专利名称：一种分离牛外周血单核细胞的方法
技术领域：
本发明涉及细胞分离技术，具体地说，涉及一种分离牛外周血单核细胞的方法。
背景技术：
分离外周血单核细胞一般包括两个步骤S卩外周血单个核细胞的分离和后续单核细胞的分离。其中，第一步是通过密度梯度离心完成的，通过选择一定密度的分离液，可以将血液中密度较低的单核细胞和淋巴细胞(二者密度相近，合称外周血单个核细胞，PBMC) 与密度较高的粒细胞、红细胞成分分开；第二步，单核细胞可以用其它一些方法与淋巴细胞分离开，包括吸附法、免疫分选、反向淘选离心法和密度梯度分离等。其中，吸附法是最常用的方法，它简单、经济，但是也存在一些缺点，比如淋巴细胞污染量高、灵活性低、工作量大、 单核细胞激活等。免疫分选对于日常应用以及处理大量血液样本而言十分昂贵，需要专门的单克隆抗体和设备，一般包括流式细胞术和免疫磁珠两种方法。反向淘选离心法可以处理大量的血液，纯度高活率高，而且不易激活单核细胞，但是需要昂贵的设备和专业的技术人员。密度分离的方法包括使用连续密度梯度和非连续密度梯度两种，其中制作连续密度梯度的泵和超速离心机价格相对昂贵。1999年，Jindrich Soltys等人使用了免疫磁珠的方法分离牛的中性粒细胞，细胞得率更高、纯度更纯，而且在诸多检测指标中都表现出了更好的活性，但是用免疫磁珠法分离牛外周血单核细胞还未有文献报道。使用抗体的单核细胞分离技术还有流式细胞术，但是也没有用于分离牛外周血单核细胞的文献报道。反向离心淘洗法需要一套专门的反向离心淘洗设备，用于人的外周血单核细胞分离，但也没有文献使用了该技术分离牛的外周血单核细胞。密度分离的方法是基于单核细胞和淋巴细胞的大小不同，使用连续密度梯度分离液和超速离心机将二者分开，目前该方法也不常用牛的外周血单核细胞分离。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，对塑料吸附法分离牛外周血单核细胞的关键步骤进行改进，提供一种优化的分离牛外周血单核细胞的方法。为了实现本发明目的，本发明的一种分离牛外周血单核细胞的方法，包括步骤1) 向含有抗凝剂A⑶-A的离心管中加入采集到的牛外周血，制成抗凝血液；2)将OptiPi^p 原液与C液按比例混合，制成密度分离液；3)将1)的抗凝血液与PBS液按比例混合，制成稀释的抗凝血液；4)将2份体积的3)稀释的抗凝血液加在1份体积的2)的密度分离液之上，离心，弃上清，将分离液和血清液面交界处的白色薄层转移至另一离心管中；5)向4)的离心管中加入PBS溶液清洗细胞，然后以转速250g离心5-lOmin;重复5) —次；6)向5)的细胞沉淀中加入PBS溶液重悬，即得单个核细胞。其中，前述2)和3)中C液的制备方法为将1.79g Tricine Buffer加入IOOml水中，制得IOOmM Tricine储存液，4°C保存；将0. 85g NaCl加入50ml水中，加入20ml IOOmM Tricine储存液，用IM NaOH调节pH值7. 4，加水补充体积至100ml，0. 22 μ m滤器过滤除菌。
前述步骤1)中所述的抗凝剂A⑶-A的制备方法为向IOOml水中加入0. 73g无水柠檬酸、2. 20g 二水柠檬酸钠和2. 45g —水右旋糖，调节pH值至7. 0-7. 3，0. 22 μ m滤器过滤除菌。其中，抗凝剂A⑶-A和牛外周血的体积比为1 5-10。前述步骤2)中OptiPi^p 原液与C液的体积比为1.4 4. 6。前述步骤3)中抗凝血液与PBS液的体积比为1 1。前述的方法还包括以下步骤将6)的细胞悬液转移至细胞培养瓶中，加入 RPMI1640培养基，然后将细胞培养瓶置于37°C，5% CO2的条件下培养，得到贴壁的单核细胞。
本发明采用了新型的密度梯度分离液OptiPi^p ，它是一种非离子型等渗造影剂， 可以配置的密度范围宽，而且它不像Percoll 含有固态颗粒，后者可能会被单核细胞吞噬，而且内毒素含量很低(高浓度Ficoll 可能含有较高的内毒素含量)，对敏感的单核细胞损伤和影响很小。本发明是以OptiPrep 说明书为基础，参考了其它关于牛和人的单核细胞分离技术的文献，经过反复实验和不断摸索而设计得到的，将说明书和部分文献中对实验有利的步骤保留，剔除不利的步骤。(一)本发明采用的抗凝剂ACD-A相比于常规使用的其它抗凝剂(如肝素和 EDTA2K)能更稳定地分离到形态更好的细胞，而且该抗凝剂适宜较长时间储存血液，在室温条件下保存一天的血液仍然可以分离到合适的细胞。( 二)细胞清洗条件的优化按照现有文献和说明书的方法经常导致单核细胞分离的失败，原因之一可能在于细胞的清洗过程，本发明采用PBS溶液对细胞进行清洗，减少了对后续单核细胞贴壁分离不利的因素，例如血清和血小板的影响，最终使分离的成功率大大增加。(三)本发明首次将从牛血采样到分离牛外周血单核细胞并最终转化为巨噬细胞形成了一整套完备的体系，中间不需要计数和染色，节省了时间并提高了分离效果。(四)采用本发明方法从牛外周血样中分离出的单核细胞存活率高，贴壁单核细胞活率大于95%，实验重复性好，可操作性强，为简便高效地分离牛外周血中的单核细胞提供了有力的技术支持。
