专利名称：一种提高嗜酸乳杆菌冻干存活率的方法
技术领域：
本发明属于嗜酸乳杆菌制品生产技术领域，涉及一种提高嗜酸乳杆菌冻干存活率的方法。
背景技术：
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)属乳杆菌科中的乳杆菌属，形态呈细长杆状，细胞大小一般为0. 6 0. 9*1. 5 6. 0 μ m，成单、成双或者2_3个成短链排列。无鞭毛，不运动，革兰氏染色阳性，兼性厌氧，天然地存在于人和动物的胃肠道，人的口腔、阴道及传统的发酵乳中。最适生长温度为35°C 38°C，20°C以下不生长，最高生长温度43°C 48°C，耐热性差，能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖进行同型发酵产生DL型乳酸。嗜酸乳杆菌是乳制品及其制剂中常用的益生菌之一，其具有缓解乳糖不耐症及肠易激综合症，预防腹泻或便秘，调解人体肠道菌群平衡，降低血胆固醇，增强机体免疫力，抑制肿瘤产生等功能，目前已广泛用于功能性乳制品、保健食品及微生态调节剂的生产，因此制备双歧杆菌菌粉做为发酵剂或者保健食品的原料很有必要。目前嗜酸乳杆菌菌粉的制备主要采用真空冷冻干燥方法，但在冷冻干燥过程中， 嗜酸乳杆菌要经受冷冻和干燥两种激烈因素的作用，导致菌体死亡。目前国内对嗜酸乳杆菌冻干菌粉的研究主要集中在制备过程中冻干保护剂的筛选方面，并获得了各种冻干保护剂配方，但没有通过亚致死处理提高嗜酸乳杆菌冻干存活率的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高嗜酸乳杆菌冻干存活率的方法，该方法可解决嗜酸乳杆菌在冻干过程中存在的冻干存活率低，活菌数少的问题。为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案将嗜酸乳杆菌在MRS肉汤中于37°C培养18h，终止培养后对嗜酸乳杆菌进行亚致死处理，取样测活菌数，然后在4°C、7000rpm离心10-15min，弃去上清液得嗜酸乳杆菌菌泥，在嗜酸乳杆菌菌泥中加入菌泥质量的10-20%脱脂乳和菌泥质量80-90%、pH6. 8的磷酸缓冲液后在-40°C下预冻8-12h，然后置于冷冻干燥机中于温度-50-60°C，真空度为 4-6Pa下冻干18-24h，即得嗜酸乳杆菌菌粉。所述脱脂乳和磷酸缓冲液的总质量与嗜酸乳杆菌菌泥的质量相等。所述亚致死处理是指冷休克。所述冷休克是指将嗜酸乳杆菌在8-10°C静置0. 5-1. 5h。
所述亚致死处理是指热休克。所述热休克是指将嗜酸乳杆菌在38-42°C静置lh。所述亚致死处理是指酸休克。所述酸休克是指用硫酸调节培养液的pH为4. 0-5. 5后使嗜酸乳杆菌于5_8°C静置 30mino
本发明所述提高嗜酸乳杆菌冻干存活率的方法将嗜酸乳杆菌先经亚致死处理，使嗜酸乳杆菌在逆境中诱导合成冷休克蛋白、热休克蛋白或改变细胞膜脂肪酸组成，从而提高嗜酸乳杆菌在后续冻干过程中的抵抗力，提高冻干存活率及菌粉活菌数。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明。本发明的构思是这样的将嗜酸乳杆菌培养液先经冷休克、热休克或酸休克处理， 使嗜酸乳杆菌在逆境中诱导合成冷休克蛋白、热休克蛋白或改变细胞膜脂肪酸组成，从而提高嗜酸乳杆菌在后续冻干过程中的抵抗力，提高冻干存活率及菌粉活菌数。