专利名称：表达牛γ干扰素的Flp-In-293细胞系及其建立方法
技术领域：
本发明涉及表达牛Y干扰素的Flp-h-293细胞系，其含有编码牛γ干扰素的基因。该细胞系分泌的牛Y干扰素具有极高的比活力和稳定性，可用作牛感染性疾病的临床治疗和相关诊断方法的研究。
背景技术：
γ干扰素(IFN- y )主要是由被有丝分裂原或特异性抗原刺激而活化的⑶4+ Thl 细胞、CD8+ T细胞及NK细胞等产生的细胞因子，具有广泛抗病毒、抗肿瘤活性以及免疫调节功能，如活化巨嗜细胞、提高MHC I类和II类分子的表达、促进抗原提呈等，是机体防御系统的重要组成部分。研究表明外源性的IFN-Y既可以作为药物用于感染性疾病或肿瘤等的治疗，又可以作为免疫佐剂，增强疫苗的免疫效果；内源性IFN-Y水平的高低在很大程度上可以反映机体的细胞免疫状态，而抗原特异性的IFN-Y反应则可以作为机体针对某种特定外来抗原的细胞免疫状态的指标。牛Y干扰素基因在正常情况下处于封闭状态，必须在各种特异性或非特异性刺激因子的刺激下才能表达，利用传统的方法从牛血液中提取和纯化牛Y干扰素，过程繁琐且含量很低，无法满足实际使用的需求，因此要获得高效价廉的牛Y干扰素，须通过基因工程技术大量制备和生产，使其在动物中的应用成为可能。大肠杆菌表达系统表达的牛Y 干扰素蛋白不能进行翻译后的修饰等过程，因此其空间结构及生物活性与天然抗原有较大差别；多以包涵体或部分可溶的形式存在，使其纯化复性困难；还有内毒素难以去除等诸多缺陷，因此在临床应用中受到一定程度的限制。杆状病毒载体表达系统在病毒感染后期， 由于细胞裂解，胞内物质的释放会导致目的蛋白的纯化困难；释放的一些水解酶也会降解重组蛋白；加工修饰体系与哺乳动物细胞也存在一定差异。哺乳动物细胞表达的牛Y干扰素与其他表达系统相比，可以对Y-干扰素蛋白进行正确的折叠加工及糖基化、二硫键的修饰，因此比活性更高，稳定性更好，为II型干扰素相关的理论研究、临床应用及诊断方法的研究提供了重要的生物材料，具有重要的基础研究和实际应用意义。本研究利用Flp-h-293为稳定转染宿主细胞系，该细胞系含有一个位于转录活性基因座的FRT位点。带有单一 FRT位点的真核表达质粒pcDNA5/FRT-preBoIFN- y -FLAG 与Flp重组酶表达载体pOG44共转染Flp-h-293细胞，在Flp重组酶介导下真核表达质粒与细胞系中的FRT位点发生Flp/FRT位点特异性重组，可使BoIFN- γ基因整合到细胞基因组中相同的活性转录染色质区，在SV40早期启动子和起始密码子ATG的控制下得以表达。
发明内容
本发明的目的是建立高效稳定表达牛Y干扰素的Flp-h-293细胞系。本发明所述的细胞系，是以Flp-h-293为宿主细胞，在Flp-h_293细胞FRT位点通过Flp/FRT位点特异性重组，使BoIFN- γ基因整合到Flp-h_293细胞基因组中而获得。 所以本发明所述的表达牛Y干扰素的Flp-h-293细胞系，是含有编码牛γ干扰素基因BoIFN-Y的Flp4n-293细胞系，命名为Bi。本发明所述的细胞系Bi，还可以在所述编码牛γ干扰素的基因之前加入Kozak序列。本发明所述的细胞系通过以下方法建立
本发明根据Flp-h 系统，将牛、干扰素的开放阅读框(ORF)基因克隆至真核稳定表达载体pcDNA5/FRT，与重组酶表达载体pOG44共转染Flp-In-293细胞，经Hygromycin B 抗性筛选和亚克隆，获得可稳定表达重组牛Y干扰素的Flp-h-293细胞克隆Bi。本发明中细胞系Bl分泌表达的重组牛、干扰素具有近似天然牛、干扰素的空间结构与生物活性，具有重要的基础研究和实际应用价值。
