专利名称：低聚果糖的分离纯化方法
技术领域：
本发明属于利用发酵法合成低聚果糖领域，具体涉及法夫酵母JMU-MVP14发酵合成的低聚果糖的分离纯化方法。
背景技术：
低聚果糖是在蔗糖分子的果糖残基上通过β-(1, -糖苷键与一个或多个果糖基相连形成的。低聚果糖易溶于水，甜度是蔗糖的30%-60%，其保湿性高于蔗糖，与山梨醇相当，粘度比相同浓度的蔗糖高，在PH 4. 0-7. 0之间具有很强的热稳定性。随着人们的健康意识越来越强，功能性食品的市场需求越来越大，2005年，美国的功能性食品的市场价值在735亿美元左右，预计在2013年期需求量将达到905亿美元。低聚果糖作为一种功能性食品已获得FDA的认可，目前低聚果糖在美国的市场价值在$200/ kg左右。低聚果糖在食品、饲料、医药、化妆品等行业的大规模开发应用，推动了低聚果糖的工业化生产。上世纪80年代日本对低聚果糖的代谢、组成、应用和工业化生产做了多方面的研究。1984年，日本明治制果株式会社用固定化增殖细胞实现了低聚果糖的工业化生产。目前，工业化生产低聚果糖的主要问题是产率低，从而导致低聚果糖的生产成本过高。因此有很多研究人员在合成低聚果糖菌种选育上做了大量的研究。工业上用果糖基转移酶生成低聚果糖的主要问题是蔗糖酶解过程中果糖基转移酶的成本过高。酶固定化技术能够使果糖基转移酶重复利用，从而降低果糖基转移酶的使用成本。固定化酶所用的载体对酶活乃至低聚果糖的产量至关重要，主要载体有多孔硅石、苯乙烯衍生的多孔离子交换剂、甲基丙烯酰胺、海藻酸钙等。随着固定化技术的发展，人们开始用研究固定化细胞和菌体合成低聚果糖，这样省去了酶固定化过程中酶的分离提纯成本。由于蔗糖转化生成低聚果糖的副产物葡萄糖会抑制蔗糖的进一步转化，而葡萄糖异构酶能够将葡萄糖转化成果糖。可通过细胞重组，发酵条件优化等方式来提高低聚果糖产量。低聚果糖的合成一般是以蔗糖等为原料，利用果糖基转移酶催化合成的，微生物在合成低聚果糖过程中由于细胞代谢以及酶的非专一性等原因，低聚果糖合成过程中常常含有其它副产物如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等单糖或二糖，此外，还含有较大量的灰分等。因此，在制备低聚果糖时，需要将低聚果糖与这些成分分离。
发明内容
低聚果糖酶法合成过程中常常含有其它副产物如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等单糖或二糖，此外，还含有较大量的灰分等，因此，在制备低聚果糖时，需要将低聚果糖与这些成分分离。有鉴于此，本发明提供了一种低聚果糖的分离纯化方法，能够实现在同一批次的发酵过程中同时分离纯化虾青素和低聚果糖，获得的低聚果糖含量高。为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的
3低聚果糖的分离纯化方法，其分离纯化步骤包括蔗糖经法夫酵母JMU-MVP14发酵制得含有低聚果糖和虾青素的发酵液，发酵液经过离心机离心分离，提取出下层虾青素，将上层清液经沸水浴加热灭酶活后再经微滤膜提纯，得到的滤液流经填充吸附介质的层析柱吸附，再用乙醇溶液洗脱吸附介质，将洗脱液蒸发浓缩后得到低聚果糖。上述微滤膜提纯是将上层清液在真空抽滤条件下依次通过0. 8 μ m、0. 45 μ m和 0.22 μ m的微滤膜过滤。上述吸附介质为离子交换树脂、活性炭、硅藻土、或活性炭与硅藻土的混合物。吸附介质优选为活性炭。上述层析柱的柱温是35°C，所述滤液流经填充吸附介质的层析柱的流速为0.5 ml/min-1. 5 ml/min。滤液流经填充吸附介质的层析柱的流速优选为0. 5 ml/min。