专利名称：一种生产α-酮戊二酸的方法及其专用菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生产α-酮戊二酸的方法及其专用菌株，特别涉及一种利用蔗糖和丙酮酸生产α-酮戊二酸的方法。
背景技术：
α -酮戍二酸(a-ketoglutarate, a-KG),又称 α -胶酮酸，分子式为 C5H605。α-酮戊二酸为白色或类白色结晶粉末，易溶于水。α-酮戊二酸主要存在于各种类型的干酪、啤酒和咖啡中，属天然等同香料。α -酮戊二酸在微生物细胞的代谢中起着重要的作用，是合成氨基酸、蛋白质、维生素的重要前体物质。α-酮戊二酸作为一种营养强化剂广泛应用于食品、医药、有机合成、化妆品及饲料等工业中。随着应用范围的不断扩大以及市场需求的不断增长，工业化生产α-酮戊二酸已经成为各个行业的需求。目前工业上生产α-酮戊二酸通常采用化学合成法，很少使用发酵法，由于有机化学合成存在着过程复杂以及存在安全隐患等缺点，因此利用微生物有效发酵生产α-酮戊二酸的工艺过程和技术路线具有重要的学术价值和广阔的市场前景。关于α -酮戍二酸的研究最初起源于1946年，Lockwood和Stodola对利用细菌生物合成α-酮戊二酸进行了初步的研究，他们率先发现荧光极毛杆菌(Pseudomonasfluorescens)具有少量合成α-酮戍二酸的能力。随后1955年Asai等人发现假单胞菌种(Pseudomonas genus)、产气杆菌(Aerobacter aerogenes)和粘质沙雷氏菌(Serraitamarcescens)具有过量合成α-酮戍二酸的能力。之后关于发酵法生产α -酮戍二酸的研究和报道逐年增加。以葡萄糖为底物发酵生产α-酮戊二酸的研究主要集中在以下几种菌株中:Bacillus natto、Bacterium Succinicum 和 Serraita marcescens 等细菌。然而真菌发酵生产α -酮戊二酸的报道则非常少，直到20世纪60年代末才出现关于酵母菌生产α -酮戍二酸的报道。1967年Tsugawa等人首次发现解脂亚洛酵母(Yarrowia Iipolytica)具有过量合成α -酮戊二酸的能力，并且对解脂亚洛酵母的营养需求与环境条件进行全面系统的研究。在21世纪初，国外学者围绕Yarrowia Iipolytica利用乙醇为碳源过量合成α -酮戊二酸做了大量的研究工作，其中以ΙΓ Chenko等人为代表，他们系统研究了 ΝΗ4+、O2和关键代谢酶以及氮源代谢酶对Yarrowia Iipolytica利用乙醇生产α -酮戍二酸的影响。在国内，关于发酵法生产α-酮戊二酸的研究报道较少，其发酵生产菌株主要是光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)。如刘立明等通过诱变得到菌株T.glabrata CCTCCM202019，研究发现CaCO3的添加促进了 α -酮戊二酸的积累，其中Ca2+可显著提高丙酮酸羧化酶的活性对α -酮戊二酸的积累起主要作用，而CO/—则有可能作为丙酮酸羧化反应的底物起辅助作用，两者对α-酮戊二酸的积累具有协同效应。黄慧娟通过提高辅因子水平从而提高合成α-酮戊二酸的前体物质乙酰CoA和草酰乙酸的浓度，达到了提高α-酮戊二酸产量的目的，并进一步研究了碳 氮源浓度和丙酮酸浓度对α -酮戊二酸产量的影响。目前国内外关于酵母菌之外的真菌发酵生产α-酮戊二酸的报道很少，尚未见到伞枝犁头霉(Lichtheimia corymb if era)产α-酮戍二酸的研究。因此伞枝犁头霉发酵生产α-酮戊二酸的研究具有较好的科研价值和应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产α -酮戊二酸的方法及其专用菌株。本发明提供的伞枝犁头霉(Lichtheimia corymbifera),命名为Dl,是从酒曲中筛选得到的，已于2011年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，菌种保藏号为CGMCCN0.4974。