神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法

专利名称：神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法
技术领域：
本发明涉及利用特定微生物，以食品加工业等的副产物豆渣作为培养基的主原料，制造能够促进皮肤产生神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的方法。
背景技术：
神经鞘脂类之一的神经酰胺(Ceramide)存在于皮肤角质层中，占角质层中细胞间脂质的50%左右。神经鞘脂类(Sphingolipid)是具有鞘氨醇骨架的复合脂质的总称。葡萄糖神经酰胺(Glucosylceramide)是在神经酰胺上结合了葡萄糖而成的一种神经鞘脂类。由表皮细胞合成得到的神经酰胺暂时以葡萄糖神经酰胺或者神经鞘磷脂(Sphingomyelin)的形式被储存起来；之后被排出至细胞外，在葡糖脑苷酯酶 (Glucocerebrosidase)和神经磷脂酶(Sphingomyelinase)的作用下,再次成为神经酰胺， 从而发挥作为细胞间脂质的功能。
一直以来，已知神经酰胺、葡萄糖神经酰胺、半乳糖神经酰胺等神经鞘脂类具有促进角质层的保持水分能力、改善皮肤粗糙等效果(专利文献I 2)。虽然皮肤具有产生神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的能力，但是这种能力并不充分，因而人们也 尝试了从外部补充神经酰胺的方法。但是该方法的长期效果得不到认可，且存在稳定性低等问题。例如，报道了利用热带假丝酵母(Candida tropicalis) JPCCY0004株(NITE P-570)来制造葡萄糖神经酰胺的方法(专利文献3)。但是，该方法并不是关于神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的方法，而只不过是将培养后的菌体中大量存在的葡萄糖神经酰胺直接提取的方法；而且，通过该方法合成得到的葡萄糖神经酰胺的神经酰胺骨架与人体中存在的神经酰胺类的神经酰胺骨架不同，其在两处具有碳碳双键且具有支链。因而，将这种葡萄糖神经酰胺涂布在人体皮肤上的话，有可能不能与人体皮肤相适应而产生使用安全性方面的问题。
而另一方面，如果能够增强或促进皮肤本身的神经酰胺或葡萄糖神经酰胺的产生能力，则无需从外部补充神经酰胺或葡萄糖神经酰胺，而能够通过促进皮肤自身产生神经酰胺或葡萄糖神经酰胺来提高皮肤的屏障功能和保湿功能。这样，由于是由皮肤自身产生神经酰胺或葡萄糖神经酰胺，因而其不存在与皮肤的适应性不好等安全性方面的问题。
因此，近年来，关于在皮肤角质层中以促进表皮神经酰胺产生为目的的物质的生产研究相当热门。作为促进神经酰胺产生的物质，已报道的有以灵芝、蜂花粉(Bee Pollen)、川芎等的提取物为有效成分的神经酰胺产生促进剂(专利文献4 6)。然而，由于这些神经酰胺产生促进剂全都是从植物原料提取得到，该提取操作耗费时间长，且由于天然资源的利用可能性有限等原因，其制造成本高。
另外，也报道了以含有烟酸和/或烟酰胺的乳酸菌培养物或者酵母菌培养物为有效成分的神经酰胺合成促进剂(专利文献7)。然而，从专利文献7的实施例可以看出，不含有烟酸和/或烟酰胺的乳酸菌培养物或者酵母菌培养物(比较例I 4)的神经酰胺产生量较之对照组并无明显变化，因而该神经酰胺合成促进剂实质上含有烟酸和/或烟酰胺作为有效成分，其神经酰胺合成促进效果还不够充分，尚有改善的余地。并且，由于使用烟酸或烟酰胺，因而其制造成本较高。
另外，已知布勒掷孢酵母属(Bullera)的微生物·一般用于食品发酵，如香肠发酵。
但是，目前还没有利用布勒掷孢酵母属(Bullera)的微生物来制造神经酰胺和/ 或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的报道。
专利文献1:日本特开昭61-260008号公报
专利文献2 :日本特开昭61-271205号公报
专利文献3 :日本特开2005-194240号公报
专利文献4 :日本特开2010-70499号公报
专利文献5 :日本特开2010-150237号公报
专利文献6 :日本特开平9-194383号公报
专利文献7 :日本特开2010-22217号公报发明内容
针对上述现有技术中存在的技术问题，本发明人进行了悉心研究，结果发现在含有豆渣和糖类的培养基中培养布勒掷孢酵母属(Bullera)的微生物，特别是培养铁杉布勒掷孢酵母(Bullera tsugae)，能够低成本且高效地获得神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂，从而完成本发明。
本发明涉及，提供一种神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法， 其中，在含有豆渣和糖类的培养基中培养布勒掷孢酵母属(Bullera)的微生物，从其上清液中获得神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
本发明还涉及，提供豆渣的布勒掷孢酵母属(Bullera)的发酵提取物用于促进神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺的产生的非治疗目的的用途。
本发明还涉及，提供豆渣的布勒掷孢酵母属(Bullera)的发酵提取物作为神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的非治疗目的的用途。
本发明还涉及，提供豆渣的布勒掷孢酵母属(Bullera)的发酵提取物在制造神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂中的用途。
发明效果
根据本发明的制造方法，能够利用特定微生物，以食品加工业等的副产物豆渣作为培养基的主原料，低成本且高效地获得神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂，该促进剂能够有效提高皮肤所具有的产生神经酰胺/葡萄糖神经酰胺的能力，从而有效提高皮肤的保湿能力。
具体实施方式
