专利名称：一种利用传代成纤维细胞生产鸡新城疫活疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及一种鸡新城疫活疫苗的制备方法，特别涉及一种通过利用传代成纤维细胞生产鸡新城疫活疫苗的方法，属于疫苗制备领域。
背景技术：
新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒 (Newcastle disease virus,NDV)引起的一种急性、高度接触性禽类传染病，对养禽业危害极大，被国际兽医局列为A类传染病。NDV只有1个血清型，但根据其毒力的不同，可以分为强毒株、中等毒力株和弱毒株。强毒株又可称为速发型毒株，中等毒力株为中发型毒株，弱毒株为缓发型毒株。根据其对不同组织器官的侵嗜性又可将有毒力的毒株分为嗜内脏和嗜神经型毒株，前者主要引起消化道出血等损害，后者导致的疾病主要表现为神经症状和呼吸道损伤。我国于1948年首次分离到NDV，尽管我国新城疫免疫接种已经普及多年并已基本上控制了典型新城疫的流行，但非典型ND仍时有发生，严重威胁着养鸡业的健康发展。目前疫苗是控制本病发生的重要手段。自从1940开始，就在全球范围内使用新城疫疫苗，最为成功的疫苗是由缓发型病毒株和经过精心筛选的某些中发型病毒株组成的新城疫活病毒疫苗。灭活苗自70年代开始应用，分单纯灭活苗和油乳剂灭活苗，目前应用较多的是油乳剂灭活苗。油乳剂灭活苗可以产生坚强而持久的免疫力，不会通过疫苗的使用而扩散病原。我国目前常用的弱毒疫苗是I系，La Sota疫苗，V4疫苗。最近几年，随着细胞培养技术的发展，细胞苗和克隆苗相继问世。克隆苗具有抗原性纯一，免疫原性强的特点。我国从美国引进的克隆N-79株型LaSota弱毒株，从I系中挑选出的克隆-30及克隆-83是具有良好免疫原性而且遗传性非常稳定的弱毒疫苗。细胞苗具有成本低容易生产的特点，而传代细胞可避免鸡源性潜在疾病的感染。成纤维细胞是结缔组织最主要的细胞成分，它是由胚胎时期的间充质细胞分化而来，在分泌细胞外基质成分和构建细胞外基质中扮演着十分重要的角色，在组织创伤修复过程中也发挥着重要的作用。由于成纤维细胞相对容易获得，而且增殖能力强，适应性强，具有良好的耐受性，性状比较稳定，不易发生转化。正是具备以上的特点，使得成纤维细胞除了应用于细胞和分子生物学的研究，还被广泛应用于病毒学研究领域，同时也是疫苗生产的重要细胞资源。但目前市售的I系活疫苗绝大部分来源于鸡胚组织苗，因为利用现有的原代成纤维细胞生产工艺所生产的I系病毒原液，病毒滴度不稳定，批间差异较大。故此，针对原代成纤维细胞产毒不稳定这一现状，本发明在进行了大量实验研究的基础上，得出了本发明
发明内容
针对上述存在的问题，本实验通过采用鸡胚成纤维细胞传代技术，并应用于生实践，将传代成纤维细胞替代原代成纤维细胞。本发明的目的是通过以下技术方案实现的本发明的一种利用传代成纤维细胞生产鸡新城疫活疫苗的方法，其特征在于以传代后的成纤维细胞作为病毒株接种细胞进行细胞毒液的制备。本发明的一种利用传代成纤维细胞生产鸡新城疫活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤(1)消化对长成单层的原代鸡胚成纤维细胞进行消化处理；(2)冻存经步骤(1)消化处理后的原代鸡胚成纤维细胞移入液氮罐中保存；(3)复苏将步骤( 冻存后的细胞定期复苏，检查细胞的存活率，加入DMEM培养液中进行培养，待细胞完全贴壁即可使用；(4)传代对步骤(3)得到的细胞进行传代培养；(5)制苗用细胞毒液的制备将病毒株接种经步骤(4)传代培养后的鸡胚成纤维细胞，接毒后置36 37°C继续培养，观察细胞病变，当75%以上的细胞出现圆缩、折光率变强等病变时，将细胞培养瓶置低温冻结，再融化后收获细胞培养物于灭菌容器内，放_15°C以下保存备用；(6)制苗将有效量的步骤(5)得到的细胞毒液加入佐剂制成所述的鸡新城疫活疫苗。在本发明的一个具体实施例中，所述的步骤(1)中消化处理具体包括以下步骤(1)在显微镜下观察长成单层的原代鸡胚成纤维细胞，待80%铺满便可经行消化；(2)弃去细胞瓶中的培养液，按细胞瓶容量10%的比例加入0. 01mol/L PBS，轻轻平行晃动培养瓶，洗去残留的培养液，再缓慢地吸出清洗液，弃之，重复此操作3次；(3)向清洗过的细胞瓶中加入0. 25%的胰酶消化液，添加量为细胞瓶容量的1%。