本发明中，法夫酵母JMU-MVP14发酵合成的低聚果糖与其他物质共存于发酵液中，需要对其进行分离提纯后(尤其是去除重金属及其他盐类)才能利用。本发明将加热灭酶活后的法夫酵母JMU-MVP14发酵液经微滤膜提纯。微滤膜过滤分离是根据滤膜孔径的大小，大于膜孔径的分子被截留，而小于膜孔径的分子透过的原理进行分离的，具有高效、低能耗、设备简单、操作方便等优点。但膜分离不能将分子量相似的不同物质分离开来，所以还需要后续进一步提纯。低聚果糖进一步分离纯化的方法很多，但常用的主要是利用离子交换树脂、活性炭、硅藻土等为吸附剂通过柱层析对其进行分离纯化。低聚果糖滤液流经填充吸附介质的层析柱吸附。根据待分离样品中不同组分与层析柱填料间的结合能力的差异，使混合物中难结合组分与易结合组分分离开来。应用最有效的是活性炭吸附法和离子交换树脂法，用层析柱分离低聚果糖的主要优点是可以数百次连续循环操作、多次重复使用吸附剂。活性炭分离低聚果糖是根据不同聚合度的低聚果糖之间极性的差异进行分离的。 用活性炭分离低聚果糖的特点是吸附容量大，适用范围广，可用于不同聚合度的糖之间的分离；待分离样品中的无机盐对分离没有影响，此外活性炭吸附剂价格便宜，分离设备投入成本低，适合工业化应用。离子交换吸附是利用待分离组分中各种糖分在树脂上的吸附能力的不同进行分离的，离子交换树脂已成功的应用于糖类的分离纯化。本发明提供了一种低聚果糖的分离纯化方法，能够实现在同一批次的发酵过程中同时分离纯化虾青素和低聚果糖。获得的低聚果糖产品含量高，经检测纯化产品中各种重金属含量都未超过国家规定的食品标准检测上限，此外，纯化产品中总糖含量达到97. 65%， 灰分含量只有0. 78%。该结果说明，法夫酵母JMU-MVP14发酵蔗糖的发酵液可通过本发明中廉价、简单的分离操作而纯化得到符合食品卫生要求的低聚果糖。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述，但附图和具体实施方式
不应理解为是对本发明进行的限定。图1是本发明实施例4中吸附介质中活性炭的含量对低聚果糖吸附量的影响效果图。
图2是本发明实施例5中不同温度下低聚果糖静态吸附效果图。图3是本发明实施例6中柱层析流速对低聚果糖吸附的影响图。
具体实施例方式法夫酵母JMU-MVP14联产发酵虾青素和低聚果糖
将活化的法夫酵母JMU-MVP14取1 ml接种到摇瓶培养基中，22°C，190 r/min培养72 h制得种子液；按6%的接种量将种子液转接到装有5 L发酵培养基的7 L发酵罐中，控制温度22°C、通气量3 L/min,通过调节搅拌转速控制溶氧在30-40% ；用25%氨水自动流加控制PH 6.0;每隔8 h取一次样测其虾青素含量，待虾青素合成达到稳定后，加入蔗糖溶液， 维持PH不变继续发酵2 h取样。在7 L罐中法夫酵母JMU-MVP14合成含有虾青素和低聚果糖的发酵液。发酵液的预处理
法夫酵母JMU-MVP14发酵液在3500 r/min下离心10 min得到上层清液和下层沉淀， 下层沉淀即为提取的虾青素。再将上层清液经沸水浴加热15 min灭酶活，在真空抽滤条件下依次通过0.8 μπι、0.45 μ m和0.22 μ m的微滤膜，得到含有低聚果糖的过滤液。吸附介质的前处理
(1)SP-sepharose> Q-sepharose 预处
两种树脂都依次用0.5 mol/L的NaOH、超纯水、0.5 mol/L的NaCl及超纯水循环洗涤3 遍；此后，SP-kpharose用稀0. 1 mol/L的HCl洗涤，再用超纯水洗涤至中性，Q_s印harose 用0. 1 mol/L的NaOH洗涤，再用超纯水洗涤至中性；
(2)活性炭及硅藻土预处理
