专利名称：促甲状腺激素受体基因突变位点检测试剂盒、使用方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因突变检测领域，具体涉及一种促甲状腺激素受体基因突变位点检测试剂盒、使用方法和应用。
背景技术：
甲状腺的主要生理功能是通过促甲状腺激素(TSH)作用于甲状腺细胞膜上的促甲状腺激素受体(TSHR)来控制的，TSHR属于G蛋白偶联受体家族的一员，其膜外区氨基酸末端很长，是决定与TSH及TSAB特异性结合的主要部分。TSHR的主要功能是与TSH结合， 通过腺昔酸环化酶(AC)-CAMP途径引起一系列生物学反应，促进甲状腺激素的分泌，提高甲状腺的摄碘能力并促进甲状腺激素的合成、释放，对甲状腺组织的生长、分化等起着非常重要的作用。许多甲状腺疾病与TSHR基因突变有关。由于TSHR基因突变，患者体内存在一种特殊免疫球蛋白TSHR抗体(TSHRAb)，根据抗体与TSHR结合后产生的效应不同，TSHRAb 分为两种类型刺激型和抑制型。刺激型为甲状腺刺激抗体(TSAb)；抑制型为促甲状腺激素结合阻断免疫球蛋白(TB I)和甲状腺刺激阻断抗体(TSBAb)。前者结合到甲状腺细胞膜上的TSHR上可引起甲状腺增生和甲状腺激素的产生和分泌增多，而后者则阻断TSH与 TSHR结合，导致甲状腺萎缩和功能下降。研究发现，TSHR基因的突变与甲状腺腺瘤、Grave’ s病、先天性甲状腺机能亢进症、先天性甲状腺功能减退症等多种甲状腺疾病相关，在A Hebrant等的研究 (Genetichyperthyroidism hyperthyroidism due to activating TSHR mutations European Journalof Endocrinology [J], 2011. 164 1-9)中指出 TSHR 上多个易突变基因的位点示意图(见说明书附1)。在TSHR的突变位点中，有多个突变位点同时与两种以上的甲状腺疾病形成相关，如=TSHR 623位点和631位点的突变均与甲状腺腺瘤和先天性甲亢相关，当623位点由Ala突变为lie，则表明与甲状腺腺瘤形成相关；当623位点由Ala 突变为Val时，则导致甲亢和弥漫性甲状腺肿。因此TSHR基因突变位点的检测，一方面可作为临床对相关甲状腺疾病的辅助诊断，另外一方面也可为相关甲状腺疾病的预防提供依据。现有技术中对于突变位点的检测， 主要有两个层次，一是蛋白质层次的间接检测；二是对遗传物质的直接检测，包括SSCP、 RFLP, HTX、DGGE, DC、DHPLC、测序等，这些方法各有其优缺点，有的需要昂贵的检测设备，有的操作周期较长，需要2-3天才能出结果，不适合临床开展TSHR突变检测。以荧光定量PCR为代表的基因扩增技术迅速发展，它具有快速、特异性、灵敏度高、成本相对低等优点，被广泛应用于临床检测的各个方面。荧光定量PCR技术之所以由于常规PCR的最大原因是其引人了荧光探针，尤其是以近年来新推出TaqMan-MGB、 TaqMan-LNA探针技术，这两种技术能提高退火温度，缩短引物探针长度，提高特异性，降低设计难度，因此多被用于一些SNP和高变异病原体的检测等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种突变位点检测试剂盒、使用方法和应用，作为临床对甲状腺疾病的辅助诊断，为相关甲状腺疾病的预防提供依据。本发明一方面提供了一种促甲状腺激素受体(TSHR)基因突变位点检测试剂盒， 所述试剂盒包括针对促甲状腺激素受体蛋白623位点突变的TSHR 623体系和/或针对促甲状腺激素受体蛋白631位点突变的TSHR 631体系所述TSHR 623体系包括TSHR 623位点荧光PCR混合液、Taq酶、TSHR野生型阳性对照品、TSHR 623位点突变型阳性对照品；所述TSHR 623位点核酸荧光PCR混合液含有 1)引物、2) 623-野生型探针、3) 623-突变型探针、4) RT-PCR MIX、5)ddH20 ；所述引物能特异性扩增包含TSHR蛋白623位点编码基因在内的一段TSHR基因片段，所述623-野生型探针能特异性识别并结合未发生突变的TSHR蛋白623位点编码基因，所述623-突变型探针能特异性识别并结合发生突变的TSHR蛋白623位点编码基因；所述TSHR 631体系含有TSHR 631位点荧光PCR混合液、Taq酶、TSHR野生型阳性对照品、TSHR 631位点突变型阳性对照品；所述TSHR 631位点核酸荧光PCR混合液含有1)引物、2) 631-野生型探针、3) 631-突变型探针、4) RT-PCR MIX、5) ddH20 ；所述引物能特异性扩增包含TSHR蛋白631位点编码基因在内的一段TSHR基因片段，所述631-野生型探针能特异性识别并结合未发生突变的TSHR 蛋白631位点编码基因，所述631-突变型探针能特异性识别并结合发生突变的TSHR蛋白 631位点编码基因；所述探针均为荧光标记探针。较优的，所述TSHR 623体系与TSHR 631体系共用一对引物，即所述623体系与 631体系的引物序列相同，扩增含TSHR蛋白623位点编码基因和631位点编码基因在内的一段TSHR基因片段。最优的，所述引物序列见下表
