专利名称：直接从人成纤维细胞诱导产生多巴胺样神经元的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及诱导产生多巴胺样神经元的方法，尤其涉及直接将人的成纤维细胞转变成能产生神经递质多巴胺的神经元样细胞的方法及其用途。
背景技术：
现有技术公开了神经递质多巴胺在维持人的正常运动和动作协调方面起重要作用，当产生多巴胺的神经元发生凋亡时，多巴胺的产生减少，患者将出现肌肉震颤，动作不协调甚至运动障碍，医学上称为帕金森氏病。目前还没有有效的药物能治疗帕金森氏病。有人尝试移植能产生多巴胺的神经元，可以明显减轻患者的症状。本领域公知，由于神经元是终末分化细胞，不能通过细胞分裂增殖的方法获得，因此，移植细胞来源于其他个体，如因外伤或疾病死亡的捐献者或胎儿。这类细胞很难获得，即使能够得到，由于来自其他个体，会引发免疫排斥反应，最终仍将导致移植细胞凋亡或死亡，治疗失败。因此，能从患者自体来源的细胞诱导出能产生多巴胺的神经细胞的方法显得非常重要。如何从自体来源的细胞诱导出能产生多巴胺的神经细胞？有关研究通常尝试以下方法一是从来源于自体的神经干细胞诱导产生，由于从自体获得神经干细胞也是非常困难的，因此，实际应用价值不大；二是从自体来源的成纤维细胞诱导产生多能干细胞，再诱导多能干细胞向多巴胺神经元分化。然而，目前的方法还不能完全诱导多能干细胞定向分化，值得注意的是，未完全分化的干细胞有产生畸胎瘤的危险！实际应用也存在限制。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷与不足，提供一种诱导产生多巴胺样神经元的方法，尤其涉及直接将人成纤`维细胞转变成能产生神经递质多巴胺的神经元样细胞的方法。本发明的另一目的是提供所述方法获得的神经元样细胞在制备减轻帕金森氏病大鼠的运动障碍制剂中的用途。本发明的方法，可以绕过现有技术中所涉及的多能干细胞的环节，直接从来源于自体的成纤维细胞诱导能产生多巴胺的神经细胞，该直接诱导得到的神经细胞用于帕金森氏病大鼠动物模型，可以明显减轻帕金森氏病大鼠的运动障碍。具体而言，本发明的直接从人成纤维细胞诱导产生多巴胺样神经元的方法，其特征在于，其包括I)选择诱导人成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞的转录因子及其组合，本发明中，可以参与直接将人的成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞的8个转录因子，它们是Mashl, Ngn2, Sox2, NurrI, Pitx3, LmxlA, LmxlB 和 ENl,本发明中，优选Mashl, Ngn2, Sox2, Nurrl和Pitx3的组合,更优选Mashl, Ngn2或Sox2转录因子或及其与其他因子的组合。
表I是八种参与诱导人成纤维细胞转变成多巴胺神经细胞的转录因子。表I
权利要求
1.直接从人成纤维细胞诱导产生多巴胺样神经元的方法，其特征在于，其包括步骤 1)选择诱导人成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞的转录因子及其组合； 2)构建携带转录因子病毒载体及介导转录因子转移； 3)将步骤2)的病毒载体感染人成纤维细胞及多巴胺样神经细胞的鉴定。
2.按权利要求1所述的直接从人成纤维细胞诱导产生多巴胺样神经元的方法，其特征在于，所述步骤I)的转录因子及其组合是，Mashl, Ngn2, Sox2, NurrI, Pitx3, Lmx 1A, LmxlB和ENl及其组合。
3.按权利要求1所述的直接从人成纤维细胞诱导产生多巴胺样神经元的方法，其特征在于，所述步骤I)的转录因子及其组合是Mashl, Ngn2, Sox2, Nurrl和Pitx3的组合。
4.按权利要求1所述的直接从人成纤维细胞诱导产生多巴胺样神经元的方法，其特征在于，所述步骤I)的转录因子及其组合是Mashl，Ngn2或Sox2转录因子或其与其他因子的组合。
5.按权利要求1所述的直接从人成纤维细胞诱导产生多巴胺样神经元的方法，其特征在于，所述步骤2)的携带转录因子病毒载体是携带Mashl, Ngn2, Sox2, NurrI, Pitx3,Lmx 1A, LmxlB或ENl编码基因的慢病毒载体，或携带Mashl, Ngn2, Sox2, Nurrl或Pitx3编码基因的腺病毒载体。
6.按权利要求1所述的直接从人成纤维细胞诱导产生多巴胺样神经元的方法，其特征在于，所述步骤3)的病毒载体感染人成纤维细胞及多巴胺样神经细胞的鉴定通过下述方法 用构建的携带转录因子的病毒感染人离体成纤维细胞后，将感染过的人成纤维细胞接种到由失活的小鼠成纤维细胞组成的饲养层细胞上或细胞培养液培养，存活的人成纤维细胞，经免疫荧光染色法鉴定所述细胞表达神经元标志物Tujl以及与多巴胺产生有关的酶。
7.按权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的与多巴胺产生有关的酶包括，酪氨酸羟化酶，多巴脱羧酶和多巴胺转运体。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及诱导产生多巴胺样神经元的方法，尤其涉及直接将人的成纤维细胞转变成能产生神经递质多巴胺的神经元样细胞的方法及其用途。本方法包括步骤选择诱导人成纤维细胞转变成能产生多巴胺的神经细胞的转录因子及其组合；构建携带转录因子病毒载体及介导转录因子转移；构建的病毒载体感染人成纤维细胞及多巴胺样神经细胞的鉴定。本发明方法可以绕过现有技术中所涉及的多能干细胞的环节，直接从来源于自体的成纤维细胞诱导能产生多巴胺的神经细胞；直接诱导得到的神经细胞用于帕金森氏病大鼠动物模型，可以明显减轻帕金森氏病大鼠的运动障碍。
文档编号C12N5/10GK103031335SQ20111030449
公开日2013年4月10日 申请日期2011年10月9日 优先权日2011年10月9日
发明者李川源, 刘新建, 李芳 , 黄倩 申请人:李川源, 黄倩