专利名称：一种杀虫真菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物防治领域，具体地涉及一种杀虫真菌及其应用。
背景技术：
蚜虫具有个体小、发育快、繁殖率高、抗药性强的特点，对环境适应力强，广泛分布于世界各种农林植物。它不仅直接取食危害植物，还间接传播植物病毒，给蔬菜、 粮油、果树、园林等生产造成严重经济损失。在蔬菜上的蚜虫种类主要有桃赤蚜Myzus persicae (Sulzer)、萝卜虫牙 Lipaphis erysimi (Kaltenbach)、甘蓝虫牙(菜虫牙)Brevicoryne brassicae (Linn.)。桃蚜为全国性分布，广食性，可危害50科400余种植物，主要包括十字花科、茄科蔬菜(如甘蓝、大白菜、青菜、萝卜和茄子、马铃薯、番茄等)及蔷薇科果树(桃、 李、杏、梅、樱桃等)。萝卜蚜多分布于华南，喜食白菜、萝卜、油菜。甘蓝蚜为北方优势种在浙、江、闽等也有记载，而且为害加重，尤嗜甘蓝、花椰菜。蚜虫以刺吸式口器取食植物汁液， 使植株严重失水、营养不良、生长减缓，出现叶斑、卷叶、枯萎以致死亡。蚜虫还是多种植物病毒载体，成为植株间病毒传播的媒介，时常对植物病害期推波助澜的作用。同时其分泌的蜜露盖于植物表面，有利于真菌的传播和诱发煤污病而造成植物的损害。蚜虫的防治主要有园艺清除、物理诱捕、化学杀灭和生物制约等方法，尽管前两种方法能够显著降低蚜虫虫口数量，但由于蚜虫繁殖速度快，在适宜温湿度和食物条件下，1 个月内即可增殖100倍以上，因此种植过程中还必须及时施用化学农药，如内吸性有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酯酯类等加以控制。研究证实，长期反复使用农药已使蚜虫对多种农药的抗药性剧增，例如山东聊城、寿光的瓜(棉)蚜对氰戊菊酯的抗性水平竟然达到12 万和27万倍，拟除虫菊酯类杀虫剂在当地防蚜已基本无效。一些原本高效的杀蚜剂如抗蚜威、吡虫啉等经过几年使用，抗性也增加几十倍。过度使用农药造成农产品中药残超标和农田环境污染。为保障农作物稳产高产，同时保证农产品质量安全，近年无公害植保技术逐渐成为研究热点，对蚜虫的生物制约方法越来越受到青睐。目前较成功的方法主要是保护与释放烟蚜茧蜂、菜蚜茧蜂、食蚜瘿蚊Aphidoletes aphidimyza (例1978年芬兰于保护地试验成功，我国1986年从加拿大引入释放，数量益害比为1 20，7-9天防效达90% )等蚜虫天敌，提高寄生或捕食作用控制田间害虫的种群密度；再者是施用蚜霉菌Entomophthora aphidis、轮枝菌Verticillium Iecanii (英国商品注册Vertalec)等昆虫病原真菌，通过病原感染作用使害虫罹病死亡。昆虫病原真菌对脊椎动物高度安全，与环境友好兼容。其对寄主昆虫的作用机制是孢子附着于昆虫表皮，通过分泌专性的昆虫表皮降解酶而穿过体壁，进入昆虫体腔后增殖，消耗其营养，释放毒素，干扰正常生理功能，侵染组织器官，最后使寄主罹病而死。由于无需经过消化道，因此对防止刺吸式口器蚜虫有明显优势。本研究小组多年从事昆虫病原真菌研究与应用，发现白僵菌(Beauveria bassiana)对蚜虫有寄生和致死作用，不同菌株的作用效力相差很大，需要通过人工筛选才能获得高毒力的菌株。相关领域中，以往研究者也有通过室内生物测定筛选获得对麦蚜等多种蚜虫成蚜的毒力较高球孢白僵菌菌株。经研究发现，白僵菌象其它昆虫病原真菌一样，存在对寄主起效较慢的弱点，生物测定中通常要3-5天才能达到致死高峰，相对地滞后于蚜虫的繁殖速度和植株对蚜虫危害的耐受程度，因而常常不能及时控制虫害，达不到人们期待的理想防效。为了提高白僵菌防效，需要寻求提高白僵菌杀虫速度的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的发明人提出并完成了本发明。本发明的目的是提供一种对蚜虫高效侵染的真菌球孢白僵菌菌株BBNS-J9-16。本发明的再一目的是提供球孢白僵菌菌株BBNS-J9-16对蚜虫的杀虫作用。本发明的再一目的是提供一种蚜虫的高效复合杀虫剂，其包括上述球孢白僵菌菌株BBNS-J9-16的孢子粉。本发明的再一目的是提供上述高效复合杀虫剂对蚜虫的杀虫作用。本发明提供了一种高效菌株球孢白僵菌BBNS-J9-16。本发明人分别从内蒙古、安徽、江西、贵州等地的天然林区、草地或农田采集到土壤和感染白僵菌病症的虫尸，在实验室内进行微生物分离、纯化，保存纯化的球孢白僵菌菌种在PDAY试管培养基中，共得到68 个菌株。将纯化的菌株接种在PDAY平板培养基上，于25士 1°C培养箱中培养12-14天，收集分生孢子粉，进行生物测定，根据蚜虫最终死亡率和僵虫率，初步筛选得到4个具有较高毒力作用的菌株。将这4个初选菌株再次接种蚜虫虫体并从病虫上再分离纯化及生物学测定选择，最终得到高效菌株球孢白僵菌BBNS-J9-16 (Beauveria bassiana)。该菌株于2011 年9月23日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是CGMCC No. 5288。所述菌株的ITS1-5. 8S-ITS2 rDNA区域的核苷酸序列如SEQID No. 1 所示