图1和图2为使用EDTA作为抗凝剂分离牛外周血单核细胞，显微镜下观察到的结果(放大倍数200X)。图3和图4为使用肝素作为抗凝剂分离牛外周血单核细胞，显微镜下观察到的结果(放大倍数200X)。图5和图6为使用A⑶-A作为抗凝剂分离牛外周血单核细胞，显微镜下观察到的结果(放大倍数200X)。图7显示出由于贴壁面积过小，单核细胞在大量淋巴细胞的影响下，无法完全贴壁的结果(放大倍数200X)。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。以下实施例中观察细胞使用Olympus 1X71倒置显微镜20倍物镜，美国ImagePLUS 图像分析系统采集数码图像。实施例1分离牛外周血样中的单核细胞1、材料与试剂
1)抗凝剂A⑶-A，配制方法为每IOOml水中加入0. 73g无水柠檬酸、2. 20g 二水柠檬酸钠和2. 45g—水右旋糖。调节pH值至7. 0-7. 3，0.22 μ m滤器过滤除菌。1份体积 A⑶-A抗凝5-10份体积的血液。2) OptiPrep 密度梯度分离液(Axis-Shield PoC, Norway)。3) Tricine BufTer(Amresco)04) RPMI1640 培养基(Gibco, invitrogen)。5)胎牛血清(Gibco, invitrogen)。6) PBS (NaCl 8. 00g, KCl 0. 20g, Na2HPO4 · 12H20 2. 91g, KH2PO4O. 24g,加入 800ml 去离子水，调节pH为7. 4，定容至1000ml，高压灭菌)。2、方法1)无菌采集牛外周血，使用A⑶-A抗凝剂(50ml离心管，加入约7ml A⑶_A，采集血液至45ml刻度线)。2)按照OptiPi^p 说明书(Application Sheet C08)，准备工作液C液。具体方法为将1. 79g Tricine Buffer加入100ml水中，制得IOOmMTricine储存液，4°C保存；将 0. 85g NaCl 加入 50ml 水中，加入 20mlIOOmM Tricine 储存液，用 IM NaOH 调节 pH 值 7. 4， 加水补充体积至100ml，0. 22 μ m滤器过滤除菌。3)按照说明书，将OptiPi^p 原液(A液)与C液按1. 4 4.6的比例混合，制备成1. 068g/ml密度分离液。4)将1)的抗凝血液与PBS液按照1 1的比例混合。5)将2份体积4)的稀释血液小心地累加到1份体积1. 068g/ml密度分离液上 (50ml离心管中一般是30ml混合血加在15ml分离液上)。建议采用巴斯德吸管，将含有密度分离液的离心管倾斜成与水平桌面呈20度角，然后贴着管壁在距离密度分离液上缘 Icm处缓缓添加，可减少液面的扰动，随着液体的加入，慢慢将离心管直立(该方法详见 OptiPi^p 说明书 Application Sheet 02)。6)将离心管置于水平转子室温离心机，在800g的转速下离心30min，减速时必须采用最小制动。7)取出离心管，将上清弃去一部分，留下一部分辅助吸取PBMC (50ml离心管大约留下5-10ml)，然后小心地吸取透明分离液和血清液面交界处的白色薄层，由于细胞容易粘附在离心管壁上，吸取时应加以注意。8)将吸得的细胞置于15ml离心管中(用1000 μ L移液器一般吸取3_4ml)，加入室温PBS至15ml，轻柔颠倒混勻5次，然后置于水平转子室温离心机，在250g转速下离心 7min，采用半制动。采用同样方法再清洗一次细胞，离心时采用全制动。9)将每个15ml离心管中的细胞用0. 5ml PBS充分轻柔地重悬，加入一个25cm2 塑料细胞培养瓶中，然后向培养瓶中加入5. 5ml室温RPMI1640完全培养基(含有10%胎牛血清、1 %青/链霉素)，轻微振荡混勻使细胞均勻平铺在培养瓶中(此时细胞密度约为 2. 5X IO6个/ml)。将细胞瓶在37°C下，5% CO2的条件下培养。即得PBMC细胞，可以用于后续实验。10)培养1天后，即可去掉上层细胞液，并用室温PBS浸洗两次，然后加入完全培养基，继续培养贴壁的细胞。至第5天，贴壁的单核细胞就可以转化为巨噬细胞，可以用于下游实验。