图1.重组质粒pCR2. l-preBoIFN-γ双酶切鉴定图
1. λ -EcoT14 DNA 标记；2. DL2000 DNA 标记；3. Kpn I ,Xba I 双酶切鉴定 pCR2. 1-preBoIFN-y。图2.重组质粒pcDNA3. 1-preBoIFN- y -FLAG双酶切鉴定图
1. λ -EcoT14 DNA 标记；2. DL2000 DNA 标记；3. Kpn I ,Xba I 双酶切鉴定 pcDNA3. 1-preBoIFN-y-FLAG0图 3.重组质粒 pcDNA5/FRT-preBoIFN- y -FLAG 双酶切鉴定图
1. λ -EcoT14 DNA 标记；2. DL2000 DNA 标记；3. Kpn I ,Apa I 双酶切鉴定 pcDNA5/ FRT-preBoIFN-y-FLAG。图4.间接免疫荧光鉴定瞬时转染C0S-1细胞
A, C.抗BoIFN-γ单抗5G4检测C0S-1细胞；B，D.抗FLAG单抗检测C0S-1细胞。图5.夹心ELISA方法检测重组FLAG-BoIFN-γ表达。图6.胞内染色分析重组FLAG-BoIFN-γ表达
A.抗BoIFN-γ单抗5G4检测Bl细胞；B.抗FLAG单抗检测Bl细胞；C.抗BoIFN-γ 单抗5G4检测Flp-In-293细胞；D.抗FLAG单抗检测Flp-In-293细胞。图7.重组细胞Bl的β -半乳糖苷酶活性分析。图8.重组细胞Bl的Zeocin抗性分析。
具体实施例方式一、牛Υ干扰素基因的克隆与重组质粒构建 1.引物的设计与合成
参照 GenBank 中 BoIFN-γ cDNA 序列(Accession No. I\C9867)设计引物，上游引物为 5，-AA GGT ACC ATG GCA ATG AAA TAT ACA AGC TA- 3，(SEQ ID NO :1)，下游引物为 5，-TA TCT AGA CGT TGA TGC TCT CCG GC- 3，(SEQ ID NO :2)，上下游引物分别带有 Kpn I和损a I位点，上游引物中包含了起始密码子ATG和真核表达所必需的Kozak序列 (一 3位G/A，+ 4位G，即G/ANN_)，下游引物去除了 BoIFN- γ基因终止密码子。以经人刀豆素A刺激诱导的奶牛脾脏淋巴细胞总RNA中扩增出牛Y-干扰素 cDNA为模板，以SEQ ID NO :1和2的序列为扩增引物，用高保真酶PCR扩增preBoIFN- γ(含信号肽的BoIFN-γ基因序列)基因片段，预期扩增的片段大小为520bp (SEQ ID NO 3)，将扩增的preBoIFN-γ PCR产物克隆至pCR2. 1载体(Invitrogen公司)，重组质粒 PCR2. 1-preBoIFN-y酶切鉴定结果如图1所示，泳道3上下两个条带分别为载体pCR2. 1和目的片段preBoIFN- γ，大小分别约为3900bp和506bp (SEQ ID NO :4)，与预期相符，且测
序结果正确。.重组质粒pcDNA3. 1-preBoIFN- y -FLAG 的构建与鉴定