引物序列
TSHR-F 5' - GTTGCCTTCGTCATCGTC-3' (SEQ ID NO: 1) TSHR-R 5，- GGGCCATGCATATGAAGTC-3，(SEQ ID NO 2 )较优的，所述TSHR 623体系的623-突变型探针包括623-1型突变探针、623-2型突变探针以及623-3型突变探针，所述TSHR 623体系和TSHR 631体系的探针序列见下表
探针序列
TSHR 623 体系
TSHR 631 体系
623-野生型探针5' - CCATCCTCTTGGCAAT-3' 623-1型突变探针 623-2型突变探针 623-3型突变探针 631-野生型探针 631-突变型探针
5'- CCATCCTCTTGATAAT-3' 5'-CCATCCTCTTGACAAT-3' 5'- CCATCCTCTTGGAAAT-3' 5'-TGTGTTGATCTTCAC-3' 5' -TGTGTTGATCCTCAC-3'
(SEQ ID NO:3) (SEQ ID N0:4) (SEQ ID N0:5) (SEQ ID N0:6) (SEQ ID NO:7) (SEQ ID N0:8) 更优的，623-野生型探针和631-野生型探针的5，端连接有FAM荧光报告基团，3， 端连接有非发光的淬灭基团；623-突变型探针和631-突变型探针的5’端连接有HEX荧光
5报告基团，3’端连接有非发光的淬灭基团。最优的，所述TSHR 623体系的荧光探针为Taqman-MGB探针，所述TSHR 631体系的荧光探针为Taqman-MGB-LNA探针；探针结构见下表
权利要求
1.一种促甲状腺激素受体基因突变位点检测试剂盒，所述试剂盒包括针对促甲状腺激素受体蛋白623位点突变的TSHR 623体系和/或针对促甲状腺激素受体蛋白631位点突变的TSHR 631体系所述TSHR 623体系包括TSHR 623位点荧光PCR混合液、Taq酶、TSHR野生型阳性对照品、TSHR 623位点突变型阳性对照品；所述TSHR 623位点核酸荧光PCR混合液含有1)引物、2) 623-野生型探针、3) 623-突变型探针、4) RT-PCR MIX、5)ddH20 ；所述引物能特异性扩增包含TSHR蛋白623位点编码基因在内的一段TSHR基因片段，所述623-野生型探针能特异性识别并结合未发生突变的TSHR蛋白623位点编码基因，所述623-突变型探针能特异性识别并结合发生突变的TSHR蛋白623位点编码基因；所述TSHR 631体系含有TSHR 631 位点荧光PCR混合液、Taq酶、TSHR野生型阳性对照品、TSHR 631位点突变型阳性对照品； 所述TSHR 631位点核酸荧光PCR混合液含有1)引物、2) 631-野生型探针、3) 631-突变型探针、4)RT-PCR MIX、5)ddH20 ；所述引物能特异性扩增包含TSHR蛋白631位点编码基因在内的一段TSHR基因片段，所述631-野生型探针能特异性识别并结合未发生突变的TSHR蛋白631位点编码基因，所述631-突变型探针能特异性识别并结合发生突变的TSHR蛋白631 位点编码基因；所述探针均为荧光标记探针。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述623体系与631体系的引物序列相同，扩增含TSHR蛋白623位点编码基因和631位点编码基因在内的一段TSHR基因片段。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物序列为SEQID N0:1 2。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述TSHR623体系的623-野生型探针序列为SEQ ID NO 3,所述623-突变型探针包括623-1型突变探针、623-2型突变探针和 623-3型突变探针，探针序列分别为SEQ ID NO :4 6 ；所述TSHR 631体系的631-野生型探针序列为SEQ ID NO :7，所述631-突变型探针序列为SEQ ID NO :8。
5.如权利要求1或4所述的试剂盒，其特征在于，所述623-野生型探针和631-野生型探针的5’端连接有FAM荧光报告基团，3’端连接有非发光的淬灭基团；所述623-突变型探针和631-突变型探针的5’端连接有HEX荧光报告基团，3’端连接有非发光的淬灭基团。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述TSHR623体系的荧光探针为 Taqman-MGB探针，所述TSHR 631体系的荧光探针为iTaqman-MGB-LNA探针。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述TSHR623体系和TSHR 631体系的野生型阳性对照品为含有SEQ ID NO :9基因序列的质粒；所述TSHR 623位点突变型阳性对照品与TSHR 631位点突变型阳性对照品均为含有SEQ ID NO :10基因序列的质粒。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒为pMDIS-T。