伞枝犁头霉(Lichtheimia corymbifera) Dl CGMCC N0.4974 简称伞枝犁头霉 Dl。本发明还保护所述伞枝犁头霉Dl在生产α-酮戊二酸中的应用。所述应用中，具体可以以蔗糖和/或丙酮酸为底物，通过发酵所述伞枝犁头霉Dl生产α-酮戊二酸。所述发酵的温度可为 30°C _45°C，优选为 30°C、34°C、37°C、40°C*45°C。本发明还保护一种用于发酵所述伞枝犁头霉Dl的培养基，包括碳源、氮源、无机盐和水；所述碳源为如下物质中的至少一种:葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、糯米淀粉、玉米淀粉和可溶性淀粉；所述氮源为如下物质中的至少一种:蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、氯化铵和硝酸钠；所述无机盐为如下物质中的至少一种:KH2P04、MgS04、FeS04、CaCO3和NaCl。所述培养基具体可为将如下物质定容至IL得到的培养基(自然pH):所述碳源10g-80g(如 10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g 或 80g)、所述氮源 0.5g_3g(如 0.5g、l.0g、1.5g、2.0g,2.5g 或 3.0g) 'KH2PO41.36g、MgS04.7Η200.2g、FeS04.7H20 0.01g、NaCl 2g、玉米浆 0.5g、CaCO3 20g-60g (如 20g、30g、40g、50g 或 60g)。所述培养基还可包括生长因子；所述生长因子为如下物质中的至少一种:吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、曲拉通100、L-盐酸噻胺、L-精氨酸单盐、L-盐酸吡哆辛、L-烟酸、核黄素、叶酸、L-胱氨酸、L-组氨酸、L-酪氨酸、L-天冬氨酸、甲硫氨酸、L-谷氨酸、脯氨酸、赖氨酸、DL-白氨酸、半胱氨酸和精氨酸。所述培养基具体可为将如下物质定容至IL得到的培养基(自然pH):所述碳源10g-80g(如 10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g 或 80g)、所述氮源 0.5g_3g(如 0.5g、l.0g、1.5g、2.0g,2.5g 或 3.0g)、KH2PO41.36g、MgSO4.7Η200.2g、FeSO4.7H20 0.0lg、NaCl 2g、玉米浆 0.5g、CaCO3 20g-6 0g(如 20g、30g、40g、50g 或 60g)、所述生长因子 0.5g-3.0g(如
0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g 或 3.0g)。本发明还保护另一种用于发酵所述伞枝犁头霉Dl的培养基，包括丙酮酸、氮源、无机盐和水；所述氮源为如下物质中的至少一种:氯化铵、硫酸铵、硝酸钠、豆柏粉、酵母膏、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨和胰蛋白胨；所述无机盐为如下物质中的至少一种:kh2po4、MgSO4, FeSO4, CaCO3 和 NaCl。所述培养基具体可为将如下物质定容至IL得到的培养基(自然pH):丙酮酸10g-80g(如 10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g 或 80g)、所述氮源 0.25g-3.0g (如 0.25g、
0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g*3.0g)、KH2P041.36g、MgS04.7Η20 0.2g、FeS04.7Η20 0.0lg、NaCl 2g、玉米浆 0.5g、CaC03 40g_80g (如 40g、50g、60g、70g 或 80g)。所述培养基还可包括生长因子；所述生长因子为如下物质中的至少一种:吐温