用 Kpn I 和损a I 双酶切质粒 pCR2. 1-preBoIFN-y 及载体 pcDNA3. I-FLAG (Invitrogen公司)，经过电泳、切胶回收后，通过T4 DNA连接酶连接，获得瞬时真核表达质粒 pcDNA3. 1-preBoIFN-γ-FLAG。FLAG 片段长 26bp，序列如下C a 1)5，-GAC TAT AAG GAC GAT GAT GAC AAA TA - 3，(.Apa I ) (SEQ ID NO :5)，前 24 个碱基编码 DYKDDDDK 8 个氨基酸，最后两个碱基TA与如a I位点第一个G构成终止密码子，重组质粒酶切鉴定结果如图2所示，泳道3上下两个条带分别为载体pcDNA3. 1和目的片段preBoIFN- γ，大小分别约为M^bp和506bp (SEQ ID NO :4)，与预期相符，且测序结果正确。.重组质粒pcDNA5/FRT-preBoIFN-γ-FLAG 的构建与鉴定
用 Xba I 和如a I 双酶切质粒 pcDNA3. 1-preBoIFN- y -FLAG 及载体 pcDNA5/FRT anvitrogen公司)，经过电泳、切胶回收后，通过T4 DNA连接酶连接，获得稳定真核表达质粒pCDNA5/FRT-preB0IFN- y -FLAG,酶切鉴定结果如图3所示，泳道3上下两个条带分别为载体 pcDNA5/FRT 和目的片段 preBoIFN- y -FLAG,大小分别约为 5070bp 和 542bp (SEQ ID NO :6)，与预期相符，且测序结果正确。二、瞬时转染及鉴定 1.瞬时转染
转染前Mh，接种C0S-1细胞(ATCC)于6孔板中，5 X IO5细胞/孔；转染前将0pti_MEM、 无血无抗DMEM于37 °C水浴预热，质粒、Lipofectamine置于冰浴；分别加入重组质粒 pcDNA3. 1-preBoIFN- y -FLAG、空载体质粒 pcDNA3. I-FLAG 各 1 μ g 至含 Opti-ΜΕΜ 的 1. 5mL指形管中至总体积100 μ L，振荡混勻；搅拌式加入6 μ L Lipofectamine至含94 μ L Opti-MEM的2mL指形管中；分别将质粒/Opti-ΜΕΜ搅拌式加入Lipofectamine/Opti-MEM 中，静置25min后搅拌式加入0. 6mL Opti-ΜΕΜ ；将转染试剂加入预先用无血无抗DMEM轻洗一遍的细胞中，置37°C 5% CO2培养箱证；吸去培养上清，每孔加入2mL完全培养基(含 100 μ g/mL Zeocin),置培养箱继续培养；转染4 后检测目的蛋白表达情况。.间接免疫荧光鉴定
吸去瞬时转染细胞培养上清，使用500yL PBS洗一遍，加入300 μ L _20°C预冷的甲醇于-20°C固定IOmin ；用300 μ L PBS漂洗3次，加入现配的抗BoIFN- γ单抗、抗FLAG单抗 (用含m BSA的PBS 1 1000稀释)置37°C水浴锅孵育Ih ；使用300 μ L PBS漂洗3次，加入 FITC标记的羊抗鼠IgG (用PBS 1:200稀释)置37°C水浴锅Ih ；用300 μ L PBS漂洗3次， 再用300 μ L超纯水漂洗2次，加入300 μ L 50%甘油/0. 5Μ碳酸盐缓冲液封片，在荧光显微镜下观察，结果如图4所示，重组质粒pcDNA3. 1-preBoIFN- y -FLAG转染的C0S-1细胞有绿色荧光，而空载体转染的C0S-1细胞没有绿色荧光。三、稳定转染及鉴定
1. Hygromycin B工作浓度的确定在6孔培养板中加入适宜数量的细胞贴壁过夜，第二天换液加入含不同浓度 Hygromycin B的完全培养基，每3-4天补充选择性培养基，观察存活细胞的百分率，1-2周后确定Hygromycin B最佳工作浓度在100-150 μ g/mL之间，最终确定为120 μ g/mL。稳定转染及亚克隆纯化
