专利名称：一种抑制水稻在正常条件下根系伸长的方法
技术领域：
本发明涉及功能基因组学领域，尤其涉及一种抑制水稻在正常条件下根系伸长而不影响低磷逆境下根系伸长的方法。
背景技术：
植物是以磷酸盐的形式吸收磷(Ullrich-Eberius，C.I.，A. Novacky, et al. (1981). “ Relationship between Energy-dependent Phosphate Uptake and the Electrical Membrane Potential in Lemna gibba Gl. " Plant Physiology 67(4) 797-801.)，磷是植物生长发育与农作物产量最大的限制性因素。在占全世界可耕种土地70%以上的碱性和酸性土壤中，作物产量最主要的限制因素是较低的磷利用效率 (Schachtman,D. P. ,Reid,R. J. and Ayling,S. L. (1998)“ Phosphorus uptake by plants from soil to cells" . Plant Physiology. 116 :447-453.)。农业生产中大量施用的磷肥， 经过雨水的冲刷大量流失，进入江河湖海，造成水系的富营养化及环境污染。因此，提高作物的磷利用效率迫在眉睫。植物根系是植物的重要组成部分，它不但是地上部的物理支撑，同时也是植物从地下吸收营养成分和水分的重要器官，与农业生产息息相关。在低磷逆境下，植物常常改变根的构型，增加与土壤的接触面积(JungkA. (2001)" Root hairs and the acquisition of plant nutrients from soil" . Journal of Plant Nutrition and Soil Science 164 :121-1 )，以获得更多的磷(Lorenzo, H. and Forde, B. G. (2001)" The nutritional control of root development" . Plant and Soil. 232 :51-6 。在拟南芥中，低磷诱导侧根发生，根毛伸长，但是抑制主根的生长(Williamson, L.，Ribrioux, S.，Fitter, A. and Leyser, 0. (2001) “ Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. “ Plant Physiology. 126 :1-8)。水稻在低磷或无磷水培条件主根 申 &， 1 ^ ^c W (Shimizu, Α. ， K. Kato, et al. (2008). “ Genetic analysis of root elongation induced by phosphorus deficiency in rice (Oryza sativa L. ) :fine QTL mapping and multivariate analysis of related traits. " T heoretical and Applied Geneticsll7(6) :987-996.)。植物根系的生长机制一直存在争议，形成了两大理论细胞论(TheCell Theory) 和器官论(The organismal theory) 0前者认为细胞数目的增加是植物根系生长的原因。 后者认为植物根系的生长是单个细胞膨胀的累积效应，细胞膨胀才是根系生长的主要原因。后来一些学者研究发现，细胞数目的增加与细胞的膨胀都影响根系的生长，于是整合上述两个假说，提出一个新的生长理论——整合模型antegrated model) (Beemster,G. Τ.， F. Fiorani,et al. (2003). “ Cell cycle :the key to plant growth control？ " Trends inPlant Science. 8(4) :154-158.)。细胞壁决定了植物细胞的形状最终决定植物的生长发育。植物细胞壁主要三层结构中间层，初生细胞壁及次生细胞壁。初生壁的主要组成成分是纤维微丝及其充斥其间CN 102415334 A
说明书
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的半纤维素与果胶。次生壁富含纤维素及木质素。纤维素合成缺陷将导致植物发育障碍。 水稻矮化突变体glu因纤维素合成缺陷，导致地上部纤维素含量明显降低，节间细胞缩短 (Zhou, H. L. , He, S. J. , Cao, Y. R. , Chen, Τ. , Du, B. Χ. , Chu, C. C. , Zhang, J. S. , and Chen, S.Y. (2006) " OsGLUl, a putative membrane-bound endo-1,4-beta-D-glucanasefrom rice, affects plant internode elongation" . Plant Mol Biol 60,137-151·)。拟南芥突变体kor也是因纤维素合成缺陷导致植株发育异常(Arioli，Τ.，Peng, L.，Betzner, et al. (1998)“ Molecular analysis of cellulose biosynthesis in Arabidopsis". Science 279 :717-720.)。