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本发明还提供了上述球孢白僵菌菌株BBNS-J9-16用于杀蚜虫的应用，优选该白根据本发明的高效复合杀虫剂，优选每克所述高效复合杀虫剂含有0. 4 2X IO9 孢子和1/220-1Λ60克的高效氯氰菊酯，杀虫使用浓度为稀释1000倍。根据本发明的高效复合杀虫剂，优选每克所述高效复合杀虫剂含有0. 4 2X IO9 孢子和1/25-1/37. 5克的乐果，杀虫使用浓度为稀释1000倍。本发明还提供了上述高效复合杀虫剂用于杀蚜虫的应用，优选用于杀萝卜蚜 (Lipaphis erysimi)的应用。本发明筛选得到了一种对蚜虫高效侵染的球孢白僵菌菌株，同时还筛选到几种能够与球孢白僵菌兼容的低毒性农药。这些农药在远低于常规用量的条件下，能够有效促进球孢白僵菌对蚜虫侵染效力，大幅减少农药的施用量。由此形成的高效复合杀虫剂，利用与环境友好兼容的昆虫真菌感染寄主从而控制害虫，实现保护农作物同时，减少化学农药的使用，对保障农产品安全和农业环境安全起积极作用。
图1菌株BBNS-J9-16的显微形态特征。 图2CTAB法提取球孢白僵菌BBNS-J9-16的DNA的凝胶图。图3扩增的球孢白僵菌BBNS-J9-16核糖体ITS片段的凝胶图。图4显示了球孢白僵菌BBNS-J9-16对蚜虫的作用，a为健康蚜，b、c为感病蚜。球孢白僵菌BBNS-J9-16 (Beauveria bassiana)于2011年9月23日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是CGMCC No. 5288。
具体实施例方式结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1球孢白僵菌BBNS-J9-16 (Beauveria bassiana)菌株的分离、纯化分别从内蒙古、安徽、江西、贵州等地的天然林区、草地或农田采集到土壤和感染白僵菌病症的虫尸，在实验室内进行微生物分离、纯化。分离及纯化步骤为1)从土壤分离目标微生物用无菌水稀释土壤20倍、100倍、 500倍，分别接种到选择性培养基上，25°C温度下培养4-7天，挑出菌落转移得到新的选择性培养基平皿上，单菌落培养7-10天，通过菌落表观和显微形态检查鉴定，确定球孢白僵菌，转移到菌种培养基试管中，在25°C温度下培养14天后，于4°C冰箱冷藏保存。2)从罹病僵虫分离目标微生物用接种针小心挑取虫尸上的菌体，接种到选择性培养基上，在25°C 温度下培养7天，分辨菌落并转移到新的选择性培养基平皿上，单菌落培养7-10天，通过菌落表观和显微形态检查鉴定，确定球孢白僵菌，转移到菌种培养基试管中，在25°C温度下培养14天后，于4°C冰箱冷藏保存。保存纯化的球孢白僵菌菌种在PDAY试管培养基中，共得到68个菌株。将接种在PDAY平板培养基上，于25士 1°C培养箱中培养12-14天，收集分生孢子粉，进行生物测定。测定方法为1)在实验室饲养蚜虫；幻将孢子粉配制成定量一定浓度的孢子悬浮液，用 Potter喷雾塔将Iml菌液均勻喷雾到蚜虫体上，每菌株处理100只蚜虫，3次重复；幻将蚜虫置于25°C温度下饲养养7天，每天观察记录蚜虫死亡数量，4)将死亡蚜虫转移到洁净培养皿中，保湿3-5天，观察虫体有无生长白僵菌而成为僵虫；5)根据蚜虫最终死亡率和僵虫率，初步筛选得到4个具有较高毒力作用的菌株；6)对这4初选菌株按照1)- 的步骤，再做进一步测定，得到高效菌株球孢白僵菌BBNS-J9-16 (Beauveria bassiana)。将该菌株于 2011年9月23日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是CGMCC No. 5288.实施例2菌株的生物形态学特征配制PDAY培养基，其组分和配制方法为将新鲜土豆200g加水约IOOOmL煮开 15min，用纱布过滤后留用液体，加葡萄糖20g、酵母浸出粉5g、琼脂15g，加热使琼脂完全融化，定量至IOOOmL,分装到三角瓶中，置于高压蒸气灭菌器中121°C保持20min，待凉至约 60 0C时倒入培养皿中，制成平板待用。