根据^witrogen公司的Flp-h System使用说明书，将重组酶表达载体pOG44 (Invitrogen 公司)与真核表达载体 pcDNA5/FRT-preBoIFN_ y -FLAG 共转染 Flp4n_293 细胞(Invitrogen公司)，加入完全DMEM培养基，置37°C 5% CO2培养箱继续培养。转染4 后消化收获细胞，用含120 μ g/mL Hygromycin B的完全培养基稀释后于若干细胞培养皿中进行抗性筛选，每4-5天换液一次，3-4周后出现由单个细胞长成的肉眼可见的克隆。待克隆长至适宜大小，吸去选择性培养基，吸取少量胰酶-EDTA点于单个细胞克隆上，停顿几秒进行消化，待细胞团从细胞培养皿上松脱时即吸回消化液，转移到预先加入选择性培养基的6孔板中以终止消化，并用移液器吹打使细胞分散均勻，进行扩大培养并采用有限稀释法进行亚克隆获得重组细胞Bi。检测
使用胰酶-EDTA分别消化、收获Bl细胞、Flp-Inj93细胞，然后接种于6孔板中，5 X IO5 细胞/孔；置37°C 5% CO2培养箱刺激培养48h;收集细胞培养上清，使用胰酶消化细胞，加入适量PBS将细胞悬浮并进行反复冻融裂解；将收集的细胞上清、裂解上清使用B0VIGAM Mycobacterium bo vis Gamma Interferon Test Kit for cattle (Prionics 公司)检测重组FLAG-BoIFN-γ的表达情况，具体操作参照试剂盒说明书进行。结果如图5所示，细胞克隆Bl可以表达重组FLAG-BoIFN- γ，并且主要以分泌形式表达，而在阴性对照Flp-h_293 细胞培养上清和裂解上清中均未检出重组FLAG-BoIFN- γ，氨基酸序列如SEQ ID NO 7所
7J\ ο胞内染色检测
使用胰酶-EDTA分别消化、收获Bl和Flp-h-293细胞，然后接种于6孔板中，5 X IO5细胞/孔；加入阻断剂BFA，置37°C 5% CO2培养箱刺激培养证；吸去培养上清，每孔加入新鲜选择培养基，置37°C 5% CO2培养箱继续培养若干小时；吸去细胞上清，加入适量PBS将细胞吹起加入1. 5mL指形管中；1500rpm，4°C离心5min，使用PBS洗两次，加入固定液，室温固定15min ；3000rpm，4°C离心5min，使用PBS洗两次，加入破膜剂，室温作用15min ；3000rpm, 4°C离心5min，使用PBS洗两次，加入现配的抗BoIFN- γ单抗5G4、抗FLAG单抗(用含2%BSA 的PBS 1:200稀释)，室温作用30min ；3000rpm，4°C离心5min，使用PBS洗两次，加入现配的 FITC标记的羊抗鼠IgG (用含2%BSA的PBS 1:200稀释)，室温作用30min ；3000rpm，4°C离心5min，使用PBS洗两次，加入100 μ L PBS重悬细胞，上机检测，结果如图6所示，在进行阻断后，可以在Bl细胞克隆胞内检测到FLAG-BoIFN-γ的表达。β -半乳糖苷酶活性分析及kocin抗性分析
按照hvitrogen公司β -Gal Staining Kit说明书进行β _半乳糖苷酶活性分析。用胰酶-EDTA分别消化Bl和Flp-h-293细胞，加入选择培养基将细胞悬浮并进行计数，加入适量细胞于M孔板，置37°C培养箱继续培养贴壁12h ；吸去M孔板中细胞培养上清，使用 250 μ L PBS洗一遍；每孔加入300 μ L固定液(含21甲醛/0. 2%戊二醛的PBS溶液)室温固定 IOmin ；固定的同时配染色液溶液A (400mM铁氰化钾)、溶液B(400mM氰亚铁酸钾)、溶液C(400mM 氯化镁)各 2. 