发明内容
本发明提供了一种抑制水稻在正常培养条件下根系伸长的方法，降低了根系对碳同化物的需求量，以增加地上部分的生物量，而该方法不影响水稻在低磷逆境下的根系伸长。一种抑制水稻在正常条件下根系伸长的方法，包括将水稻的0sGLU3基因定点突变，或通过遗传杂交将0sGLU3突变基因导入水稻，获得遗传改造的株系。一种降低水稻根系微晶纤维素含量的方法，包括将水稻中的0sGLU3基因敲除或定点突变，得到转基因株系。通过NCBI和TIGER数据库搜索，基因0sGLU3的基因号为L0C_0s04g41970，该基因在TIGR上基因全长为3861bp，0RF为1872bp，具有序列表中SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列。本发明还提供了一种水稻0sGLU3突变基因，其碱基序列如SEQ IDN0. 1所示。本发明提供了包含上述水稻0sGLU3突变基因的表达盒、重组载体或转化子。本发明通过对水稻0sGLU3变体基因实施定点突变或利用杂交将其突变基因导入，可以获得相应的株系。该株系正常条件下的根系较正常株系短，而低磷逆境下根系也同样会伸长，增加了地面部分的生物量。
图1为突变体表型及转基因回复株。从左至右野生型，突变体，转基因回复株， Bar = 2 cm ；图2为低磷逆境下，突变体同野生型一样根系伸长。从左至右正常条件下野生型，低磷条件下野生型，正常条件下突变体，低磷条件下突变体，Bar = 2cm ；图3为Kasalath背景的突变体表型。从左至右突变体，Kasalath野生型；图4为Dongjin背景的基因敲除表型。从左至右=Dongjin野生型，基因敲除突变体。图5为0sglu3突变体和野生型水稻根系微晶纤维含量柱状图。
具体实施例方式实施例1基因突变及培育植株粳稻(Oryza Sativa L. ssp indica)地方品种石狩白茅(SSBM)种子清水浸种，
4的 EMS(ethyl methylsulfonate)处理处理 4h，播种，收获 Ml 种子。将Ml种子浸种至露白，播种与网纱上，水培10天，筛短根突变体，取其中一个突变体 0sglu3-l，该突变体是一个符合单基因控制遗传规律的隐性突变体。实施例2突变体基因鉴定为了分离0sGLU3基因，本发明采用基因图位克隆方法。首先创建一个F2定位群体，它由0sglu3-l的杂合子为母本，野生型粳稻Kasalath为父本杂交获得的F2中的隐性个体组成。并利用SSR(Simple Sequence R印eats)分子标记对0sGLU3位点进行初步定位。定位结果表明，0sGLU3初步定位在第4染色体介于S4-2483A与S4_24893k两个标记之间。该区间大小为141Λ，该区间有14个功能基因。对该区间的候选基因0sGLU3进行测序分析，发现突变体(SEQ ID NO. 2)和野生型的0sGLU3基因的ORF存在差异，即突变体的第1352碱基处T突变为A，导致蛋白序列上第451个脂肪族类亮氨酸(Leu)突变为碱性氨基酸类组氨酸(His)。为了进一步证明突变体突变表型是由0sGLU3的突变引起的，对突变体进行了转基因回复验证。回复载体1300-0sGLU3的构建是通过在双元植物载体pCAMBIA1300中插入 GLU3全基因组(包括^84bp的启动子序列及3335bp的基因编码区)来实现的。将构建好的回复载体通过农杆菌介导转化0sglu3愈伤，经筛选培养获得T2代株系。如图1所示，转化了 0sGLU3的突变体表型回复，上述结果证明了该突变体的确是由于0sGLU3的突变引起的。实施例3突变体低磷逆境处理具体方法如下水稻培养液按国际水稻所标准营养液配方(Yoshida etal.， 1976)进行配制，配方略有改动(铁盐由！^3+调整为狗2+)。配方如下1.425mM NH4NO3, 0. 323mM NaH2PO4, 0. 513mM K2SO4, 0. 998mMCaCl2, 1. 643mM MgSO4, 0. 009mM MnCl2, 0. 075 μ M(NH4)6Mo7O24O. 019mM H3BO3, 0. 155 μ M CuSO4,125 μ M EDTA-Fe,禾口 0· 152 μ M SiSO4。用2Ν HCl调节ρΗ值至5. 5。配制缺磷(-Ρ)营养液时分别去除正常营养液中0. 323mM NaH2PO4即可。将露白的突变体和野生型种子播于水稻培养液浮着的尼龙网纱上面，在水稻培养室中(day/night :30°C /22°C, 12h/12h ；Rh80%, 450 μ mol photons mV)培养 10 天， 拍照，如图2。突变体在低磷胁迫下根系伸长不受影响。