用20%盐酸煮沸30 min，待其冷却后，真空抽滤去除盐酸，然后用蒸馏水真空抽滤洗涤至PH中性。硅藻土直接用蒸馏水真空抽滤洗涤。吸附介质的选择
(1)SP-Sepharose柱层析与Q-kpharose柱层析分离低聚果糖试验
将预处理过的SP-S印harose树脂装入层析柱，装柱体积40 ml，待树脂沉降后，保持柱温25°C，用超纯水平衡5个柱体积后，将预处理过的发酵液以1 ml/min流速上样于层析柱上，上样体积为40 ml，然后用超纯水流洗，流速为1 ml/min，每5 ml收集一管，HPLC检测， 收集含有低聚果糖的收集液，上样于用超纯水平衡5个柱体积的Q-kpharose柱层析中，用超纯水流洗，流速为1 ml/min，每5 ml收集一管，HPLC检测每管低聚果糖含量，收集含有低聚果糖的收集液，旋转蒸发浓缩至上样前的体积，测其低聚糖的含量、电导和蛋白质含量；
(2)硅藻土与活性炭柱层析分离低聚果糖试验
称取等量的预处理过的硅藻土和活性炭混合后，装入层析柱，装柱体积为40 ml，待其沉降后，保持柱温25°C，用超纯水平衡5个柱体积后，将预处理过的发酵液以1 ml/min流速上样于层析柱上，上样体积为40 ml，然后用超纯水流洗，待电导及A280吸收值均达到稳定后，分别用50 ml的5%、10%、15%和20%乙醇分步洗脱，流速为1 ml/min，每5 ml收集一管，HPLC检测每管低聚果糖含量，收集含有低聚果糖的收集液，旋转蒸发浓缩至上样前的体积，测其低聚糖的含量、电导和蛋白质含量。活性炭与硅藻土比例的选择(1)活性炭与硅藻土比例的静态吸附试验
将预处理过的活性炭与硅藻土分别按照0%、25%、50%、75%、100%比例混合成五组总质量为5 g的吸附剂，分别将它们置于250 ml的锥形瓶中，每组加入50 ml发酵液，25°C，振荡吸附2 h ；用大约6 L超纯水真空抽滤洗涤，去掉无机盐、单糖、二糖；然后用300 ml的20% 乙醇洗脱低聚果糖，使其释放出来，并用超纯水洗涤；收集含有低聚果糖的洗脱液，旋转蒸发仪60°C抽真空浓缩至50 ml, HPLC测定低聚果糖的含量；
(2)柱层析验证试验
称取10 g活性炭预处理后装柱，待其沉降后，保持柱温25°C，用超纯水平衡5个柱体积后，将预处理过的发酵液以1 ml/min流速上样于层析柱上，上样体积为40 ml，然后用超纯水流洗，待电导及A280吸收值均达到稳定后，分别用250 ml的5%、10%、15%和20%乙醇分步洗脱，流速为1 ml/min，每5 ml收集一管，HPLC检测每管低聚果糖变化情况，收集含有低聚果糖的收集液，旋转蒸发浓缩至上样前的体积，测其低聚糖的含量、电导和蛋白质含量，比较100%活性炭柱层析与50%活性炭柱层析吸附效果。吸附温度的选择试验
(1)不同温度下的静态吸附与分离试验
称取5 g预处理的活性炭置于250 ml的锥形瓶中，共五组，每组加入50 ml发酵液，分别置于251、351、451、551和651下振荡吸附2 h ；用大约6 L纯水真空抽滤洗涤，去掉无机盐以及单糖，二糖；然后用300 ml的20%乙醇洗脱低聚果糖，收集含有低聚果糖的洗脱液，用旋转蒸发仪60°C抽真空浓缩至50 ml, HPLC测定低聚果糖的含量；
(2)柱层析分离验证试验
称取10 g活性炭预处理后装柱，待其沉降后，保持柱温35°C，用超纯水平衡5个柱体积后，将预处理过的发酵液以1 ml/min流速上样于层析柱上，上样体积为40 ml，然后用超纯水流洗，待电导及A280吸收值均达到稳定后，分别用250 ml的5%、10%和15%乙醇分步洗脱，流速为1 ml/min，每5 ml收集一管，HPLC检测每管低聚果糖变化情况，收集含有低聚果糖的收集液，旋转蒸发浓缩至上样前的体积，测其低聚糖的含量、电导和蛋白质含量，比较柱温35°C与柱温25°C的柱层析吸附效果。吸附流速选择试验