9.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增程序为37°C2min ； 94°C 2min ；93°C 15sec、60°C 60sec 40 个循环。
10.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒以H2O为检测样品的检测结果应为阴性；以TSHR 623位点野生型阳性对照品为检测样品在FAM通道检测Ct值彡35， 在HEX通道检测为UNDET或40 ；以TSHR 623位点突变型阳性对照品为检测样品在FAM通道检测为UNDET或40，在HEX通道检测Ct值彡35 ；以TSHR 631位点野生型阳性对照品检测样品在FAM通道检测Ct值彡35，在HEX通道检测为UNDET或40 ；以TSHR 631位点突变型阳性对照品为检测样品在FAM通道检测为UNDET或40，在HEX通道检测Ct值< 35 ；所述试剂盒用于检测时针对TSHR 623位点的检测FAM通道检测Ct值彡38，HEX通道检测为UNDET，则待测样品为TSHR 623位点野生型；FAM通道检测为UNDET，HEX通道检测Ct值彡38，则待测样品为 TSHR 623位点突变型；针对TSHR 631位点的检测FAM通道检测Ct值彡38，HEX通道检测为UNDET，则待测样品为TSHR 631位点野生型；FAM通道检测为UNDET，HEX通道检测Ct值 (38，则待测样品为TSHR 631位点突变型。
11.如权利要求1-10任一权利要求所述的促甲状腺激素受体基因突变位点检测试剂盒的使用方法，步骤如下1)待测DNA样品的制备采用经典的基因组DNA提取方法或是商品化的基因组提取试剂盒，从样本中提取基因组DNA备用；2)配置试剂每管取荧光PCR检测混合液与Taq酶，振荡混勻，获得荧光PCR检测混合液与Taq酶的共混液；3)加样每支PCR管取步骤2、制备的荧光PCR检测混合液与Taq酶的共混液，然后将待测DNA样品、ddH20、TSHR野生型阳性对照品、TSHR突变型阳性对照品分别加入装有所述共混液的各支PCR管中，盖好管盖，组成PCR反应体系；4)PCR扩增对步骤3)的PCR反应体系进行PCR扩增；5)荧光PCR检测单点荧光检测在60°C，选用FAM和HEX通道，基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过H2O检测荧光曲线的最高点，读取各PCR管的Ct值；6)结果分析按照权利要求9所述的条件进行检测结果判断。
12.如权利要求11所述的使用方法，其特征在于，步骤幻的配置试剂具体为每管取 36 μ 1荧光PCR检测混合液与0. 4 μ 1 Taq酶，振荡混勻，3000rpm离心，获得荧光PCR检测混合液与Taq酶的共混液。
13.如权利要求11所述的使用方法，其特征在于，步骤3)的加样具体为每支PCR管取 36 μ 1步骤2)制备的荧光PCR检测混合液与Taq酶的共混液，然后将待测DNA样品、ddH20、 TSHR野生型阳性对照品、TSHR突变型阳性对照品各4μ 1分别加入所述共混液中，盖好管盖，组成40 μ 1的PCR反应体系。
14.如权利要求1-10任一权利要求所述的促甲状腺激素受体基因突变位点检测试剂盒在制备辅助诊断或预防甲状腺疾病的试剂中的应用。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述甲状腺疾病选自甲状腺腺瘤、先天性甲亢或弥漫性甲状腺肿。
全文摘要
本发明公开了一种促甲状腺激素受体基因突变位点检测试剂盒及其使用方法和应用，本发明的试剂盒包括1)荧光PCR检测混合液2)Taq酶3)TSHR野生型阳性对照品4)TSHR突变型阳性对照品5)ddH2O，本发明的试剂盒通过荧光定量PCR法对TSHR蛋白623位点和/或631位点的编码基因进行检测，判断是否有所述编码基因的突变，进而判断是否存在甲状腺激素受体蛋白623位点和/或631位点突变。该蛋白位点的突变可以用于甲状腺疾病的辅助诊断和预防，具有实时检测、定量和高通量检测等特点，且操作简便、灵敏度高、特异性好。
文档编号C12Q1/68GK102344966SQ20111032275
公开日2012年2月8日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者丁钢强, 朱勤玮, 朱文明, 朱旭平, 楼晓明, 邵俊斌 申请人:上海之江生物科技股份有限公司, 浙江省疾病预防控制中心