(可以用于神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂制造的微生物)
作为在本发明中使用的布勒掷孢酵母属(Bullera)的微生物，可以列举出从食品领域使用的铁杉布勒掷孢酵母(Bullera tsugae)、多形布勒掷孢酵母(Bullera variabilis)、白布勒弹孢酵母(Bullera albus)等中选出的至少I种微生物；还包括根据通常方法得到的这些微生物的变异株。这些微生物如下所述发挥作用，通过在含有豆渣和糖类的培养基中培养，从而从其上清液中可以得到提高表皮细胞的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生能力的物质。其中，从所获得的产品具有更高的神经酰胺产生促进效果和葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点出发，优选铁杉布勒掷孢酵母(Bullera tsugae)(同物异名/曾用名铁布衫孢霉(Sporobolomyces tsugae))。
本发明所涉及的布勒掷孢酵母属(Bullera)的微生物都可以从中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)、江南大学工业微生物资源和信息中心(CICM)等商业渠道购买得到。
(神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法)
本发明的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法通过在含有豆渣和糖类的培养基中，培养上述微生物，并从其上清液中获得神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。该方法的具体步骤如下所示。
<培养基>
在本发明中，优选在液体培养基中培养上述微生物中的I种或2种以上。
在本发明中，液体培养基的主要成分是豆渣和糖类。也可以适当添加蛋白胨、酵母粉。
由于豆渣和糖类都是容易获得的物质，因而，本发明的培养基具有成本低的优点。
其中，豆渣是指，将大豆浸泡在水中使其充分吸收水分后，再经粉碎、过滤除去水而得到的物质；如上所述 ，尤其可以使用食品产业中压榨豆浆后剩下的豆渣。
作为糖类，可以单独使用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等中的任意一种，或者混合使用。从提高发酵生产性和利用性的观点出发，其中优选葡萄糖。
在本发明中，为了提高神经酰胺产生促进效果和/或葡萄糖神经酰胺产生促进效果，本发明的培养基优选由豆渣、葡萄糖和水构成，进一步优选培养基中的豆渣的含量为 5 20w/v%、更优选为8 12w/v%，葡萄糖的含量为O. 2 2w/v%、更优选为O. 8 1. 2w/。
下面，将上述这种用于制造神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的培养基称为“神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂制造培养基”。
<培养条件>
将上述微生物的菌体直接接种到神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂制造培养基中。作为用于制造神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生进剂的培养条件，从最优化布勒掷孢酵母属(Bullera)微生物的成长所必需的温度、时间，以及提高神经酰胺产生促进效果和葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点出发，优选在20 40°C、更优选在27 35°C 的培养温度下，培养I 7天，优选培养48 96小时，更优选培养68 76小时。
<神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的回收、精制>
从上述培养获得的培养液中回收、精制神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂，可以根据需要，适当地组合过滤、离心分离、离子交换或吸附色谱、溶剂提取、结晶化等通常的操作。具体而言，例如，可以通过离心分离从培养液中除去菌体，再在超声波处理装置中粉碎，回收离心后的上清液。接着，再将回收后的上清液过滤除去杂质等，真空下干燥处理后得到豆渣发酵提取物作为本发明的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
如下述实施例所示，通过培养本发明的布勒掷孢酵母属(Bullera)微生物，并从培养上清液中得到的豆渣发酵提取物，在正常人体的角化细胞中具有使神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺的量增加的作用。
因此，通过培养本发明的布勒掷孢酵母属(Bullera)微生物并从培养上清液中得到的豆渣发酵提取物，可以用于促进神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生的治疗目的或非治疗目的的使用，也可以作为治疗目的或非治疗目的的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂使用。非治疗目的的使用是以美容为目的的使用，或为维持健康状态的使用等。并且，所述治疗目的的使用和非治疗目的的使用是可以完全区分地进行的。
另外，通过培养本发明的布勒掷孢酵母属(Bullera)微生物并从培养上清液中得到的豆渣发酵提取物，还可以用于制造神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
本发明的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂可以作为使角质层中的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺增加，并恢复或维持皮肤的屏障功能和保湿功能的医药品、 准医药品、化妆品等使用。另外，本发明的神经酰胺产生促进剂或葡萄糖神经酰胺产生促进剂也可以作为以神经酰胺产生促进或葡萄糖神经酰胺产生促进为概念的、并根据需要标明该概念的准医药品、化妆品使用。