20、吐温40、吐温60、吐温80、曲拉通100、L-盐酸噻胺、L-精氨酸单盐、L-盐酸吡哆辛、L-抗坏血酸、L-精氨酸单盐酸盐、L-色氨酸、DL-白氨酸、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-酪氨酸和L-组氨酸。所述培养基具体可为将如下物质定容至IL得到的培养基(自然pH):丙酮酸10g-80g(如 10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g 或 80g)、所述氮源 0.25g-3.0g (如 0.25g、
0.5g、l.0g、l.5g、2.0g,2.5g 或 3.0g)、KH2PO41.36g、MgSO4.7H20 0.2g、FeSO4.7H20
0.0lg、NaCl 2g、玉米浆 0.5g、CaCO3 40g_80g (如 40g、50g、60g、70g 或 80g)、所述生长因子
0.5g-3.0g (如 0.5g、l.0g、l.5g、2.0g、2.5g 或 3.0g)。本发明还保护一种生产α-酮戊二酸的方法，是采用以上任一所述的培养基作为发酵培养基，发酵所述伞枝犁头霉Dl，得到α -酮戊二酸。所述发酵的温度可为30°C _45°C，优选为30°C、34°C、37°C、40°C或45°C。所述发酵中，所述发酵培养基的装液量(即发酵初始时刻，发酵培养基占发酵 容器容量的体积百分含量)可为10 % -30 % (如10 %、15 %、20 %、25%或 30% )。所述发酵的时间可为 24h-120h(如 24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h或 120h)。本发明所提供的伞枝犁头霉D1，菌种稳定性好、具有较好的产α-酮戊二酸能力、发酵成本较低(底物来源广泛，价格便宜)。本发明还对伞枝犁头霉Dl的发酵条件进行了优化。因此，采用本发明菌株和方法生产α-酮戊二酸，产量高、成本低，具有较好的科研价值和工业化应用前景。
图1不同(NH4)2SO4添加量对伞枝犁头霉Dl发酵蔗糖产α -酮戊二酸的影响。图2叶酸浓度对伞枝犁头霉Dl发酵蔗糖产α -酮戊二酸的影响。图3装液量对伞枝犁头霉Dl发酵蔗糖产α _酮戊二酸的影响。图4伞枝犁头霉利用蔗糖发酵产α -酮戊二酸历程。图5豆柏粉浓度对伞枝犁头霉Dl发酵丙酮酸产α _酮戊二酸影响。图6不同吐温40浓度对伞枝犁头霉Dl发酵丙酮酸产α -酮戊二酸的影响。图7装液量对伞枝犁头霉Dl发酵丙酮酸产α -酮戊二酸影响。图8伞枝犁头霉利用丙酮酸产α -酮戊二酸历程。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中的培养基均经115°C灭菌30min(或121°C灭菌20min)。α-酮戊二酸、丙酮酸购自SIGMA公司。葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、糯米淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉，蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、豆柏粉，吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、曲拉通100、L-盐酸噻胺、L-精氨酸单盐、L-盐酸吡哆辛、L-抗坏血酸、L-烟酸、核黄素、叶酸、L-胱氨酸、L-组氨酸、L-酪氨酸、L-天冬氨酸、甲硫氨酸、L-谷氨酸、L-色氨酸、脯氨酸、赖氨酸、DL-白氨酸、半胱氨酸、精氨酸、L-精氨酸单盐酸盐，KH2PO4,MgSO4.7Η20, FeSO4.7H20、CaC03、NaCl、脱氧胆酸钠、溴甲酚绿和琼脂粉均为分析纯，购自北京化工厂。马铃薯购自市场。
