专利名称：硅质膜离心吸附柱再生液的制作方法
技术领域：
本发明属于核酸纯化技术领域，具体涉及一种硅质膜离心吸附柱的再生液配制及使用方法。
背景技术：
核酸提取已经成为分子生物学实验中一项很基本的技术，各种不同的提取技术总体上可以分为以下三种(1)碱裂解法由于经典的碱裂解法和酚氯仿抽提法实验成本低、不需要一些尖端的的实验设备，因而早期被广泛应用，但是这种方法同时也受到了一些实际操作的限制， 譬如不能有效地保证所提取的DNA的质量、实验耗时长等。(2)依赖于未修饰的硅质树脂法用这种方法提取的DNA产物不论是从质量还是数量上都优于经典的碱裂解法，但其产物应用范围比较局限，诸如不能应用于体外转录/ 翻译、显微注射、免疫应用等方面，从而限制了它的发展。(3)依赖于硅质膜离心吸附柱法与依赖于未修饰的硅质树脂法相比，硅质膜离心吸附柱的硅质膜是经过化学修饰的，其表面带有大量阴离子基团，从而使得硅质膜可以在高盐低PH的情况下高效的吸附核酸。在过去的二十几年时间内依赖于硅质膜离心吸附柱提取核酸的技术已经较为完善，其可以大幅度的提高核酸提取的质量和数量，而且不需要一些复杂仪器的辅助。虽然硅质膜离心吸附柱具有操作方便、实验耗时短等优点，但是硅质膜离心吸附柱不能重复使用。对于使用过的吸附柱而言，在核酸洗脱时会有5% 10%的核酸残留在硅质膜上，这些核酸既有自由形态的也有与蛋白质结合形态的，如果重复使用，会造成对第二次纯化的核酸样品的污染；即使提取同一样品，也会使核酸的提取效率大大降低，因此一般商品化的硅质膜离心吸附柱均不建议重复使用。如果实验室大量使用一次性的吸附柱，无疑大大增加了实验成本。除此之外，使用过的吸附柱残留有重组DNA等物质，在使用后必须经处理再丢弃，否则可能造成对环境的损害。如果希望重复使用，早期多采用无菌水或TE缓冲液反复浸泡洗涤，以达到去除硅质膜上残留核酸的目的；但是这样的处理很难完全清除硅质膜离心吸附柱上残留的核酸、蛋白等生物分子，导致硅质膜离心吸附柱在重复使用过程中吸附能力下降，更为严重的是会造成样品间的交叉污染。近年来，SiddappaN. B.等(Biotechniques,42,186-192 (2007))提出将使用过的硅质膜离心吸附柱浸泡在lmol/L的盐酸水溶液中一段时间，再次使用前用大量无菌水清洗；NicoSia Α.等(Analytical Biochemistry, 385,182-183 (2009)和 Biomedical chromatography, 24，1263-1264 (2010))提出分别用(1) 0· 2 或 lmol/L 的 NaOH 水溶液、 0. 或0. 15%的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)水溶液和(2) 1. 5mol/L的HCl水溶液、0. 15%的TritonX-100水溶液处理使用过的硅质膜离心吸附柱。这些方法都能达到去除硅质膜上残留核酸的目的，但是这些溶液中使用了较高浓度的有腐蚀性的强酸强碱，存在安全隐患，此外，这些方法处理完硅质膜离心吸附柱后还需要用大量的无菌水清洗，操作步骤多，费时。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述硅质膜离心吸附柱在再生过程中不能完全去除硅质膜上残留核酸和使用腐蚀性酸碱的缺点，提供一种无酸碱腐蚀性、环境污染小的硅质膜离心吸附柱的再生液。解决上述技术问题所采用的技术方案是本发明的硅质膜离心吸附柱的再生液由溶液A与溶液B按体积比为1 1混合而成，所述的溶液A为4 lOmmol/L的抗坏血酸水溶液，所述的溶液B由硫酸铜或氯化铜、硫酸亚铁或氯化亚铁、乙二胺四乙酸、非离子型表面活性剂、去离子水组成，溶液B中Cu2+浓度为0. 2 lmmolZHe2+浓度为0. 2 lmmol/L、 乙二胺四乙酸浓度为0. 15 lmmol/L、非离子型表面活性剂的体积分数为0. 0. 4%。上述的非离子型表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚、吐温-20、吐温-40、吐温-60 中的任意一种。本发明硅质膜离心吸附柱的再生液中，所述的溶液A优选lOmmol/L的抗坏血酸水溶液，所述的溶液B中优选Cu2+浓度为0. 2mmol/L,Fe2+浓度为0. 2mmol/L、乙二胺四乙酸浓度为0. 3mmol/L、非离子型表面活性剂的体积分数为0. 3%。