作为本发明的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的使用形态，可以作为添加到培养细胞中的添加剂，或者制成洗净剂、化妆品等皮肤外用剂，根据使用方法可以以化妆水、乳液、凝胶、霜、软膏、粉末、颗粒等形态提供。在配制各种皮肤外用剂时，可以单独地使用本发明的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂，或适当组合在洗净剂和化妆品等皮肤外用剂中通常配合的油性成分、保湿剂、粉体、色素、乳化剂、增溶剂、紫外线吸收剂、增稠剂、药效成分、香料、防菌防霉剂、植物提取物、醇类等使用。
在将本发明的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂添加到培养的表皮细胞中来促进神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺的情况下，作为本发明的豆渣发酵提取物(换算为干燥固体成分)，其添加量优选为O. 0001 10w/v%，更优选为O. 001 5w/v%。当添加量大于 O. 0001 7^%时,能得到充分的促进效果；而当添加量小于10 7^%时,对表皮细胞的刺激性更小。
在将本发明的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂配合在皮肤外用剂使用时，从有效促进神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺的产生、从而有效提高皮肤的保湿能力、 而且不易显示出培养物的颜色和气味的观点出发，作为豆渣发酵提取物的干燥固体成分， 其配合量优选为皮肤外用剂总量的O. 01 20w/v%，更优选为O.1 10w/v%。
实施例
下面，基于实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于此。
实施例1
(神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造)
作为从豆渣制造神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物，使用铁杉布勒掷孢酵母(Bullera tsugae)(从江南大学购入，并保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心CICIM，保藏编号CICIM Y0259)。
将在YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)培养基中 30°C下培养后得到的上述菌株接种到含有神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂制造培养基IOOml的三角烧瓶(容量300ml)中，在30°C下培养72小时。该培养基含有10w/v%豆渣和lw/v%葡萄糖。其中，豆渣的制备通过将大豆放入水中浸泡12小时，使大豆充分吸收水分，然后将吸收了水分的大豆研磨破碎，过滤并除去液体成分后，将剩余残渣浙干来得到。
然后，为了从得到的培养液中回收神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂， 以3000rpm离心分离10分钟除去菌体，回收离心分离后的上清液，在回收后的培养上清液中加入2. 5倍的无水乙醇稀释后取Iml，作为本发明的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的粗品(本发明品A)。
接着，再用超声波处理装置(Branson公司制造)处理该粗品10分钟，以3000rpm 离心分离30分钟，回收上清液。用滤纸过滤该上清液约70ml，再在40°C以下真空干燥机中干燥该过滤液至恒重，得到豆渣发酵提取物，作为本发明的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
进而，用50V/V%乙醇溶解该豆渣发酵提取物，分别调整其浓度为lw/v% (本发明品B)、0. lw/v% (本发明品C)后，保存在4°C下，用于之后的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进试验。
(神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进试验)
< 角质细胞(Keratinocytes)培养 >
首先，活化角质化细胞(Cascade Co.，Ltd)作为原代细胞，于75cm2培养瓶中(含有生长因子的培养基2ml)，在37°C、CO2浓度为5 %的条件下进行细胞培养，直至培养到细胞聚集密度(confluence)为80 90%。再传代细胞至175cm2方瓶中继续培养细胞至80 90%浓度。然后以IX IO5个细胞/ml传代至12孔板(每孔容积为2ml)中，继续培养细胞至80 90%浓度。
然后，更换不含有生长因子的培养基，在上述12孔板中(η = 2)分别以20 μ I/孔的量添加上述实施例1中得到的豆渣发酵提取物的乙醇水溶液(本发明品A C)。另外， 只添加50v/v%乙醇(没有添加神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂)作为对照品， 相同培养条件下培养72小时。培养72小时后，弃去上清培养液，用2ml PBS(磷酸盐缓冲液)清洗细胞两次(2ml/孔)，再加入Iml PBS至板孔中，以细胞收集器(细胞铲)收集细胞至试管中，以备后续神经酰胺/葡萄糖神经酰胺和蛋白质分析。
<脂质提取>
脂质提取采用Bligh&Dyer法进行。具体而言，首先，在上述回收得到的含细胞的 PBS液中加入甲醇氯仿=2. 5ml 1. 25ml的溶剂，振荡20分钟，进行离心分离(3000rpm, 5分钟)，从而得到上清液和沉淀。将上清液A转移至另外试管中用于神经酰胺/葡萄糖神经酰胺量的分析，将沉淀B用于蛋白质含量的分析。
〈蛋白质含量分析〉
