专利名称：利用树木内生菌代谢产物抑制白蚁肠道固氮菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用树木内生菌代谢产物抑制白蚁肠道固氮菌的方法。
背景技术：
白蚁Termite属于节肢动物门昆虫纲有翅亚纲等翅目的昆虫，是较为古老的社会性害虫，Termite属于典型的寡氮营养型生物，其肠道固氮微生物的固氮作用是白蚁体内氮素的主要来源。每年因白蚁危害建筑物和农作物所造成的经济损失达千亿美元以上。现有的杀灭白蚁的药剂均为化学药剂，故都有很大的毒副作用，造成严重的环境污染及人体危害。利用生物技术开发具有高效、无毒、残效期长、对环境影响小的白蚁生物防治剂成为未来白蚁防治剂的主要方向。
发明内容
本发明是要解决现有利用化学药剂杀灭白蚁的方法毒副作用大，造成严重的环境污染及人体危害的问题，提供利用树木内生菌代谢产物抑制白蚁肠道固氮菌的方法。本发明利用树木内生菌代谢产物抑制白蚁肠道固氮菌的方法，按以下步骤进行一、将树木内生菌挑取一环，接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，在37°C、180r/min条件下培养2 3d，得到树木内生菌的培养液；将树木内生菌的培养液以5000r/min离心 10 15min，取上清液，在无菌、35°C恒温水浴、150r/min的条件下浓缩至其体积的二十分之一，即得到树木内生菌发酵液；二、制备素琼脂平板向IOOOmL水中加20g的琼脂，灭菌得素琼脂，然后向每个平板倒10 15mL的素琼脂，得素琼脂平板，将牛津杯立在素琼脂平板上；三、菌悬液的制备挑取一环白蚁肠道固氮菌，接种到无氮斜面培养基上，于37°C培养12 Mh，得白蚁肠道固氮菌斜面；取5mL无菌水，加到白蚁肠道固氮菌斜面上，用接种环在斜面上刮擦，再用无菌移液管吸打混勻，稀释至10_3，得菌悬液；四、半固体培养基的制备向无氮液体培养基中加入琼脂，使琼脂的质量浓度为0. 75%，加热至琼脂溶化，得到无氮半固体培养基；五、取20mL步骤四制备的无氮半固体培养基，待冷却至40 60°C时加入2mL步骤三制备的菌悬液，混勻，倒入步骤二得到的插有牛津杯的素琼脂平板上，待培养基凝固后拔出牛津杯，用移液枪向小孔中加入100 μ L步骤一得到的树木内生菌发酵液，在 4°C冰箱中放置过夜，然后在30°C培养箱中培养16 Mh，观察并用游标卡尺测定抑菌圈直径，即完成。本发明步骤一所述树木内生菌为枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-004、枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47或罗森桧沙雷氏菌HUB-I-107 ；其中枯草芽孢杆菌新亚种(Bacillus subtilis subsp. Iawsoniana subsp. nov)HUB-I_004 保藏在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2009年7月22日，保藏编号为CCTCC No :M 209161 ；枯草芽孢杆菌新亚禾中(Bacillus subtilis subsp. virginiana subsp. nov) HUB-I-047保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2009年7月22日，保藏编号为CCTCC No =M 209162 ；罗森桧沙雷氏菌(Serratialawsoniana sp. nov)HUB-I-107保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2009年7月22日，保藏编号为CCTCC No :M209163。本发明步骤三所述白蚁肠道固氮菌为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-004、变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)HUB-IV-005、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HUB-IV-006 或肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-033 ；其中肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-004保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2011年9月15日， 保藏编号为 CCTCC No :M2011312 ；变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)HUB-IV-005 保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2011 年9月15日，保藏编号为CCTCC No =M 2011313 ；产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HUB-IV-006保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2011年9月15日，保藏编号为CCTCC No =M 2011314 ；肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-033保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2011年9月15日，保藏编号为CCTCC No :M2011315。有益效果本发明方法中树木内生菌代谢产物对白蚁肠道固氮菌有较好的抑制作用，对白蚁肠道固氮菌有较好抑制作用的树木内生菌生物发酵合成的代谢产物对白蚁也有较好的杀灭作用。