本发明的的非离子型表面活性剂优选聚乙二醇辛基苯基醚。本发明的硅质膜离心吸附柱的再生液可用于再生使用过的用于质粒提取、琼脂糖凝胶回收或聚合酶链式反应产物回收的硅质膜离心吸附柱，还可用于再生未使用的用于质粒提取、琼脂糖凝胶回收或聚合酶链式反应产物回收的硅质膜离心吸附柱。本发明硅质膜离心吸附柱再生液的使用方法如下向硅质膜离心吸附柱中加入500 μ L硅质膜离心吸附柱再生液，室温静置5 30 分钟，室温10000转/分钟离心1分钟，弃去接液管内液体，再向硅质膜离心吸附柱中加入 750 μ L灭菌水，室温静置2分钟，室温10000转/分钟离心1分钟，弃去接液管内液体，完成硅质膜离心吸附柱的再生处理。本发明不仅可以去除已经使用过的硅质膜离心吸附柱上残留的核酸样品，而且能够有效恢复已经使用过的硅质膜离心吸附柱的核酸结合能力，使其可以再次应用于其他核酸样品的纯化。另外，本发明的再生液还可以有效提高放置时间过长的新的硅质膜离心吸附柱的核酸结合能力，提高核酸纯化效率。本发明成本低、环境污染小，可以使硅质膜离心吸附柱重复使用。
图1是再生和未再生的不同用途的硅质膜离心吸附柱所提取核酸为模板的PCR扩增产物的凝胶电泳图。图2是不同再生次数的用于质粒提取的硅质膜离心吸附柱的质粒提取量。图3是再生和未再生的使用过的用于琼脂糖凝胶回收的硅质膜离心吸附柱的核酸回收量。图4是再生和未再生的使用过的用于聚合酶链式反应产物回收的硅质膜离心吸附柱的核酸回收量。
图5是再生液对用于质粒提取的未使用过的硅质膜离心吸附柱质粒提取量的影响。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。实施例1将0. 176g抗坏血酸加入IOOmL去离子水中，配制成10mmol/L的抗坏血酸水溶液， 即溶液A ；将0. 003g硫酸铜、0. 003g硫酸亚铁、0. 009g乙二胺四乙酸、0. 3mL聚乙二醇辛基苯基醚加入IOOmL去离子水中，配制成溶液B，溶液B中硫酸铜的浓度为0. 2mmol/L、硫酸亚铁的浓度为0. 2mmol/L,乙二胺四乙酸的浓度为0. 3mmol/L，聚乙二醇辛基苯基醚的体积分数为0. 3% ；将IOOmL溶液A、IOOmL溶液B混合均勻，制备成硅质膜离心吸附柱再生液。实施例2将0. 070g抗坏血酸加入IOOmL去离子水中，配制成4mmol/L的抗坏血酸水溶液， 即溶液A ；将0. 003g硫酸铜、0. 003g硫酸亚铁、0. 004g乙二胺四乙酸、0. ImL聚乙二醇辛基苯基醚加入IOOmL去离子水中，配制成溶液B，溶液B中硫酸铜的浓度为0. 2mmol/L、硫酸亚铁的浓度为0. 2mmol/L,乙二胺四乙酸的浓度为0. 15mmol/L，聚乙二醇辛基苯基醚的体积分数为0. 1 % ；将IOOmL溶液A、IOOmL溶液B混合均勻，制备成硅质膜离心吸附柱再生液。实施例3将0. 106g抗坏血酸加入IOOmL去离子水中，配制成6mmol/L的抗坏血酸水溶液， 即溶液A ；将0. 009g硫酸铜、0. 008g硫酸亚铁、0. 009g乙二胺四乙酸、0. 2mL聚乙二醇辛基苯基醚加入IOOmL去离子水中，配制成溶液B，溶液B中硫酸铜的浓度为0. 5mmol/L、硫酸亚铁的浓度为0. 5mmol/L,乙二胺四乙酸的浓度为0. 3mmol/L，聚乙二醇辛基苯基醚的体积分数为0. 2% ；将IOOmL溶液A、IOOmL溶液B混合均勻，制备成硅质膜离心吸附柱再生液。实施例4将0. 141g抗坏血酸加入IOOmL去离子水中，配制成8mmol/L的抗坏血酸水溶液， 即溶液A ；将0. 012g硫酸铜、0. Ollg硫酸亚铁、0. 015g乙二胺四乙酸、0. 3mL聚乙二醇辛基苯基醚加入IOOmL去离子水中，配制成溶液B，溶液B中硫酸铜的浓度为0. 7mmol/L、硫酸亚铁的浓度为0. 7mmol/L,乙二胺四乙酸的浓度为0. 5mmol/L，聚乙二醇辛基苯基醚的体积分数为0. 3% ；将IOOmL溶液AUOOmL溶液B混合均勻，制备成硅质膜离心吸附柱再生液。实施例5将0. 176g抗坏血酸加入IOOmL去离子水中，配制成10mmol/L的抗坏血酸水溶液， 即溶液A ；将0. 017g硫酸铜、0. 016g硫酸亚铁、0. 029g乙二胺四乙酸、0. 4mL聚乙二醇辛基苯基醚加入IOOmL去离子水中，配制成溶液B，溶液B中硫酸铜的浓度为lmmol/L、硫酸亚铁的浓度为lmmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为lmmol/L，聚乙二醇辛基苯基醚的体积分数为 0.4% ；将IOOmL溶液A、IOOmL溶液B混合均勻，制备成硅质膜离心吸附柱再生液。实施例6在实施例1 5中，溶液B中的硫酸铜用等摩尔的氯化铜替换、硫酸亚铁用等摩尔的氯化亚铁替换，聚乙二醇辛基苯基醚用等体积的吐温-20替换，其他原料及其含量与相应实施例相同，制备成硅质膜离心吸附柱再生液。