在PDAY平板培养基上接种分生孢子，25°C培养2d，肉眼观察可见菌落，菌落菌丝呈白色绒毛状，继续培养3-4d，可见菌落扩大生长，表面有乳白色孢子产生，孢子成熟后，菌落表面富集白色粉状孢子。在凹型载玻片的小室内滴一滴灭菌的PDAY培养基，接种分生孢子，25°C培养 3-4d，于显微镜下观察，可见分生孢子梗着生于营养菌丝上，单生；产孢细胞簇生，呈瓶状， 颈部产孢轴呈“Z”型着生排列；孢子易脱落分散；分生孢子球形，2-3 μ m。如图1所示。实施例3菌株的核糖体ITS区核苷酸序列特征配制LM培养基，其组分和配制方法为称取葡萄糖40g、蛋白胨5g，加水至IOOOmL, 分装至三角瓶，置于高压蒸气灭菌器中121°C保持20min，放凉至室温备用。接种分生孢子至上述培养基中，接种量为1\105孢子/11^，于25士11、200印111摇床上培养48h，用滤纸过滤后留菌丝，挤干水分备用。用CTAB法提取基因组DNA。按常规DNA提取操作进行，得到基因组DNA，如图2所不。以 ITS1-5.8S-ITS2rDNA 区域弓丨物 15，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG 和弓丨物 25‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC进行PCR扩增，得到扩增的DNA片段，如图3所示，将片段进行核苷酸序列检测，得到菌株核糖体ITS核苷酸序列，如SEQ ID No. 1所示。实施例4菌株对蔬菜蚜虫的作用效果在实验室栽种小白菜饲养萝卜蚜Lipaphis erysimi ；用0. 05%的吐温80水溶液将菌株BBNS-J9-16的孢子粉配制成系列浓度梯度为50、10、2、0.4、0. 08 X IO6孢子/mL的孢子悬浮液，取ImL用Potter喷雾塔均勻喷雾到蚜虫体上，每菌株处理100只蚜虫，3次重复；将蚜虫置于25°C温度下饲养养7天，每天观察记录蚜虫死亡数量，将死亡蚜虫转移到洁净培养皿中，保湿3-5天，观察虫体有无生长白僵菌而成为僵虫；根据蚜虫最终死亡率和僵虫率，评价菌株对蚜虫的作用。结果见表1和图4，证明菌株能有效导致蚜虫患病死亡。表1球孢白僵菌BBNS-J9-16对菜蚜的毒力作用
权利要求
1.一种杀虫真菌球孢白僵菌菌株BBNS-J9-16 (Beauveria bassiana)，其保藏编号为 CGMCCNo. 52880
2.根据权利要求1所述的球孢白僵菌菌株BBNS-J9-16，其特征在于，所述菌株的 rDNAITSl-5. 8S-ITS2区域的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
3.权利要求1所述球孢白僵菌菌株BBNS-J9-16用于杀蚜虫的应用。
4.一种高效复合杀虫剂，其特征在于，包含权利要求1所述的球孢白僵菌菌株 BBNS-J9-16的菌体和/或其孢子粉。
5.根据权利要求4所述的高效复合杀虫剂，其特征在于，所述高效复合杀虫剂包含化学杀虫剂。
6.根据权利要求4所述的高效复合杀虫剂，其特征在于，每克所述高效复合杀虫剂含有0. 4 2X IO9孢子和1/300-1/600克的吡虫啉。
7.根据权利要求4所述的高效复合杀虫剂，其特征在于，每克所述高效复合杀虫剂含有0. 4 2X IO9孢子和1/220-1Λ60克的高效氯氰菊酯。
8.根据权利要求4所述的高效复合杀虫剂，其特征在于，每克所述高效复合杀虫剂含有0. 4 2X IO9孢子和1/25-1/37. 5克的乐果。
9.权利要求4、5、6、7或8所述高效复合杀虫剂用于杀蚜虫的应用。
全文摘要
本发明涉及生物防治领域，具体地涉及一种杀虫真菌及其应用。本发明提供了一种杀虫真菌球孢白僵菌菌株BBNS-J9-16(Beauveria bassiana)，其保藏编号为CGMCC No.5288。本发明还提供了所述球孢白僵菌菌株BBNS-J9-16用于杀蚜虫的应用，且提供了一种高效复合杀虫剂，其包含上述球孢白僵菌菌株BBNS-J9-16的菌体和/或其孢子粉。本发明的高效复合杀虫剂，利用与环境友好兼容的昆虫真菌感染寄主从而控制害虫，实现保护农作物同时，减少化学农药的使用，对保障农产品安全和农业环境安全起积极作用。
文档编号C12N1/14GK102363750SQ20111032606
公开日2012年2月29日 申请日期2011年10月24日 优先权日2011年10月24日
发明者农向群, 张泽华, 张英财, 曹广春, 王广君 申请人:中国农业科学院植物保护研究所