加完后立即放入37°C水浴中进行消化0. 5 aiiin。待细胞完全脱落后，立即向其加入细胞瓶容量的体积的胎牛血清，混勻，以中止胰酶的消化作用。(4)在向培养瓶中加入细胞瓶容量10%体积的含10%胎牛血清的DMEM培养液，混勻，倒入灭菌的离心管中，2000r/min离心15min，弃上清。(5)重复步骤0)3次。在本发明的一个具体实施例中，所述的步骤O)中的冻存是指将步骤O)消化处理后的原代鸡胚成纤维细胞用含10% DMSO的DMEM培养液重新悬浮，分装于冻干管中，Iml/管，细胞密度要不低于1 2X106/ml，4°C放置20min，_80°C过夜后，移入液氮罐中保存。在本发明的一个具体实施例中，所述的步骤(3)中复苏时从液氮罐中取出原代鸡胚成纤维细胞的冻干管后迅速放入37°C水浴中融化，融化后从水浴中取出放置冰盒上，然后加入DMEM培养液中进行培养，待细胞完全贴壁即可使用。在本发明的一个具体实施例中，所述的步骤中细胞的传代培养具体包括以下步骤(1)在显微镜下观察长成单层的鸡胚成纤维细胞，待80%铺满便可经行消化；(2)弃去细胞瓶中的培养液，按细胞瓶容量的10%的比例加入0. 01mol/L PBS，轻轻平行晃动培养瓶，洗去残留的培养液，再缓慢地吸出清洗液，弃之，重复此操作3次；(3)向清洗过的细胞瓶中加入0. 25%的胰酶消化液，添加量为细胞瓶容量的1%。加完后立即放入37°C水浴中进行消化0. 5 aiiin。待细胞完全脱落后，立即向其加入体积的胎牛血清，混勻，以中止胰酶的消化作用；(4)在向培养瓶中加入细胞瓶容量30%体积的含10%胎牛血清的DMEM培养液，混勻，另取2个相同规格培养瓶，每培养瓶中加入细胞瓶容量10%体积的细胞悬液；(5)至37°C培养48h 72h，待细胞贴壁长成单层即可使用。在本发明的一个具体实施例中，所述的步骤(5)中将病毒株用细胞维持液做适当稀释后，按细胞液体积的0. 接种经步骤(4)传代培养后的鸡胚成纤维细胞，将PH调至7. 2。在本发明的一个具体实施例中，所述的病毒株为鸡新城疫I系弱毒株。更优选的，所述的病毒株为鸡新城疫病毒中等毒力株Mukteswar株。本发明的一种利用传代成纤维细胞生产鸡新城疫活疫苗的方法，保证了在细胞环境相对一致的情况下，接种鸡新城疫I系病毒，为病毒的增殖提供了稳定的生长条件，缩小了产品的批间差异，提升了产品品质，保证了疫苗质量的稳定性。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1鸡新城疫活疫苗的制备一、材料菌株鸡新城疫病毒中等毒力株Mukteswar株(I系)购自中国兽医药品监察所，鸡胚成纤维细胞为哈药集团生物疫苗有限公司研发中心制备、传代和保存试剂胎牛血清和DMEM购自hvitrogen GIBC0、胰酶购自Amresco、二甲基亚砜购自 sigma二、鸡新城疫活疫苗的制备方法1.细胞的制备1. 1 消化1. 1. 1在显微镜下观察长成单层的鸡胚成纤维细胞，待80%铺满便可经行消化。1. 1.2弃去细胞瓶中的培养液，按细胞瓶容量10%的比例加入O.Olmol/L PBS，轻轻平行晃动培养瓶，洗去残留的培养液，再缓慢地吸出清洗液，弃之。重复此操作3次。1. 1. 3向清洗过的细胞瓶中加入0. 25 %的胰酶消化液，添加量为细胞瓶容量的1%。加完后立即放入37°C水浴中进行消化0.5 aiiin。待细胞完全脱落后，立即向其加入细胞瓶容量的体积的胎牛血清，混勻，以中止胰酶的消化作用。1. 1. 4在向培养瓶中加入细胞瓶容量10%体积的含10%胎牛血清的DMEM培养液，混勻，倒入灭菌的离心管中，2000r/min离心15min，弃上清。1.1. 5 重复 1.1. 4 步骤 3 次。