本实施例的吐温-20也可用等体积的吐温-40替换，还可用等体积的吐温-60替换。为了确定本发明的最佳原料配比，发明人进行了大量的实验室研究试验，各种试验情况如下实验材料聚乙二醇辛基苯基醚(1^切1^_100，分子量为646.86，化学式为 C34H62O11)，由Sigma公司提供；抗坏血酸、硫酸铜(CuSO4)、硫酸亚铁(FeSO4)、乙二胺四乙酸 (EDTA)均为市售产品；未使用的硅质膜离心吸附柱(用于质粒提取、琼脂糖凝胶回收和聚合酶链式反应产物回收的硅质膜离心柱)，由Qiagen公司提供；使用过的硅质膜离心吸附柱(用于质粒提取、琼脂糖凝胶回收和聚合酶链式反应产物回收的硅质膜离心柱)，由本实验室收集，也为Qiagen公司产品。实验仪器紫外分光光度计Biophotometer，由Eppendorf公司提供；电泳设备，由北京市六一仪器厂提供；PCR仪S1000，由Bio-rad公司提供。为了研究溶液A中抗坏血酸的浓度以及溶液B中Cu2+Je2+、EDTA、TritonX-IOO的浓度对硅质膜离心吸附柱的再生液性能的影响，发明人设计了五因素四水平的正交试验， 试验因素和水平见表1。将IOmL溶液A与IOmL溶液B混合，制备成不同配比的硅质膜离心吸附柱再生液，分别用于处理已经使用过的用于质粒提取的硅质膜离心吸附柱，然后用处理过的硅质膜离心吸附柱提取5mL过夜培养菌液中的质粒，使用紫外分光光度计对提取的质粒进行定量，并对测量数据进行直观分析，结果见表1。表1正交试验设计及直观分析
权利要求
1.一种硅质膜离心吸附柱再生液，其特征在于它由溶液A与溶液B按体积比为1 1 混合而成，所述的溶液A为4 lOmmol/L的抗坏血酸水溶液，所述的溶液B由硫酸铜或氯化铜、硫酸亚铁或氯化亚铁、乙二胺四乙酸、非离子型表面活性剂、去离子水组成，溶液B中 Cu2+浓度为0. 2 lmmol/L Je2+浓度为0. 2 lmmol/L、乙二胺四乙酸浓度为0. 15 lmmol/ L、非离子型表面活性剂的体积分数为0. 0. 4% ；上述的非离子型表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚、吐温-20、吐温-40、吐温-60中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的硅质膜离心吸附柱的再生液，其特征在于所述的溶液A为 IOmmol/L的抗坏血酸水溶液，所述的溶液B中Cu2+浓度为0. 2mm0l/L、i^2+浓度为0. 2mmol/ L、乙二胺四乙酸浓度为0. 3mmol/L、非离子型表面活性剂的体积分数为0. 3%。
3.根据权利要求2所述的硅质膜离心吸附柱的再生液，其特征在于所述的非离子型表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚。
全文摘要
一种硅质膜离心吸附柱再生液，由溶液A和溶液B按体积比为1∶1混合而成，所述的溶液A为抗坏血酸水溶液，所述的溶液B由硫酸铜或氯化铜、硫酸亚铁或氯化亚铁、乙二胺四乙酸、非离子型表面活性剂、去离子水组成，所述的非离子型表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚、吐温-20、吐温-40、吐温-60中的任意一种。本发明的再生液可以消除使用过的硅质膜离心吸附柱上残留的核酸样品，有效恢复其核酸结合能力，使其可以再次应用于其他核酸样品的纯化。另外，本发明的再生液还可以有效提高放置时间过长的新的硅质膜离心吸附柱的核酸结合能力，提高核酸纯化效率。本发明成本低、环境污染小，可以使硅质膜离心吸附柱重复使用。
文档编号C12N15/10GK102358899SQ201110294478
公开日2012年2月22日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者孙燕, 文娣娣, 李治 申请人:陕西师范大学