称取10 g活性炭预处理后装柱，待其沉降后，保持柱温35°c，用超纯水平衡5个柱体积后，将预处理过的发酵液上样于层析柱上，上样体积为40 ml，然后用超纯水流洗，待电导吸收值均达到稳定后，分别用250 ml的5%、10%和15%乙醇分步洗脱，分别以0. 5ml/min、 l.Oml/min和1.5 ml/min流速进行柱层析，HPLC检测每管低聚果糖变化情况，收集含有低聚果糖的收集液，旋转蒸发浓缩至上样前的体积，测其低聚糖的含量、电导和蛋白质含量， 比较流速分别为0.5 ml/minU.O ml/minU. 5 ml/min时柱层析吸附效果。分析测定方法 (1)蛋白质含量测定
取5支干净的试管，加样混勻后，放置2 min，用可见分光光度计在595 nm波长处测其吸光度，根据吸光值和蛋白质浓度绘制标准曲线。取待测样品0.5 ml，加入0.5 ml的蒸馏水和5 ml的考马斯亮蓝G-250溶液，放置2 min后在595 nm波长处测其吸光度，根据吸光值及已绘制的蛋白质标准曲线计算待测样品蛋白质含量；(2)重金属含量检测
将消解罐用硝酸浸泡M h,并用纯水洗涤2次，超纯水洗涤5次，取2 ml分离纯化回收产品，加入到消解罐中，用移液管吸取5 ml硝酸到消解罐中，与回收产品混合，在通风柜中110°C电热板消解30 min，待其冷却后用超纯水定容到20 ml，电感耦合离子质谱测其重金属含量；
(3)总糖检测
取0.01 g待测样品用超纯水定容到25 ml后，取9支干净的试管，加样混勻后，将试管移至沸水中加热10 min，冷水冷却后，用分光光度法在620 nm波长处测其吸光值，根据吸光值和蛋白质浓度绘制标准曲线。取待测样品0.1 ml，加入1.9 ml蒸馏水和8 ml蒽酮-硫酸混合后置于沸水中加热10 min，冷水冷却后，620 nm波长处测其吸光度，根据总糖标准曲线及吸光值计算待测样品的糖浓度；
(4)灰分检测
取洗净的坩埚烘干至恒重，称其重量(Wl )，向坩埚中加入1 g左右的纯化样品烘干至恒重并称重(W2)，将坩埚置于电炉上加热碳化至无烟雾产生，将碳化后的样品置于马弗炉内，550 °C加热5 h，待其冷却后称其重量(W3)，根据公式
fW3 - W^fQN2 - W1)计算其灰分含量。 实施例1 低聚果糖发酵液的制备
选育得到高产虾青素的法夫酵母JMU-MVP14菌株，该菌株发酵虾青素的体积产率达到 150 mg/L，虾青素的细胞产率达到6 mg/g。蔗糖经法夫酵母JMU-MVP14发酵制得的低聚果糖发酵液，具体制备方法如下
将活化的法夫酵母JMU-MVP14取1 ml接种到摇瓶培养基中，22°C，190 r/min培养72 h制得种子液；按6%的接种量将种子液转接到装有5 L发酵培养基的7 L发酵罐中，控制温度22°C、通气量3 L/min,通过调节搅拌转速控制溶氧在30-40% ；用25%氨水自动流加控制PH 6.0;每隔8 h取一次样测其虾青素含量，待虾青素合成达到稳定后，加入蔗糖溶液， 维持PH不变继续发酵2 h取样。在7 L罐中法夫酵母JMU-MVP14合成含有虾青素和低聚果糖的发酵液。法夫酵母JMU-MVP14发酵液在3500 r/min下离心10 min得到上层清液和下层沉淀，下层沉淀即为提取的虾青素。再将上层清液经沸水浴加热15 min灭酶活，在真空抽滤条件下依次通过0.8 μπι、0.45 μ m和0.22 μ m的微滤膜，得到含有低聚果糖的过滤液。本实施例中，利用法夫酵母JMU-MVP14发酵蔗糖，实现在同一批次的发酵过程中同时获得低聚果糖和虾青素，从而进一步提高了该法夫酵母的产业化价值。实施例2