具体方法如下(1)首先将嗜酸乳杆菌在MRS肉汤中37°C培养18h，然后终止培养，并将培养液在 8-10°C静置0. 5-1. 5h，取样测活菌数，然后在4°C，7000rpm离心10min-15min，弃去上清液， 获得嗜酸乳杆菌菌泥，在菌泥加入脱脂乳和磷酸缓冲液后在-40°C下预冻8-12h，然后置于冷冻干燥机中进行冻干，在温度-50-60°C，真空度为4-6Pa下冻干18_24h，即可获得嗜酸乳杆菌菌粉。(2)首先将嗜酸乳杆菌在MRS肉汤中37°C培养18h，然后终止培养，并将培养液在38-42°C静置lh，取样测活菌数，然后在4°C，7000rpm离心lOmin，弃去上清液，获得嗜酸乳杆菌菌泥，在菌泥加入脱脂乳和磷酸缓冲液后在-40°C下预冻8-12h，然后置于冷冻干燥机中进行冻干，在温度-50-60°C，真空度为4-6Pa下冻干18_24h，即可获得嗜酸乳杆菌菌粉。(3)首先将嗜酸乳杆菌在MRS肉汤中37°C培养18h，然后用硫酸将培养液的pH调至 4. 0-5. 5，5-8°C静置30min，取样测活菌数，然后在4°C，7000rpm离心lOmin，弃去上清液，获得嗜酸乳杆菌菌泥，在菌泥加入脱脂乳和磷酸缓冲液在-40°C下预冻8-12h，然后置于冷冻干燥机中进行冻干，在温度-50-60°C，真空度为4-6Pa下冻干18_24h，即可获得嗜酸乳杆菌菌粉。实施例1-1将MRS肉汤在118°C下灭菌15min，冷却至室温，然后按4% (V/V)接种量接入嗜酸乳杆菌，37°C恒温培养18h，然后将培养液在9°C静置l.Oh，取样测活菌数，然后在4°C， 7000rpm离心lOmin，弃去上清液，获得嗜酸乳杆菌菌泥，称重菌泥，加入菌泥重量20% (W/ W)的脱脂乳粉，再加入菌泥重量80% (W/W)的pH6.8的磷酸缓冲液，然后在-40°C下预冻8h，然后置于冷冻干燥机中进行冻干，4-6Pa、-50°C下冻干24h，即可获得嗜酸乳杆菌菌粉，其冻干存活率为70.45% (对照组为46. 11% )，活菌数为2. 1 X lO^cfu/g ((对照组为 1. 10X10ncfu/g)) ο实施例1-2将MRS肉汤在118°C下灭菌15min，冷却至室温，然后按4% (V/V)接种量接入嗜酸乳杆菌，37°C恒温培养18h，然后将培养液在8°C静置0. 5h，取样测活菌数，然后在4°C， 7000rpm离心15min，弃去上清液，获得嗜酸乳杆菌菌泥，称重菌泥，加入菌泥重量10% (W/ W)的脱脂乳粉，再加入菌泥重量90% (W/W)的pH6.8的磷酸缓冲液，然后在-40°C下预冻 12h，然后置于冷冻干燥机中进行冻干，6Pa、-60°C下冻干21h，即可获得嗜酸乳杆菌菌粉。实施例1-3将MRS肉汤在118°C下灭菌15min，冷却至室温，然后按4% (V/V)接种量接入嗜酸乳杆菌，37°C恒温培养18h，然后将培养液在10°C静置1. 5h，取样测活菌数，然后在4°C，7000rpm离心llmin，弃去上清液，获得嗜酸乳杆菌菌泥，称重菌泥，加入菌泥重量16% (W/ W)的脱脂乳粉，再加入菌泥重量84% (W/W)的pH6.8的磷酸缓冲液，然后在-40°C下预冻 llh，然后置于冷冻干燥机中进行冻干，4Pa、-52°C下冻干18h，即可获得嗜酸乳杆菌菌粉。