专利名称：miR-45调控线虫寿命的应用和方法
技术领域：
本发明涉及miR-45调控线虫寿命的应用，以及调控线虫寿命的方法和调节线虫体内微小RNA表达量的方法。
背景技术：
多年来，科学家们对衰老的机理一直众说纷纭。现在人们普遍认为:衰老主要是由于身体的正常防卫及修复机能衰退导致的。随着遗传学和分子生物学的发展，生物衰老机理的研究在分子水平上获得了突破性的进展。目前人们通过对一些模型生物如秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)、果蚬(Drosophila)和小鼠的单一基因突变研究发现，一些基因能够使这些生物的寿命显著延长达6倍以上。并且人们还发现，许多对某一物种(如果蝇)有延长寿命作用的基因在其它物种(如秀丽线虫、小鼠等)中具有相似的作用或者可以找到同源基因。既然生物在进化过程中许多与寿命相关的基因信号通路是非常保守的，那么通过对模型动物秀丽线虫体内与衰老相关的信号通路和基因的研究便有可能帮助我们从基因水平认识和理解人类衰老的原因。秀丽线虫是一种可以独立生存的线虫，长度约1mm，生活在16°C _25°C温度恒定的环境中。线虫由于个体小、结 构简单、细胞定数、生活周期短、发育迅速、易于得到突变体、虫体透明、易于在实验室培养，已成为研究生物发育和衰老的经典模式生物。在实验室20°C的环境下，秀丽线虫平均寿命为二、三周，发育一个世代仅约为4天。近年来以线虫为模型来研究与衰老相关基因的功能以及相关的信号通路取得了长足的发展，让我们对衰老过程有了更深入的了解。微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一类小的核酸分子，由核基因编码，其具有颈环结构的前体经过Dicer等酶的加工之后形成 21_23nt的非编码的成熟的小RNA分子maturemiRNA ;随后mature miRNA在相关蛋白的协助下通过5’第2_8号碱基与靶基因mRNA 3’UTR完全互补的方式识别靶基因，诱导靶基因mRNA的降解或翻译的抑制。lin-4是1993年在秀丽线虫中发现的第一个miRNA，功能研究发现它能阶段性调控线虫胚胎后期发育。随着2000年第二个调控线虫时序性发育的miRNA (let-7)的发现，miRNA的研究掀起热潮。miRNA及miRISC(RNA-蛋白质复合物)在动物和植物中广泛表达，并且在物种进化中相当保守，目前已有一小部分miRNA生物学功能得到阐明，这些miRNA参与调节细胞生长，组织分化，生长发育等诸多方面。可以相信，随着研究的深入，miRNA必将在生命起源和物种进化、基因表达调控的复杂性、疾病发生和发展的机制等方面起到更为深远的作用。机体衰老是一个多因素多基因参与的复杂过程，人类对衰老过程的了解还知之甚少。已知在衰老信号通路中，daf-2与sirt-2.1是线虫衰老调控的两个关键蛋白，在物种间相当保守。此外，耶鲁大学分子发育生物学和细胞发育生物学系证实miRNA对衰老和死亡的调控作用，miRNA可以阻止细胞过早死亡；参与线虫发育时序调控的miRNA lin_4也被证实参与调节线虫的衰老。
发明内容
如本文中所使用的，术语“miR”、“miRNA”、“miCix)RNA”与“微小核糖核酸”具有相
同的含义，其在全文中可互换地使用。因此，本发明的目的是提供一种微小RNA及其反义核苷酸在线虫寿命调控中的应用。本发明的另一个目的是，提供一种调控线虫寿命的方法。本发明的又一个目的是，提供一种调节线虫体内微小RNA表达量的方法。本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供一种微小RNA及其反义核苷酸在线虫寿命调控中的应用，其中所述微小RNA为包含miRNA-45的序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或变体，所述的miRNA-45 的序列为:序列 1，5' -UGACUAGAGACACAUUCAGCU-3 ’。优选地，所述的微小RNA为miRNA-45。优选地，其中所述微小RNA及其反义核苷酸是通过调控靶基因H)9F7.5的表达而实现对线虫寿命的调 控。优选地，其中所述微小RNA及其反义核苷酸是通过抑制H)9F7.5蛋白翻译而调控靶基因R)9F7.5的表达。优选地，其中所述线虫寿命的调控依赖于sirt-2.1基因的活性。另一方面，本发明提供一种调控线虫寿命的方法，通过调控线虫体内的miR-45而实现。优选地，通过在线虫体内增加miR-45的表达量或加入miRNA类似物而实现延长线虫的寿命。优选地,通过在线虫体内缺失突变miR-45或降低miR-45的表达量而实现缩短线虫的寿命。优选地，所述调控线虫体内的miR-45是通过以下方法来实现的:1)喂食线虫含有miR-45编码序列或其反义核苷酸序列，或miRNA-45类似物编码序列的载体；或者2)用含有miR-45编码序列类似物或抑制剂的脂质体混合液浸泡线虫。又一方面，本发明提供一种调节线虫体内微小RNA表达量的方法，所述方法包括:I)喂食线虫能够表达需要调节的微小RNA序列的载体；或者2)用含需要调节的微小RNA的类似物或抑制剂的脂质体混合液浸泡线虫。此外，本发明还提供了一种微小RNA在人类寿命调控中的应用，其中所述微小RNA为包含下序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或变体:hsa-miR-134 序列 2 5，-UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG-3，；hsa-miR-708* 序列 3 5’ -CAACUAGACU⑶GAGCUUCUAG-3，。