按照实施例1中的方法制得含有低聚果糖的过滤液。离子交换树脂作为吸附介质分离低聚果糖。将预处理过的离子交换树脂(SP-kpharose树脂)装入层析柱，装柱体积为40 ml, 待树脂沉降后，保持柱温25°C，用超纯水平衡5个柱体积后，将按照实施例1中的方法制得含有低聚果糖的过滤液以1 ml/min流速上样于层析柱上，上样体积为40 ml，然后用超纯水流洗，流速为1 ml/min，每5 ml收集一管，用HPLC检测，收集含有低聚果糖的收集液，上样于用超纯水平衡5个柱体积的Q-kpharose柱层析中，用超纯水流洗，流速为1 ml/min，每5 ml收集一管，HPLC检测每管低聚果糖含量，收集含有低聚果糖的收集液，旋转蒸发浓缩至上样前的体积，测其低聚糖的含量、电导和蛋白质含量。测定结果如表1所示。
实施例3
按照实施例1中的方法制得含有低聚果糖的过滤液。
称取等质量的预处理过的硅藻土和活性炭混合后，装入层析柱，装柱体积为40 ml，待其沉降后，保持柱温25°C，用超纯水平衡5个柱体积后，将按照实施例1中的方法制得含有低聚果糖的过滤液以1 ml/min流速上样于层析柱上，上样体积为40 ml，然后用超纯水流洗，待电导值达到稳定后，分别用50 ml的体积分数为5%、10%、15%和20%乙醇分步洗脱， 流速为1 ml/min，每5 ml收集一管，HPLC检测每管低聚果糖含量，收集含有低聚果糖的收集液，旋转蒸发浓缩至上样前的体积，测其低聚糖的含量、电导和蛋白质含量。测定结果如表1所示。
权利要求
1.低聚果糖的分离纯化方法，其特征在于分离纯化步骤包括蔗糖经法夫酵母 JMU-MVP14发酵制得含有低聚果糖和虾青素的发酵液，发酵液经过离心机离心分离，提取出下层虾青素，将上层清液经沸水浴加热灭酶活后再经微滤膜提纯，得到的滤液流经填充吸附介质的层析柱吸附，再用乙醇溶液洗脱吸附介质，将洗脱液蒸发浓缩后得到低聚果糖。
2.根据权利要求1所述的低聚果糖的分离纯化方法，其特征在于所述微滤膜提纯是将上层清液在真空抽滤条件下依次通过0. 8 ym.O. 45 μ m和0.22 μ m的微滤膜过滤。
3.根据权利要求1所述的低聚果糖的分离纯化方法，其特征在于所述吸附介质为离子交换树脂、活性炭、硅藻土、或活性炭与硅藻土的混合物。
4.根据权利要求3所述的低聚果糖的分离纯化方法，其特征在于所述吸附介质为活性炭。
5.根据权利要求1所述的低聚果糖的分离纯化方法，其特征在于所述层析柱吸附的柱温是35°C，所述滤液流经填充吸附介质的层析柱的流速为0. 5 ml/min-1. 5 ml/min。
6.根据权利要求5所述的低聚果糖的分离纯化方法，其特征在于所述滤液流经填充吸附介质的层析柱的流速为0. 5 ml/min。
全文摘要
本发明公开一种低聚果糖的分离纯化方法，其分离纯化步骤包括蔗糖经法夫酵母JMU-MVP14发酵制得含有低聚果糖和虾青素的发酵液，发酵液经过离心机离心分离，提取出下层虾青素，将上层清液经沸水浴加热灭酶活后再经微滤膜提纯，得到的滤液流经填充吸附介质的层析柱吸附，再用乙醇溶液洗脱吸附介质，将洗脱液蒸发浓缩后得到低聚果糖。本发明能够实现在同一批次的发酵过程中同时分离纯化虾青素和低聚果糖，分离操作廉价、简单，获得的低聚果糖产品具有含量高，符合食品卫生要求的优点。
文档编号C12P23/00GK102433370SQ20111029733
公开日2012年5月2日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者倪辉, 李利君, 杜希萍, 杨远帆, 肖安风, 蔡慧农, 黄高凌 申请人:集美大学