实施例2-1将MRS肉汤在118°C下灭菌15min，冷却至室温，然后按4% (V/V)接种量接入嗜酸乳杆菌，37°C恒温培养18h，然后将培养液在39°C静置1. 0h，取样测活菌数，然后在4°C， 7000rpm离心lOmin，弃去上清液，获得嗜酸乳杆菌菌泥，称重菌泥，加入菌泥重量15% (W/ W)的脱脂乳粉，再加入菌泥重量85% (W/W)的pH6.8的磷酸缓冲液，然后在-40°C下预冻 12h，然后置于冷冻干燥机中进行冻干，4-6Pa、-50°C下冻干20h，即可获得嗜酸乳杆菌菌粉，其冻干存活率为84. 25% (对照组为49. 64% ),活菌数为2. 61 X lO^cfu/g(对照组为 1. 13X10ncfu/g)。实施例2-2将MRS肉汤在118°C下灭菌15min，冷却至室温，然后按4% (V/V)接种量接入嗜酸乳杆菌，37°C恒温培养18h，然后将培养液在38°C静置1. Oh，取样测活菌数，然后在4°C， 7000rpm离心13min，弃去上清液，获得嗜酸乳杆菌菌泥，称重菌泥，加入菌泥重量20% (W/ W)的脱脂乳粉，再加入菌泥重量80% (W/W)的pH6.8的磷酸缓冲液，然后在-40°C下预冻 9h，然后置于冷冻干燥机中进行冻干，6Pa、-52°C下冻干18h，即可获得嗜酸乳杆菌菌粉。实施例2-3将MRS肉汤在118°C下灭菌15min，冷却至室温，然后按4% (V/V)接种量接入嗜酸乳杆菌，37°C恒温培养18h，然后将培养液在42°C静置1. 0h，取样测活菌数，然后在4°C， 7000rpm离心15min，弃去上清液，获得嗜酸乳杆菌菌泥，称重菌泥，加入菌泥重量10% (W/ W)的脱脂乳粉，再加入菌泥重量90% (W/W)的pH6.8的磷酸缓冲液，然后在-40°C下预冻 8h，然后置于冷冻干燥机中进行冻干，4Pa、-60°C下冻干24h，即可获得嗜酸乳杆菌菌粉。实施例3-1将MRS肉汤在118°C下灭菌15min，冷却至室温，然后按4% (V/V)接种量接入嗜酸乳杆菌，37°C恒温培养18h，然后用2mol/L的硫酸将培养液的pH调至4.5，5°C静置 30min,取样测活菌数，然后在4°C，7000rpm离心lOmin，弃去上清液，获得嗜酸乳杆菌菌泥， 称重菌泥，加入菌泥重量10% (W/W)的脱脂乳粉，再加入菌泥重量90% (W/W)的PH6.8的磷酸缓冲液，然后在_40°C下预冻10h，然后置于冷冻干燥机中进行冻干，4-6Pa、-60°C下冻干22h，即可获得嗜酸乳杆菌菌粉，其冻干存活率为87. 22% (对照为49. 64% )，活菌数为 4. 09 X IO11CfVg (对照组为 1. 07 X 10ncfu/g)。实施例3-2将MRS肉汤在118°C下灭菌15min，冷却至室温，然后按4% (V/V)接种量接入嗜酸乳杆菌，37°C恒温培养18h，然后用2mol/L的硫酸将培养液的pH调至4. 0，7°C静置30min， 取样测活菌数，然后在4°C，7000rpm离心12min，弃去上清液，获得嗜酸乳杆菌菌泥，称重菌泥，加入菌泥重量14% (W/W)的脱脂乳粉，再加入菌泥重量86% (W/W)的pH6.8的磷酸缓冲液，然后在-40°C下预冻8h，然后置于冷冻干燥机中进行冻干，4Pa、-50°C下冻干24h，即可获得嗜酸乳杆菌菌粉。实施例3-3