实施例2抗凝剂对分离牛外周血单核细胞的影响本发明在常规分离方法的基础上对细节步骤和条件进行了改进。首先是抗凝剂的选择，优选ACD-A，其次是肝素，不建议使用EDTA。然后，细胞的清洗必须充分去除血小板、 残留血清等。最后，形成了一套模式化的方案，包括使用50ml离心管离心，15ml离心管清洗，25cm2培养瓶贴壁的方案，具有很好的重复性和可操作性，不需要细胞计数，节省实验时间，提高分离效果。本发明摸索了抗凝剂的使用条件，包括肝素(2mg/10ml血液)、EDTA 二钾(K2EDTA, 18mg/10ml血液)和A⑶-A。结果发现，三种抗凝剂得到的PBMC数量有明显差异。分别采集两头奶牛I和I’的血样，由同一名操作人员按照OptiPi^p 说明书中所述的方法同时进行分离。得到的PBMC细胞，用培养基重悬后取少量用台盼蓝进行染色，剩余的培养于细胞瓶内。台盼蓝染色后，通过细胞计数器对细胞进行计数和分类。(表1)表1不同抗凝剂抗凝血液后分离出PBMC的细胞活率及数量
权利要求
1.一种分离牛外周血单核细胞的方法，其特征在于，包括步骤1)向含有抗凝剂ACD-A的离心管中加入采集到的牛外周血，制成抗凝血液；2)将OptiPi^p 原液与C液按比例混合，制成密度分离液；3)将1)的抗凝血液与PBS溶液按比例混合，制成稀释的抗凝血液；4)将2份体积的3)稀释的抗凝血液加在1份体积的2)的密度分离液之上，离心，弃上清，将分离液和血清液面交界处的白色薄层转移至另一离心管中；5)向4)的离心管中加入PBS溶液清洗细胞，然后以转速250g离心5-lOmin；6)向5)的细胞沉淀中加入PBS溶液重悬，即得单个核细胞；其中，2)中所述的C液的制备方法为将1.79g Tricine Buffer加入IOOml水中，制得 IOOmM Tricine 储存液，4°C保存；将 0. 85g NaCl 加入 50ml 水中，加入 20ml IOOmM Tricine 储存液，用IM NaOH调节pH值7. 4，加水补充体积至100ml，0. 22 μ m滤器过滤除菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的抗凝剂ACD-A的制备方法为向IOOml水中加入0. 73g无水柠檬酸、2. 20g 二水柠檬酸钠和2. 45g 一水右旋糖，调节pH值至7. 0-7. 3，0. 22 μ m滤器过滤除菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，抗凝剂ACD-A和牛外周血的体积比为 1 5-10。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中OptiPrep 原液与C液的体积比为 1. 4 4. 6。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中抗凝血液与PBS液的体积比为
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤5)和步骤6)之间重复一次清洗细胞的步骤。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤将6)的细胞悬液转移至细胞培养瓶中，加入RPMI1640培养基，然后将细胞培养瓶置于37°C，5% CO2的条件下培养，得到贴壁的单核细胞。
全文摘要
本发明提供了一种优化的分离牛外周血单核细胞的方法，包括以ACD-A作为抗凝剂、离心条件的优化、细胞清洗条件的优化、贴壁条件的优化等，大大提高了分离成功率。本发明首次建立了从牛血采样到分离牛外周血单核细胞并最终转化为巨噬细胞的一整套完备体系，中间不需要计数和染色，节省了时间并提高了分离效果。采用本发明方法分离出的单核细胞存活率高，实验重复性好，可操作性强，为简便高效地分离牛外周血中的单核细胞提供了有力的技术支持。
文档编号C12N5/0786GK102329774SQ20111032470
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者周向梅, 尹晓敏, 杨利峰, 林敬钧, 王洋, 赵德明 申请人:中国农业大学