丙酮酸和α -酮戊二酸的含量均采用高效液相色谱分析法检测。色谱柱为迪马公司的C18反相柱，250 X 4.6(5 μ m)。流动相为0.01mol/L的磷酸氢二铵溶液，用磷酸调pH至2.6，经0.45 μ m孔径合成纤维素酯膜过滤后，超声脱气lh。洗脱过程中，流动相的流速为0.8mL/min,检测波长为210nm,进样量为20 μ L,柱温为室温。反应终止时,每升发酵液中α-酮戊二酸的含量即为α-酮戊二酸产量。反应初始时，每升发酵液中的底物含量即为底物初始量。反应终止时，每升发酵液中的底物的含量即为底物残留量。实施例2中的转化率=α-酮戊二酸产量+底物初始含量X 100 %。实施例3中的转化率=α-酮戊二酸产量+ (丙酮酸初始含量-丙酮酸残留量)X 100%。丙酮酸的出峰位置为4.57min，用丙酮酸标准品制作的标准曲线为I = (2*107) x+220863, x为峰面积，y为丙酮酸浓度(g/L)。α-酮戊二酸的出峰位置为6.15min，用α-酮戊二酸标准品制作的标准曲线为y= (2*107)x-74809, X为峰面积，y为α -酮戊二酸浓度(g/L)。蔗糖残留量的检测方法为领域内的通用方法，参考文献:杨挺.低分子糖的高效液相色谱分析[J].华南师范学报，1997，3:26-30。实施例1、伞枝犁头霉Dl的分离和鉴定一、伞枝犁头霉Dl的分离伞枝犁头霉Dl是从酒曲样本中筛选得到的。初筛培养基:PDA培养基中添加1.0g/L脱氧胆酸钠和0.lg/L溴甲酚绿，自然pH。斜面培养基(PDA培养基):马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH。发酵培养基:葡萄糖80g/L，(NH4)2SO4 lg/L, KH2PO41.36g/L，MgSO4.7H20 0.2g/L，FeSO4.7H20 0.0lg/L, NaCl 2g/L，玉米浆 0.5g/L，CaCO3 30g/L(单独灭菌)，自然 pH。酒曲样本稀释后涂布于分离培养基中，在37°C恒温培养箱中培养。待分离培养基中有菌落长出，将菌株接种到初筛培养基，将所有在菌落周围能使指示剂培养基变黄的菌株分别接种到发酵培养基，37°C、200r/min培养48h。发酵结束后取ImL发酵液于1.5mL离心管中，离心(12000r/min，IOmin)，取上清，稀释适当倍数后经0.45 μ m孔径水相过滤膜过滤，采用HPLC检测上述样品中产酸的种类及产量。二、伞枝犁头霉Dl的鉴定伞枝犁头霉Dl的形态特征:在葡萄糖营养琼脂培养基上生长良好，最适生长温度为35-37°C ;在营养琼脂培养基中菌落疏松，菌丝匍匐爬行，呈白色；孢囊梗自菌丝上发生，简单不分枝至分枝多次，单生或成束；在孢囊梗或其分枝的顶端形成孢子囊，全部为大型孢子囊，孢子囊内有发达的囊轴，孢囊梗不与假根对着生长，孢子囊梨形，近无色至淡灰色；孢子囊下面还有孢囊下泡或楔形的囊托；孢子囊成熟时消解或破裂，释放出孢囊孢子。伞枝犁头霉Dl的18S rDNA测序结果见序列表的序列I (1696bp)。综合形态特征和测序结果，菌株Dl属于犁头霉属(Absidia)，伞枝犁头霉种(Lichtheimia corymbifera)。2011年6月21日将伞枝犁头霉(Lichtheimia corymbifera)Dl保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC N0.4974。伞枝犁头霉(Lichtheimia corymbifera ) Dl CGMCC N0.4974 简称伞枝犁头霉 Dl。实施例2、以蔗糖为底物摇瓶发酵生产α -酮戊二酸的条件优化—、发酵培养基中碳源的筛选
1、碳源的筛选发酵培养基是将如下物质定容至IL得到的(自然pH):碳源60g、(NH4)2SO4 lg、KH2PO41.36g、MgS04.7H20 0.2g、FeS04.7H20 0.0lg,NaCl 2g、玉米浆 0.5g、CaCO3 30g。分别采用如下7种碳源:葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、糯米淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉。实验方法:在250mL三角瓶中装入50mL发酵培养基，接种200 μ L伞枝犁头霉Dl的孢子液(孢子液中的孢子浓度为I X IO8个孢子/mL)，在37°C恒温空气浴往复式摇床上以200r/min振荡培养72h ;取发酵液，12000r/min离心IOmin,吸取上清液稀释适当倍数后经0.45 μ m孔径水相过滤膜过滤，检测α -产酮戊二酸的产量并计算转化率。采用不同碳源的发酵培养基，α -产酮戊二酸的产量和转化率见表I。将蔗糖作为底物时，生产α-产酮戊二酸的能力最强，蔗糖初始量为60g/L时，发酵液中的α-产酮戊二酸含量为11.87g/L。表I不同碳源对伞枝犁头霉Dl产α-产酮戊二酸的影响