1. 2 冻存沉淀用含10% DMSO(二甲基亚砜)的DMEM培养液重新悬浮，分装于冻干管中，Iml/管，细胞密度要不低于1 2X106/ml，4°C放置20min，_80°C过夜后，移入液氮罐中保存。1. 3 复苏细胞冻存后定期复苏，检查细胞的存活率，复苏时从液氮罐中取出冻干管后迅速放入37°C水浴中融化，融化后从水浴中取出放置冰盒上，然后加入DMEM培养液中进行培养，待细胞完全贴壁即可使用。1. 4 传代1. 4. 1在显微镜下观察长成单层的鸡胚成纤维细胞，待80%铺满便可经行消化。1. 4. 2弃去细胞瓶中的培养液，按细胞瓶容量的10%的比例加入PBS，轻轻平行晃动培养瓶，洗去残留的培养液，再缓慢地吸出清洗液，弃之。重复此操作3次。1.4.3向清洗过的细胞瓶中加入0.25%的胰酶消化液，添加量为细胞瓶容量的1%。加完后立即放入37°C水浴中进行消化0.5 aiiin。待细胞完全脱落后，立即向其加入体积的胎牛血清，混勻，以中止胰酶的消化作用。1. 4. 4在向培养瓶中加入细胞瓶容量30%体积的含10%胎牛血清的DMEM培养液，混勻，另取2个相同规格培养瓶，每培养瓶中加入细胞瓶容量10%体积的细胞悬液。1. 4. 5至37°C培养48h 72h，待细胞贴壁长成单层即可使用。2制苗用细胞毒液的制备2. 1接种将鸡新城疫I系中等毒力Mukteswar株用细胞维持液稀释100倍，按细胞液量的0. 接毒，将PH调至7. 2。2. 2培养和观察接毒后置37°C继续培养，观察细胞病变。2. 3收获当75%以上的细胞出现圆缩、折光率变强等病变时，将细胞培养瓶置低温冻结，再融化后收获细胞培养物于灭菌容器内，每若干瓶为一组，放_15°C以下保存备用。保存时间不超过2个月。3半成品检验3. 1无菌检验鸡胚毒液或细胞毒液每组分别取样，应无菌生长。3. 2鸡胚液红细胞凝集价测定每组分别取样，测定红细胞凝集价，应> 1 64 (微量法)。3. 3病毒含量测定从每组分别取样，等量混合，以0. 01mol/L PBS稀释至10-6 10-8，各接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚、尿囊腔内接种0. lml。记录鸡胚在M 72小时死亡、胎儿有明显病痕者，计算ELD50，每0. Iml病毒含量> 107. 0ELD50者，方可用于配苗。4配苗及分装将检验合格的若干组细胞毒液混合于同一容器内，按规定羽份加一定比例的冻干保护剂(甘氨酸0. 1% (w/w)、硫代硫酸钠1% (w/w)、蔗糖5% (w/w)、脱脂乳5% (w/w)),充分混合后，定量分装，每羽份病毒含量应> 105.0ELD50。分装后迅速进行冷冻真空干燥。实施例2鸡新城疫活疫苗的免疫效果为了验证新方法的生产性能，故在沿用《规程》用鸡胚制备鸡新城疫I系活疫苗的同时，还采用新方法用鸡胚成纤维细胞制备了 10批I系活疫苗，现将其中一些指标的比较结果总结如下按《规程》生产方法如下制苗用细胞毒液的制备1、接种将鸡新城疫I系弱毒株用细胞维持液稀释100倍，按原代鸡胚成纤维细胞细胞液量的0. 接毒，将PH调至7. 2。2、培养和观察接毒后置36 37°C继续培养，观察细胞病变。3、收获当75%以上的细胞出现圆缩、折光率变强等病变时，将细胞培养瓶置低温冻结，再融化后收获细胞培养物于灭菌容器内，每若干瓶为一组，放_15°C以下保存备用。保存时间不超过2个月。4半成品检验4. 1无菌检验鸡胚毒液或细胞毒液每组分别取样，应无菌生长。4. 2鸡胚液红细胞凝集价测定每组分别取样，测定红细胞凝集价，应> 1 64(微量法)。4. 3病毒含量测定从每组分别取样，等量混合，以灭菌生理盐水稀释至10-6 10-8，各接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚、尿囊腔内接种0. lml。记录鸡胚在M 72小时死亡、胎儿有明显病痕者，计算ELD50，每0. Iml病毒含量> 107. 0ELD50者，方可用于配苗。5配苗及分装将检验合格的若干组细胞毒液混合于同一容器内，按规定羽份加一定比例的5%蔗糖脱脂牛奶做稳定剂。同时加入适宜的抗生素，充分混合后，定量分装，每羽份病毒含量应> 105.0ELD50。分装后迅速进行冷冻真空干燥。按新的生产方法与按《规程》生产方法生产的疫苗比较，如表1-5所示表1两种生产方法半成品红细胞凝集价比较表
权利要求