实施例4培育0sglu3定点突变的植株将纯合突变体0sglu3-l与籼稻品种Kasalath杂交，获得野生型表型的Fl，Fl与 Kasalath杂交三代后自交繁育，后代通过PCR及测序鉴定出0sglu3突变纯合的个体。如图 3所示，其根系生长与原0sglu3-l突变体类似，在正常培养条件下根系伸长受到抑制。实施例5基因敲除水稻地方品种Dongjin，利用T_DNApGA2707载体通过农杆菌介导转化Dongjin愈伤，经筛选培养获得T2代株系，筛选出基因0sGLU3敲除突变体，置于实施例3所述的正常培养液中培育，如图4，敲除突变体的根系抑制更严重。实施例6突变体微晶纤维素含量测定1.分离细胞壁取60_70mg根系组织，置于液氮中研磨成粉末，放入2ml离心管中。加入1. 5ml的 70%酒精水溶液，充分混勻，10，OOOrpm离心lOmin，弃上清液。加入1. 5ml的氯仿/甲醇(1 1，ν/ν)溶液，剧烈震荡重新悬浮沉淀。10，OOOrpm离心lOmin，弃上清液。加入500ul 丙酮重悬沉淀，35°C空气流蒸发液体直至干燥。沉淀中加入1. 5ml的0. IM的乙酸钠缓冲液(PH5. 0)，80°C加热20min，冰上冷却。 加入下列试剂:35ul的0. Ol %的叠氮化钠(NaN3)，35ul淀粉酶(50 μ g/ImLH2O)，18单位的支链淀粉酶。盖上盖子充分混勻。37°C震荡消化过夜，离心管水平放置以促进样品混勻。 100°C加热lOmin，终止反应。10，OOOrpm离心lOmin，弃去含有可溶性淀粉的上清液。加 1. 5ml水，混勻，离心，弃上清，洗涤3次。500ul丙酮中重悬沉淀。35°C空气流干燥，干燥的物质即为分离的细胞壁。2.水解微晶纤维素称重2mg上述分离的细胞壁(Wew)到2ml带盖的管子中。加入20ul肌醇(5mg/ml) 作为内标物，加入250ul的丙酮清洗管壁，使样品集中在管底。在气流下轻柔的蒸发丙酮， 加入250ul的2M三氟乙酸(TFA)，盖紧盖子，121°C保育90min，冰中冷却，10, OOOrpm离心 lOmin，去除IOOul的酸性上清液(包含源于基质多糖的单糖)。加入Iml的Updegraff试剂(乙酸硝酸水；8 1 2，ν/ν)加入经TFA处理的沉淀中。盖紧盖子混勻，在100°c下保育30min。在冰中冷却至室温或更冷，10，OOOrpm离心15min。弃上清，确保不打扰沉淀，为了这个目的留下大约150ul的上清在管子中。加入 1. 5ml水，震荡，离心弃上清，如上步。加入1.5ml丙酮，震荡，离心弃上清，如上步。重复三次。在实验台自然干燥过夜。 加入175ul的72%的硫酸(Saeman水解)，使沉淀(微晶纤维素)完全水解成葡萄糖。室温下保育30min，混勻后再保育15min。加入825ul的水，混勻。10，OOOrpm离心5min。这时可能还有一些棕色不溶物质-木素，留在管底。3.绘制标准曲线吸取0，2，4，6，8，10111的111^/1111葡萄糖母液(储存在0°C )分别加入不同的孔中， 创建0,2,4,6,8, IOug的标准液，每个孔加水至IOOul。IOul的样品上清液和90ul的水加入每一个孔中，与标准液在同一块板上。加入200ul的新配置的蒽酮试剂(蒽酮融入浓硫酸，2mg蒽酮/ml硫酸)。80°C加热板30min，含有样品的葡萄糖从黄色转变为蓝绿色。室温下冷却板，充分摇荡。用滴定板器625nm读吸光度。标准曲线的绘制0，2，4，6，8，IOug标准液及与之对应的吸光值在Excel中绘制出 XY散点图，计算出标准曲线公式。根据标准曲线公式，计算出IOul样品中的葡萄糖含量Wgl。(微晶纤维素含量)，单位细胞壁中纤维素的含量=(Wgl。*100)/W ，结果如图5。可以看出突变型的根系微晶纤维含量明显小于野生型根系微晶纤维的含量。
权利要求
1.一种抑制水稻在正常条件下根系伸长的方法，包括将水稻的0SGLU3基因定点突变，或通过遗传杂交将0sGLU3突变基因导入水稻，获得遗传改造的株系。
2.一种降低水稻根系微晶纤维素含量的方法，包括将水稻中的0sGLU3基因敲除或定点突变，得到转基因株系。
3.一种水稻0sGLU3突变基因，其碱基序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.一种含权利要求3所述的水稻0sGLU3突变基因的表达盒、重组载体或转化子。
全文摘要
本发明公开了一种抑制水稻在正常条件下根系伸长的方法，包括将水稻的OsGLU3基因定点突变，或通过遗传杂交将OsGLU3突变基因导入水稻，获得遗传改造的株系。本发明通过对水稻OsGLU3变体基因实施定点突变或利用杂交将其突变基因导入，可以获得相应的株系。该株系正常条件下的根系较正常株系短，而低磷逆境下根系也同样会伸长，增加了地面部分的生物量。
文档编号C12N15/56GK102415334SQ20111029666
公开日2012年4月18日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者吴平, 张锦伟, 易可可 申请人:浙江大学