本发明为利用生物技术开发具有高效、无毒、残效期长、对环境影响小的白蚁生物防治剂提供了一种简洁而可行的新的途径，并可完善化学药剂防治存在着低效、高毒剂残留，威胁人类健康和破坏环境等问题。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式利用树木内生菌代谢产物抑制白蚁肠道固氮菌的方法，按以下步骤进行一、将树木内生菌挑取一环，接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，在37°C、180r/min条件下培养2 3d，得到树木内生菌的培养液；将树木内生菌的培养液以5000r/min离心 10 15min，取上清液，在无菌、35°C恒温水浴、150r/min的条件下浓缩至其体积的二十分之一，即得到树木内生菌发酵液；二、制备素琼脂平板向IOOOmL水中加20g的琼脂，灭菌得素琼脂，然后向每个平板倒10 15mL的素琼脂，得素琼脂平板，将牛津杯立在素琼脂平板上；三、菌悬液的制备挑取一环白蚁肠道固氮菌，接种到无氮斜面培养基上，于37°C培养12 Mh，得白蚁肠道固氮菌斜面；取5mL无菌水，加到白蚁肠道固氮菌斜面上，用接种环在斜面上刮擦，再用无菌移液管吸打混勻，稀释至10_3，得菌悬液；四、半固体培养基的制备向无氮液体培养基中加入琼脂，使琼脂的质量浓度为0. 75%，加热至琼脂溶化，得到无氮半固体培养基；五、取20mL步骤四制备的无氮半固体培养基，待冷却至40 60°C时加入2mL步骤三制备的菌悬液，混勻，倒入步骤二得到的插有牛津杯的素琼脂平板上，待培养基凝固后拔出牛津杯，用移液枪向小孔中加入IOOyL步骤一得到的树木内生菌发酵液，在 4°C冰箱中放置过夜，然后在30°C培养箱中培养16 Mh，观察并用游标卡尺测定抑菌圈直径，即完成。本实施方式步骤一所述树木内生菌为枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-004、枯草芽孢杆菌新亚种HUB-I-47或罗森桧沙雷氏菌HUB-I-107 ；其中枯草芽孢杆菌新亚种(Bacillus subtilis subsp. Iawsoniana subsp. nov)HUB-I_004 保藏在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2009年7月22日，保藏编号为CCTCC No :M 209161 ；枯草芽孢杆菌新亚禾中(Bacillus subtilis subsp. virginiana subsp. nov) HUB-I-047保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2009年7月22日，保藏编号为CCTCC No =M 209162 ；罗森桧沙雷氏菌(Serratia lawsoniana sp. nov)HUB-I-107保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2009年7月22日，保藏编号为CCTCC No :M209163。本实施方式步骤三所述白蚁肠道固氮菌为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-004、变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)HUB-IV-005、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HUB-IV-006 或肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-033 ；其中肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-004保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2011年9月15日， 保藏编号为 CCTCC No :M2011312 ；变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)HUB-IV-005 保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2011 年9月15日，保藏编号为CCTCC No =M 2011313 ；产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HUB-IV-006保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2011年9月15日，保藏编号为CCTCC No =M 2011314 ；肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HUB-IV-033保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2011年9月15日，保藏编号为CCTCC No :M2011315。本实施方式树木内生菌发酵液对白蚁肠道固氮菌的抑菌圈大小(mm)如表1所示， 结果表明树木内生菌的发酵产物对白蚁肠道固氮菌株均有较好的抑制作用。表1树木内生菌发酵液对白蚁肠道固氮菌的抑菌圈大小(mm)