1.一种利用传代成纤维细胞生产鸡新城疫活疫苗的方法，其特征在于以传代后的成纤维细胞作为病毒株接种细胞进行细胞毒液的制备。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤(1)消化对长成单层的原代鸡胚成纤维细胞进行消化处理；(2)冻存经步骤(1)消化处理后的原代鸡胚成纤维细胞移入液氮罐中保存；(3)复苏将步骤( 冻存后的细胞定期复苏，检查细胞的存活率，加入DMEM培养液中进行培养，待细胞完全贴壁即可使用；(4)传代对步骤( 得到的细胞进行传代培养；(5)制苗用细胞毒液的制备将病毒株接种经步骤(4)传代培养后的鸡胚成纤维细胞，接毒后置36 37°C继续培养，观察细胞病变，当75%以上的细胞出现圆缩、折光率变强等病变时，将细胞培养瓶置低温冻结，再融化后收获细胞培养物于灭菌容器内，放_15°C以下保存备用；(6)制苗将有效量的步骤( 得到的细胞毒液加入佐剂制成所述的鸡新城疫活疫苗。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤(1)中消化处理具体包括以下步骤(1)在显微镜下观察长成单层的原代鸡胚成纤维细胞，待80%铺满便可经行消化；(2)弃去细胞瓶中的培养液，按细胞瓶容量10%的比例加入O.Olmol/LPBS，轻轻平行晃动培养瓶，洗去残留的培养液，再缓慢地吸出清洗液，弃之，重复此操作3次；(3)向清洗过的细胞瓶中加入0.25%的胰酶消化液，添加量为细胞瓶容量的1%;加完后立即放入37°C水浴中进行消化0. 5 aiiin ；待细胞完全脱落后，立即向其加入细胞瓶容量的体积的胎牛血清，混勻，以中止胰酶的消化作用；(4)在向培养瓶中加入细胞瓶容量10%体积的含10%胎牛血清的DMEM培养液，混勻，倒入灭菌的离心管中，2000r/min离心15min，弃上清；(5)重复步骤(4)3次。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤O)中的冻存是指将步骤(2)消化处理后的原代鸡胚成纤维细胞用含10% DMSO的DMEM培养液重新悬浮，分装于冻干管中，Iml/管，细胞密度要不低于1 2X106/ml，4°C放置20min，_80°C过夜后，移入液氮罐中保存。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤(3)中复苏时从液氮罐中取出原代鸡胚成纤维细胞的冻干管后迅速放入37°C水浴中融化，融化后从水浴中取出放置冰盒上，然后加入DMEM培养液中进行培养，待细胞完全贴壁即可使用。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤中细胞的传代培养具体包括以下步骤(1)在显微镜下观察长成单层的鸡胚成纤维细胞，待80%铺满便可经行消化；(2)弃去细胞瓶中的培养液，按细胞瓶容量的10%的比例加入O.Olmol/LPBS，轻轻平行晃动培养瓶，洗去残留的培养液，再缓慢地吸出清洗液，弃之，重复此操作3次；(3)向清洗过的细胞瓶中加入0.25%的胰酶消化液，添加量为细胞瓶容量的；加完后立即放入37°C水浴中进行消化0. 5 aiiin ；待细胞完全脱落后，立即向其加入1 %体积的胎牛血清，混勻，以中止胰酶的消化作用；(4)在向培养瓶中加入细胞瓶容量30%体积的含10%胎牛血清的DMEM培养液，混勻，另取2个相同规格培养瓶，每培养瓶中加入细胞瓶容量10%体积的细胞悬液；(5)至37°C培养4 72h，待细胞贴壁长成单层即可使用。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤(5)中将病毒株用细胞维持液做适当稀释后，按细胞液体积的0. 接种经步骤(4)传代培养后的鸡胚成纤维细胞，将PH调至7. 2。
8.如权利要求1、2或7所述的方法，其特征在于所述的病毒株为鸡新城疫I系弱毒株。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述的病毒株为鸡新城疫病毒中等毒力株Mukteswar 株。
全文摘要
本发明公开了一种利用传代成纤维细胞生产鸡新城疫活疫苗的方法，其特征在于克服现有的原代成纤维细胞生产工艺所生产的I系病毒原液，病毒滴度不稳定，批间差异较大的缺陷，通过使用传代成纤维细胞代替原代成纤维细胞作为病毒接种细胞，进行病毒的增值。本发明的一种利用传代成纤维细胞生产鸡新城疫活疫苗的方法，保证了在细胞环境相对一致的情况下，接种鸡新城疫I系病毒，为病毒的增殖提供了稳定的生长条件，缩小了产品的批间差异，提升了产品品质，保证了疫苗质量的稳定性。
文档编号C12N7/00GK102380093SQ201110327710
公开日2012年3月21日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者丁国杰, 姜力, 孙德君, 张杨, 王彬, 袁明霞 申请人:哈药集团生物疫苗有限公司