专利名称：一种siv载体的制备方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及一种SIV载体的制备方法。
背景技术：
SIV (Simian Immunodeficiency Virus)即猴免疫缺陷病毒,SIV 载体是一种基于猴免疫缺陷病毒(SIV)的载体。目前，常见的SIV载体的制备方法是磷酸钙共沉淀转染法，该方法受pH的值变化的影响比较大。该制备方法工艺复杂，生产效率低，无法满足大规模工业化生产的要求。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供一种SIV载体的制备方法。该制备方法构思巧妙、流程简单，生产成本低，生产效率大幅提高，满足了 SIV载体大规模工业化生产的要求。为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是
一种SIV载体的制备方法，将培养皿用胶原蛋白进行处理，在转染过程中使用Opt1-MEM培养基，在转染过程中增加DNA浓度。本发明通过优化SIV载体生产时的转染条件，获得原有技术约2倍的SIV载体生产量，达到事半功倍的效果，对促进SIV载体的实用化具有重大意义。具体包括1)使用Collagen处理过的培养皿提高SIV载体生产量的技术；2)转染时使用Opt1-MEM培养基提高SIV载体生产量的技术；3)转染时增加DNA浓度提高SIV载体生产量的技术。本发明的有益效果在于本发明构思巧妙、流程简单，生产成本低，生产效率大幅提高，可以实现SIV载体的大规模工业化生产。
本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中
图1是本发明实施例1生产量评价结果 图2是本发明实施例2生产量评价结果 图3是本发明实施例3生产量评价结果 图4是本发明实施例4生产量评价结果图。
具体实施例方式本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。实施例1 :选用3个直 径IOcm的普通培养皿(dish)和3个Collagen-Type I处理过的同尺寸培养皿，采用相同方法进行SIV-GFP的生产，比较使用两种培养皿在SIV载体生产性上的差别。
具体方法为(DNA32μδ +1.5ml 2xBES Buffer)和1. 5ml 167mM CaCl2 混合 20 分钟后与12ml DMEM培养基混合，5ml/dish分别加入3个长有293T/17细胞(添加前用DMEM洗一遍细胞)的培养皿中，3小时后以5ml/dish加入含20%FBS的DMEM培养基过夜培养，第2天去掉培养液，用DMEM洗一遍后，以10ml/dish加入含IOmM NaB的DMEM过夜，转染48小时后收取上清，检测SIV-GFP的滴度。现有技术中使用普通细胞培养瓶进行SIV载体的生产，本发明使用Collagen处理培养皿可以改善细胞生长状态，有利于提高SIV载体的生产量。实验结果表明，使用Collagen处理过的培养皿进行SIV载体的生产可以提高约30%的生产量。实施例2 :选用直径IOcm的普通培养皿(3个/组)，采用同样条件配制DNA混合物，将DNA混合物分别和DMEM培养基，IMDM培养基，Opt1-MEM培养基这3种不同培养基混合后添加进培养皿来进行SIV-GFP的生产，比较转染时使用不同培养基在SIV载体生产性上的差别。现有技术中使用DMEM培养基进行转染，具体方法同实施例1。磷酸钙共沉淀转染法受PH的变化的影响比较大，使用PH较稳定的培养基可改善转染效率，从而有利于提高SIV载体的生产量。Opt1-MEM是Invitrogen公司开发的培养基,pH比较稳定,可以广泛用于各种转染试剂的转染。实验结果发现转染时使用Opt1-MEM进行SIV载体的生产可以提高约40%的生产量。实施例3:选用直径IOcm的普通培养皿(3个/条件)，分别采用不同条件(I倍DNA浓度，1. 5倍DNA浓度，2. O倍DNA浓度)配制DNA混合物，将DNA混合物和DMEM培养基混合后添加进培养皿来进行SIV-GFP的生产，具体方法同实施例1。比较转染时使用不同DNA浓度在SIV载体生产性上的差别。SIV载体是使用磷酸钙共沉淀转染法来生产的，转染时的DNA浓度对转染效率有一定影响，虽然过量DNA的使用会对细胞产生毒性，但在允许范围内适当提高DNA浓度会改善转染效率，从而有利于提 高SIV载体的生产量。实验结果发现使用原有技术2倍DNA浓度进行转染，可以提高约43%的SIV载体生产量。实施例4 :选用225cm2方瓶，在相同细胞条件下分别采用I倍DNA浓度配制DNA混合物、DMEM培养基和2. O倍DNA浓度、Opt1-MEM培养基进行SIV-GFP的生产。实验结果发现采用2. O倍DNA浓度、Opt1-MEM培养基进行SIV-GFP的生产可以提高约100%的SIV载体生产量。本发明并不局限于前述的具体实施方式
。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。
权利要求
1.一种SIV载体的制备方法，采用磷酸钙共沉淀转染法，其特征在于将培养皿用胶原蛋白进行处理，在转染过程中使用Opt1-MEM培养基，在转染过程中增加DNA浓度。
全文摘要
本发明公开了一种SIV载体的制备方法，采用磷酸钙共沉淀转染法，将培养皿用胶原蛋白进行处理，在转染过程中使用Opti-MEM培养基，在转染过程中增加DNA浓度。本发明构思巧妙，生产成本低，所制备的托伐普坦片剂体外溶出度高，药物的生物利用度和临床疗效好。
文档编号C12N15/867GK103060378SQ20111032453
公开日2013年4月24日 申请日期2011年10月24日 优先权日2011年10月24日
发明者朱义, 游军, 朱亚峰, 长谷川户 申请人:四川百利药业有限责任公司, 日本Dnavec株式会社