将MRS肉汤在118°C下灭菌15min，冷却至室温，然后按4% (V/V)接种量接入嗜酸乳杆菌，37°C恒温培养18h，然后用2mol/L的硫酸将培养液的pH调至5. 5，8°C静置30min， 取样测活菌数，然后在4°C，7000rpm离心15min，弃去上清液，获得嗜酸乳杆菌菌泥，称重菌泥，加入菌泥重量20% (W/W)的脱脂乳粉，再加入菌泥重量80% (W/W)的pH6.8的磷酸缓冲液，然后在-40°C下预冻12h，然后置于冷冻干燥机中进行冻干，6Pa、-53°C下冻干18h，即可获得嗜酸乳杆菌菌粉。上述实施例中，对照组指其它条件完全相同，只是没有经过亚致死处理。
权利要求
1.一种提高嗜酸乳杆菌冻干存活率的方法，其特征在于包括以下步骤将嗜酸乳杆菌在MRS肉汤中于37°C培养18h，终止培养后对嗜酸乳杆菌进行亚致死处理，然后在4°C、7000rpm离心10-15min，弃去上清液得嗜酸乳杆菌菌泥，在嗜酸乳杆菌菌泥中加入菌泥质量的10-20%脱脂乳和菌泥质量80-90%、pH6. 8的磷酸缓冲液后在_40°C下预冻8-12h，然后置于冷冻干燥机中于温度-50-60°C，真空度为4-6Pa下冻干18_24h。
2.根据权利要求1所述一种提高嗜酸乳杆菌冻干存活率的方法，其特征在于所述脱脂乳和磷酸缓冲液的总质量与嗜酸乳杆菌菌泥的质量相等。
3.根据权利要求1或2所述一种提高嗜酸乳杆菌冻干存活率的方法，其特征在于所述亚致死处理是指冷休克。
4.根据权利要求3所述一种提高嗜酸乳杆菌冻干存活率的方法，其特征在于所述冷休克是指将嗜酸乳杆菌在8-10°C静置0. 5-1. 5h。
5.根据权利要求1或2所述一种提高嗜酸乳杆菌冻干存活率的方法，其特征在于所述亚致死处理是指热休克。
6.根据权利要求5所述一种提高嗜酸乳杆菌冻干存活率的方法，其特征在于所述热休克是指将嗜酸乳杆菌在38-42°C静置lh。
7.根据权利要求1或2所述一种提高嗜酸乳杆菌冻干存活率的方法，其特征在于所述亚致死处理是指酸休克。
8.根据权利要求7所述一种提高嗜酸乳杆菌冻干存活率的方法，其特征在于所述酸休克是指用硫酸调节培养液的PH为4. 0-5. 5后使嗜酸乳杆菌于5-8°C静置30min。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种提高嗜酸乳杆菌冻干存活率的方法将嗜酸乳杆菌于37℃培养18h后对嗜酸乳杆菌进行亚致死处理，然后在4℃、700)0rpm离心10-15min，在嗜酸乳杆菌菌泥中加入菌泥质量的脱脂乳和磷酸缓冲液后在-40℃下预冻8-12h，然后置于冷冻干燥机中于温度-50～-60℃，真空度为4-6Pa下冻干18-24h，即得嗜酸乳杆菌菌粉。本发明所述提高嗜酸乳杆菌冻干存活率的方法将嗜酸乳杆菌培养液先经冷休克、热休克或酸休克处理，使嗜酸乳杆菌在逆境中诱导合成冷休克蛋白、热休克蛋白或改变细胞膜脂肪酸组成，从而提高嗜酸乳杆菌在后续冻干过程中的抵抗力，提高冻干存活率及菌粉活菌数。
文档编号C12N1/04GK102329759SQ201110310289
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月13日 优先权日2011年10月13日
发明者张华 , 张强, 王娟, 秦涛, 舒国伟, 陈合, 马齐 申请人:陕西农产品加工技术研究院