专利名称：一种fgfr1基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及ー种FGFRl基因突变检测特异性引物和液相芯片。
背景技术：
成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs)是一组结构相似的多肽类家族，并通过跨膜高亲和カ的成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factorreceptors, FGFRs)发挥作用。FGFR属于受体型蛋白酪氨酸激酶，该家族主要包括FGFRl、FGFR2、FGFR3和FGFR4四位成员。FGFR參与调节细胞増殖、凋亡、迁移、新生血管生成等多个过程。由于作用广泛，FGFR及其他RTK在正常情况下受到严格调控。在肿瘤中，如在乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌等，FGFR激活突变或者配体/受体过表达导致其持续激活，不仅与肿瘤的发生、发展、不良预后等密切相关，并且在肿瘤新生血管生成、肿瘤的侵袭与转移等过程中也发挥重要作用。成纤维细胞生长因子受体I (Fibroblast Growth Factor ReceptorLFGFRl)在创伤愈合、血管形成、组织修复过程中发挥重要作用，本发明针对FGFRl基因的C374T和C754A等两个位点的野生型和突变型，提供了能够单独或并行检测的液相芯片。目前，对FGFRl基因突变进行检测和分析的方法很少，主要有直接测序法和PCR-RFLP分析法，其中最常用的方法有PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检測。再次，以上这些方法都存在着检测通量的局限性，毎次只能检测ー种突变类型，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之ー是提供FGFRl基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并行检测FGFRl基因两种常见基因型C374T和C754A的野生型和突变型。实现上述目的的技术方案如下ー种FGFRl基因突变检测液相芯片，包括有(A).针对FGFRl基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对C374T位点的SEQ ID NO. 5及SEQ ID NO. 6 ;和/或针对C754A位点的 SEQ IDN0. 7 及 SEQ ID NO. 8 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 4 ；(B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 12，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
优选地，所述扩增引物为针对C374T位点的SEQ ID NO. 13及SEQ ID NO. 14 ;和/或针对 C754A 位点的 SEQ ID NO. 15 及 SEQ ID NO. 16。优选地，所述ASPE引物为针对C374T位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 5组成的序列以及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 6组成的序列；和/或针对C754A位点的由SEQID NO. 3和SEQ ID NO. 7组成的序列以及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 8组成的序列。本发明的另一目的是提供用于FGFRl基因突变检测的特异性引物。实现上述目的的技术方案如下用于FGFRl基因突变检测的特异性引物，其为针对C374T位点的SEQ ID NO. 5及SEQ IDN0. 6 ;和 / 或针对 C754A 位点的 SEQ ID NO. 7 及 SEQ ID NO. 8。
本发明的主要优点在于1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100%。且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的FGFRl基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。3.本发明的检测方法步骤简单，2种突变位点检测可通过一步PCR即可完成2条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施例方式实施例1FGFRl基因突变检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对FGFRl基因两种常见基因型C374T和C754A的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“ tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE弓丨物序列如下表所示表IFGFRl基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特异性引物序列)
权利要求
1.一种FGFRl基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有 (A).针对FGFRl基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对C374T位点的SEQ ID NO. 5及SEQ ID NO. 6 ;和/或针对C754A位点的 SEQ IDNO. 7 及 SEQ ID NO. 8 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 4 ； (B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 12，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的FGFRl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对 C374T 位点的 SEQ ID NO. 13 及 SEQ ID NO. 14 ;和 / 或针对 C754A 位点的 SEQ ID NO. 15及 SEQ IDNO. 16。
3.根据权利要求1所述的FGFRl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为针对C374T位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 5组成的序列以及由SEQ ID NO. 2和SEQID NO. 6组成的序列；和/或针对C754A位点的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 7组成的序列以及由SEQID NO. 4和SEQ ID NO. 8组成的序列。
4.根据权利要求1所述的FGFRl基因突变检测液相芯片，其特征是， (A)所述ASPE引物为:针对C374T位点的由SEQIDNO.1和SEQ IDNO. 5组成的序列以及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 6组成的序列；和针对C754A位点的由SEQ ID NO. 3和SEQIDNO. 7组成的序列以及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 8组成的序列； (B)有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 12，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C)所述扩增引物为:针对C374T位点的SEQID NO. 13及SEQ ID NO. 14 ;和针对C754A位点的 SEQ ID NO. 15 及 SEQ ID NO. 16。
5.根据权利要求1-4任一项所述的FGFRl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10个T。
6.用于FGFRl基因突变检测的特异性引物，其特征是，所述特异性引物序列为针对C374T 位点的 SEQ ID NO. 5 及 SEQ ID NO. 6 ;和 / 或针对 C754A 位点的 SEQ ID NO. 7 及 SEQID NO. 8。
全文摘要
本发明公开了一种FGFR1基因检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为针对C374T位点的SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6；和/或针对C754A位点的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。
文档编号C12Q1/68GK103031368SQ20111030088
公开日2013年4月10日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者许嘉森, 吴诗扬 申请人:广州益善生物技术有限公司