权利要求
1.伞枝犁头霉(Lichtheimiacorymb if era) Dl,它的保藏编号为 CGMCC N0.4974。
2.权利要求1所述伞枝犁头霉Dl在生产α-酮戊二酸中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于:所述应用中，以蔗糖和/或丙酮酸为底物，通过发酵所述伞枝犁头霉Dl生产α -酮戊二酸。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于:所述发酵的温度为30°C-45°C。
5.用于发酵权利要求1所述伞枝犁头霉Dl的培养基，包括碳源、氮源、无机盐和水；所述碳源为如下物质中的至少一种:葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、糯米淀粉、玉米淀粉和可溶性淀粉；所述氮源为如下物质中的至少一种:蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、氯化铵和硝酸钠；所述无机盐为如下物质中的至少一种:KH2P04、MgSO4, FeSO4, CaCO3和NaCl。
6.如权利要求5所述的培养基，其特征在于:所述培养基还包括生长因子；所述生长因子为如下物质中的至少一种:吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、曲拉通100、L-盐酸噻胺、L-精氨酸单盐、L-盐酸吡哆辛、L-烟酸、核黄素、叶酸、L-胱氨酸、L-组氨酸、L-酪氨酸、L-天冬氨酸、甲硫氨酸、L-谷氨酸、脯氨酸、赖氨酸、DL-白氨酸、半胱氨酸和精氨酸。
7.用于发酵权利要求1所述伞枝犁头霉Dl的培养基，包括丙酮酸、氮源、无机盐和水；所述氮源为如下物质中的至少一种:氯化铵、硫酸铵、硝酸钠、豆柏粉、酵母膏、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨和胰蛋白胨；所述·无机盐为如下物质中的至少一种:KH2P04、MgSO4, FeSO4, CaCO3和 NaCl。
8.如权利要求7所述的培养基，其特征在于:所述培养基还包括生长因子；所述生长因子为如下物质中的至少一种:吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、曲拉通100、L-盐酸噻胺、L-精氨酸单盐、L-盐酸吡哆辛、L-抗坏血酸、L-精氨酸单盐酸盐、L-色氨酸、DL-白氨酸、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-酪氨酸和L-组氨酸。
9.一种生产α -酮戊二酸的方法，是采用权利要求5至8中任一所述的培养基作为发酵培养基，发酵权利要求1所述伞枝犁头霉D1，得到α -酮戊二酸。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于:所述发酵的温度为30°C-45°c。
全文摘要
本发明公开了一种生产α-酮戊二酸的方法及其专用菌株。本发明提供的伞枝犁头霉(Lichtheimia corymbifera)D1，它的保藏编号为CGMCC No.4974。本发明所提供的伞枝犁头霉D1，菌种稳定性好、具有较好的产α-酮戊二酸能力、发酵成本较低(底物来源广泛，价格便宜)，具有较好的工业化应用前景。本发明还对伞枝犁头霉D1的发酵条件进行了优化。本发明方法生产α-酮戊二酸，具有较好的科研价值和工业化应用前景。
文档编号C12R1/645GK103074232SQ20111032927
公开日2013年5月1日 申请日期2011年10月26日 优先权日2011年10月26日
发明者闫巧娟, 徐忠义, 江正强, 蔡威 申请人:中国农业大学