菌株HUB-IV-004HUB-IV-005HUB-IV-006HUB-IV-033HUB-1-00422. 1±1. 3122. 3±1. 5419. 2±1. 3220. 1±2. 76HUB-I-10720. 5±1. 2619. 2±0. 8717. 1±1. 6718. 5±0. 79HUB-I-4717. 1±1. 3517. 2±0. 9315. 1±1. 0512. 6±1. 1具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三所述无氮斜面培养基由 15g 蔗糖、0. 8g KH2P04、0. 2g MgS04、0.2g NaClUg CaC03、20g 琼脂、ImL 质量浓度为 10 % 的 Na2MO4 溶液、ImL 的 H3BO3 溶液、ImL 的 MnSO4 溶液、ImL 的!^e2SO4 溶液和 IOOOmL H2O 组成，调PH至6. 5 7.0，于121°C灭菌30min。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤四所述无氮液体培养基由 15g 蔗糖、0. 8g KH2P04、0.2g MgS04、0· 2g NaClUg CaC03、ImL 质量浓度为 10 % 的 Na2MO4 溶液、ImL 的 H3BO3 溶液、ImL 的 MnSO4 溶液、ImL 的 Fe2SO4 溶液和 IOOOmL H2O组成，调pH至6. 5 7. 0，于121°C灭菌30min。其它与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤三中于 37°C培养15 20h。其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤三中于 37°C培养18h。其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤五中在 30°C培养箱中培养18 22h。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤五中在 30°C培养箱中培养20h。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
权利要求
1.利用树木内生菌代谢产物抑制白蚁肠道固氮菌的方法，其特征在于利用树木内生菌代谢产物抑制白蚁肠道固氮菌的方法，按以下步骤进行一、将树木内生菌挑取一环，接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，在37°C、180r/min条件下培养2 3d，得到树木内生菌的培养液；将树木内生菌的培养液以5000r/min离心10 15min，取上清液，在无菌、35°C恒温水浴、150r/min的条件下浓缩至其体积的二十分之一， 即得到树木内生菌发酵液；二、制备素琼脂平板向IOOOmL水中加20g的琼脂，灭菌得素琼脂，然后向每个平板倒10 15mL的素琼脂，得素琼脂平板，将牛津杯立在素琼脂平板上； 三、菌悬液的制备挑取一环白蚁肠道固氮菌，接种到无氮斜面培养基上，于37°C培养12 Mh，得白蚁肠道固氮菌斜面；取5mL无菌水，加到白蚁肠道固氮菌斜面上，用接种环在斜面上刮擦，再用无菌移液管吸打混勻，稀释至10_3，得菌悬液；四、半固体培养基的制备向无氮液体培养基中加入琼脂，使琼脂的质量浓度为0. 75%，加热至琼脂溶化，得到无氮半固体培养基；五、取20mL步骤四制备的无氮半固体培养基，待冷却至40 60°C时加入2mL步骤三制备的菌悬液，混勻，倒入步骤二得到的插有牛津杯的素琼脂平板上，待培养基凝固后拔出牛津杯，用移液枪向小孔中加入100 μ L步骤一得到的树木内生菌发酵液，在4°C冰箱中放置过夜，然后在30°C培养箱中培养16 Mh，观察并用游标卡尺测定抑菌圈直径，即完成。
2.根据权利要求1所述的利用树木内生菌代谢产物抑制白蚁肠道固氮菌的方法，其特征在于步骤三所述无氮斜面培养基由15g蔗糖、0. 8g KH2P04、0. 2g MgS04、0.2g NaCl、 IgCaCO3,20g琼脂、ImL质量浓度为10 %的Na2MO4溶液、ImL的H3BO3溶液、ImL的MnSO4溶液、 ImL 的 Fe2SO4 溶液和 IOOOmL H2O 组成，调 pH 至 6. 5 7. 0，于 121°C灭菌 30min。
3.根据权利要求1或2所述的利用树木内生菌代谢产物抑制白蚁肠道固氮菌的方法， 其特征在于步骤四所述无氮液体培养基由15g蔗糖、0.8g KH2P04、0.2g MgS04、0. 2g NaCl, Ig CaCO3, ImL质量浓度为10 %的Na2MO4溶液、ImL的H3BO3溶液、ImL的MnSO4溶液、ImL的 Fe2SO4 溶液和 IOOOmL H2O 组成，调 pH 至 6. 5 7. 0，于 121°C灭菌 30min。
4.根据权利要求3所述的利用树木内生菌代谢产物抑制白蚁肠道固氮菌的方法，其特征在于步骤三中于37°C培养15 20h。
5.根据权利要求3所述的利用树木内生菌代谢产物抑制白蚁肠道固氮菌的方法，其特征在于步骤三中于37°C培养18h。
6.根据权利要求4所述的利用树木内生菌代谢产物抑制白蚁肠道固氮菌的方法，其特征在于步骤五中在30°C培养箱中培养18 22h。
7.根据权利要求4所述的利用树木内生菌代谢产物抑制白蚁肠道固氮菌的方法，其特征在于步骤五中在30°C培养箱中培养20h。
全文摘要
利用树木内生菌代谢产物抑制白蚁肠道固氮菌的方法，涉及一种利用树木内生菌代谢产物抑制白蚁肠道固氮菌的方法。是要解决现有利用化学药剂杀灭白蚁的方法毒副作用大，造成严重的环境污染及人体危害的问题。方法一、树木内生菌发酵液的制备；二、制备素琼脂平板；三、菌悬液的制备；四、半固体培养基的制备；五、取无氮半固体培养基，待冷却至50℃时加入菌悬液，混匀，倒入插有牛津杯的素琼脂平板上，待培养基凝固后拔出牛津杯，用移液枪向小孔中加入树木内生菌发酵液，在4℃冰箱中放置过夜，然后在30℃培养箱中培养16h，观察并用游标卡尺测定抑菌圈直径，即完成。本发明方法中树木内生菌代谢产物对白蚁肠道固氮菌有较好的抑制作用。
文档编号C12R1/065GK102392071SQ20111031894
公开日2012年3月28日 申请日期2011年10月19日 优先权日2011年10月19日
发明者周东坡, 张小燕, 赵凯 申请人:黑龙江大学