为 CGMCC N0. 4735的短小芽孢杆菌CS23菌株接种到LB培养液中32°C培养180rpm振荡培养至600nm处的OD值为0. 8时结束培养。
全文摘要
本发明属于微生物领域，涉及一种防治温室大棚黄瓜霜霉病的生防菌株CS23及其应用。一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus FJ768456.1)CS23，于2011年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.4735。用保藏号为CGMCC NO.4735的短小芽孢杆菌CS23制备的生防菌剂，其中短小芽孢杆菌CS23活菌总浓度为1×109-1×1011CFU/ml。该生防菌剂稀释100倍后在黄瓜移栽后4叶期开始进行喷雾处理或者喷雾/灌根处理，对黄瓜霜霉病的防效可分别达到为66.19％和60.35％。
文档编号C12R1/07GK102321559SQ201110288018
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月26日 优先权日2011年9月26日
发明者刘红霞, 王云鹏, 郑丽, 郭坚华 申请人:南京农业大学