5μ L，含 20mg/mL Χ-gal 的 DMF (N-N-二甲基甲酰胺)溶液 12. 5 μ L， PBS 230 μ L，混勻；吸去固定液，使用250 μ L PBS洗两遍，每孔加入250 μ L染色液，置37°C 培养箱0. - 后，在倒置显微镜下观察染色情况。结果如图7所示，Flp-h-293细胞全部被染成蓝色，细胞Bl没有被染成蓝色，即细胞Bl不再具有半乳糖苷酶活性。Zeocin抗性分析在M孔板中进行，用胰酶-EDTA分别消化Bl和Flp-h_293细胞，加入培养基(含100 μ g/mL Zeocin，不含Hygromycin B)将细胞悬浮并进行计数后，加入适量细胞于M孔板，置37°C培养箱继续培养，3、天后观察细胞生长情况。结果如图8所示，细胞Bl不再具有kocin抗性，在含100 μ g/mL Zeocin的培养基中不能生长。四、抗病毒活性滴定
采用微量细胞病变抑制法测定细胞培养上清的抗病毒活性。用胰酶-EDTA消化MDBK 细胞，加入完全DMEM培养基将细胞悬浮并进行计数，加入适量细胞于96孔板，置37°C培养箱继续培养贴壁12h ；吸去上清，将含重组BoIFN-γ的293细胞培养上清(不含Hygromycin B)使用维持液作倍比稀释，100 μ L/孔，置37°C培养箱继续培养Mh ；吸去细胞培养上清， 各孔加入100 TCID50的VSV, 100 μ L/孔；置37°C培养箱吸附2h后吸去上清，加入维持液， 100 μ L/孔，置37°C培养箱培养，观察细胞病变情况。以每mL干扰素样品的最高稀释度仍能保护半数细胞(50%)免受病毒攻击的稀释度的倒数值定义为1个干扰素单位(U)。结果显示，构建的Flp-h-293细胞系Bl表达的重组FLAG-BoIFN- γ具有较高抗病毒活性，达到 1.024 X IO4 U/mL。
权利要求
1.一种表达牛Y干扰素的细胞系Bi，其特征在于是含有编码牛γ干扰素基因 BoIFN- γ 的 Flp-In-293 细胞系。
2.根据权利要求1所述的细胞系Bi，其特征在于在所述编码牛Y干扰素的基因之前有Kozak序列。
3.一种建立权利要求1所述细胞系Bl的方法，包括以下步骤将序列正确的 preBoIFN- γ片段构建成重组质粒pcDNA5/FRT-preBoIFN- y -FLAG,采用脂质体转染法将重组质粒pcDNA5/FRT-preBoIFN- y -FLAG与重组酶表达载体pOG44共转染Flp-In-293细胞，使用含120yg/mL Hygromycin B的DMEM培养基进行阳性克隆筛选，扩大培养后采用有限稀释法进行亚克隆，通过鉴定后获得重组细胞系。
全文摘要
本发明涉及表达牛γ干扰素的Flp-In-293细胞系，该细胞系命名为B1，含有编码牛γ干扰素的基因。构建细胞系B1的方法是将序列正确的preBoIFN-γ片段构建成重组质粒pcDNA5/FRT-preBoIFN-γ-FLAG，采用脂质体转染法将重组质粒pcDNA5/FRT-preBoIFN-γ-FLAG与重组酶表达载体pOG44共转染Flp-In-293细胞，使用含120μg/mLHygromycinB的DMEM培养基进行阳性克隆筛选，扩大培养后采用有限稀释法进行亚克隆，通过鉴定后获得重组细胞系。细胞系B1分泌的牛γ干扰素具有极高的比活力和稳定性。
文档编号C12N5/10GK102321589SQ20111030671
公开日2012年1月18日 申请日期2011年10月10日 优先权日2011年10月10日
发明者孙林, 徐正中, 殷月兰, 潘志明, 焦新安, 耿士忠, 陈祥, 黄金林 申请人:扬州大学