为了表征细胞中的神经酰胺/葡萄糖神 经酰胺量，进行蛋白质含量分析。在上述回收的沉淀B中加入900 μ I的SDS (十二烷基硫酸钠)溶液并进行混合，在60°C水浴下加热2小时使蛋白质变性降解，冷却后在其中添加100 μ I的2N HCl溶液，按照BCAKit (BCA 蛋白浓度测定试剂盒)法测定其中蛋白质的量(记为Pro，单位为μ g/ml)。
<神经酰胺/葡萄糖神经酰胺量分析>
在残留的上清液A中加入PBS 氯仿=1. 25ml 1. 25ml的溶剂，振动20分钟， 3000rpm进行离心分离5分钟，分离、回收作为下相的氯仿层，并在30°C、氮气保护下干燥氯仿层40分钟得到干燥品，加入100 μ I的氯仿甲醇=2. 5ml 1. 25ml的溶剂，并用下述薄板层析(TLC)法对神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量(分别记为Cer和GlyCer，单位为μ g/ ml)进行定量。
采用干燥TLC板，以氯仿甲醇醋酸(190 9 lv/v/v)为展层剂进行薄板层析，待展层剂行至薄板顶端，以吹风机吹干展层剂；重复以上步骤一次。然后以氯仿甲醇丙酮(76 20 4v/v/v)为展层剂进行薄板层析，待展层剂行至距薄板底端2. 5cm处， 停止展层，以吹风机吹干。喷以硫酸铜磷酸溶液，吹干，将层析板放置于180°C烘烤板上烘烤 7分钟显色。扫描显色TLC板并进行神经酰胺(或葡萄糖神经酰胺)分析。
然后，根据下述公式(1)，将所得值分别除以各自的蛋白质含量，得到Cer/Pix)和 GlyCer/Pro。以对照品的 Cer/Pro 和 GlyCer/Pro 为 I,求出本发明的 Cer/Pro 和 GlyCer/ Pro的相对值。并且，以对照品每孔中的蛋白质的量为100，求出每孔中的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量(分别记为Cer/Well和GlyCer/Well,相对于对照品的相对量)。一并在表I中表不。
公式(1)
Cer/Pro =神经酰胺量(μ g/ml) /蛋白质含量(μ g/ml)
GlyCer/Pro 二葡萄糖神经酰胺量(μ g/ml) /蛋白质含量(μ g/ml)
表权利要求
1.一种神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中，在含有豆渣和糖类的培养基中培养布勒掷孢酵母属(Bullera)的微生物，从其上清液中获得神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
2.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中， 所述布勒掷孢酵母属(Bullera)的微生物是铁杉布勒掷孢酵母(Bullera tsugae)。
3.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中， 所述糖类是葡萄糖。
4.如权利要求3所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中， 所述培养基由豆渣、葡萄糖和水构成。
5.如权利要求4所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中， 所述培养基中所述豆洛的含量为8 12w/v%,所述糖类的含量为O. 8 1. 2w/v%。
6.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中， 所述培养温度为27 35°C。
7.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中， 所述培养时间为I 7天。
8.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中， 将通过所述培养获得的培养液进行离心，从而得到所述上清液。
9.如权利要求8所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中， 在离心后获得的所述上清液中加入乙醇后，进一步经超声波处理、离心分离、过滤、真空干燥处理进行精制后，得到神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
10.豆渣发酵提取物用于促进神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺的产生的非治疗目的的用途，所述豆渣发酵提取物是在含有豆渣的培养基中培养布勒掷孢酵母属(Bullera)的微生物得到的。
11.豆渣发酵提取物作为神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的非治疗目的的用途，所述豆渣发酵提取物是在含有豆渣的培养基中培养布勒掷孢酵母属(Bullera)的微生物得到的。
12.豆渣发酵提取物在制造神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂中的用途， 所述豆渣发酵提取物是在含有豆渣的培养基中培养布勒掷孢酵母属(Bullera)的微生物得到的。
13.如权利要求10 12中任意一项所述的用途，其中，所述布勒掷孢酵母属(Bullera)的微生物是铁杉布勒掷孢酵母(Bullera tsugae)。
全文摘要
本发明提供一种神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中，在含有豆渣和糖类的培养基中培养布勒掷孢酵母属(Bulera)的微生物，从其上清液中获得神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。根据本发明的制造方法，能够利用特定微生物，以食品加工业等的副产物豆渣作为培养基的主原料，从而低成本且高效地获得神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
文档编号C12P1/02GK102994556SQ20111028905
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月15日 优先权日2011年9月15日
发明者孔凡旗 申请人:花王株式会社