由此可见，本发明主要的发明内容包括以下几点:I)发现将miRNA编码序列连接到L4440载体喂食线虫的方法和miRNA类似物/抑制剂浸泡线虫的方法，在线虫体内均能有效过表达或抑制表达miRNA (实时PCR和RNA印迹法结果验证)。传统的在线虫体内过表达或抑制miRNA表达的转基因注射法费用昂贵，操作复杂；本研究创新运用的方法，方便简单，实验成本低，可以大大促进在线虫整体模型上研究miRNA功能。2)发现miR-45缺失突变、miRNA抑制剂浸泡均导致线虫寿命缩短，miR-45过表达、miRNA类似物均能是线虫寿命延长。miR-45缺失突变线虫平均寿命为14.78天，miRNA抑制剂线虫平均寿命为15.02天，miR-45过表达平均寿命为20.01天，miRNA类似物平均寿命为19.98天，而野生型平均寿命为17.46天，可见miR-45可以调控线虫寿命，并且miR-45过表达或抑制表达对线虫的形态均无影响。注:本申请文件中的寿命数值如无特别说明，单位均为天。3)体外双荧光素酶活性检测、实时PCR和蛋白质印迹检测均证明:miR-45可以调控R)9F7.5的表达。将R)9F7.53’UTR连接到PGL3载体上，伴Iipofectamine共转染HEK293细胞，发现miR-45可以显著抑制带有H)9F7.53’ UTR的PGL3的表达，而不用抑制带有突变的R)9F7.53’UTR的PGL3表达。实时PCR结果表明，过表达miR-45线虫R)9F7.5mRNA的水平要比野生型略低，而miR-45抑制表达组的线虫H)9F7.5mRNA的水平要比野生型略高，但均无显著差异；这表明miR-45诱导R)9F7.5mRNA的降解不是miR-45调控R)9F7.5表达的主要方式。蛋白质印迹分析显示过表达miR-45的线虫R)9F7.5蛋白水平要比野生型高，而miR-45表达抑制的线虫H)9F7.5蛋白水平要比野生型低，这证明miR-45通过抑制R)9F7.5蛋白翻译调控H)9F7.5的表达。4)F09F7.5缺失突变及RNAi均能使线虫寿命延长。H)9F7.5缺失突变线虫平均寿命为21.1天，F09F7.5RNAi线虫寿命为20.4天，均比野生型平均寿命长。5) miR-45和R)9F7.5调控线虫寿命均依赖于sirt_2.1的活性。在miR-45过表达的线虫体内RNAi sirt-2.1的表达使得线虫寿命缩短，平均寿命由20.02天缩短至16.25天，与单独sirt-2.1RNAi的线虫寿命接近；miR_45缺失突变的线虫RNAi sirt-2.1的表达对线虫寿命无影响。F09F7.5缺失突变的线虫在RNAi sirt-2.1的表达后寿命亦缩短，平均寿命由21.1天缩短至15.92天，与单独sirt-2.1RNAi的线虫寿命接近。由上可见miR-45和R)9F7.5调控线虫寿命均依赖于sirt-2.1的活性。6)miR_45在daf-2缺失突变的背景上过表达不能额外延长线虫寿命。在daf-2 (-/-)线虫体内过表达miR-45，线虫平均寿命为26.12天，与daf-2 (-/-)线虫平均寿命25.34天接近；在daf-2 (-/-)线虫体内抑制miR-45的表达，却使线虫寿命略微缩短，平均寿命为23.87天。7)通过序列比对，发现miR-45在人种里存在两个种子区域序列保守的miRNA，分别为 hsa-miR-134 和 has-miR-708*。综上所述，本发明创新了在线虫体内过表达和抑制miRNA的方法，并发现miR-45可以调节线虫寿命。线虫缺失突变miR-45会使得寿命缩短，平均寿命为15.02±0.54天；在线虫体内过表达miR-45会使得寿命延长，平均寿命为20.1±0.48天。分子机制研究结果显示，miR-45是通过调控靶基因H)9F7.5的表达调节线虫寿命，基因H)9F7.5的表达缺失亦使寿命延长，其平均寿命为21.1 ±0.51天，接近miR-45过表达线虫的寿命。miR-45过表达及H)9F7.5突变缺失延长线虫寿命均依赖于sirt-2.1的活性，在miR-45过表达的线虫体内及H)9F7.5突变缺失的线虫体内抑制sirt-2.1的表达均使线虫寿命缩短。miR-45在daf-2缺失突变背景上无额外延长线虫寿命的能力。0035]可见，本发明研究其它参与调控线虫衰老的miRNA及相关分子机制，毫无疑问将有助于揭开生物体衰老的神秘面纱，甚至找到干预衰老过程的方法，延长生物体寿命，给社会和人民生活带来福音；这也必定给miRNA的应用带来更广阔的前景。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:图1A为用载体喂食法在线虫体内过表达miRNA的实验流程图；图1B为具体的实
验参数。图2为实时PCR检测L4440:miR-45载体喂食和miR-45类似物浸泡方法过表达miR_45 效率。图3为RNA印迹RNA印迹法检测L4440:miR-45载体喂食和miR-45类似物浸泡方法过表达miR-45效率。图4为检测miR-45过表达、抑制和缺失突变对线虫形态的影响。在体视显微镜下45X观察线虫形态和大小，A为野生型线虫形态，B为miR-45过表达的线虫形态，C为miR-45类似物浸泡的线虫形态图，D为miR-45 (-/-)线虫形态图，E为miR-45抑制的线虫形态图，图片显示miR-45过表达和抑制均未使线虫形态大小发生改变。图5为检测miR-45对线虫寿命的影响。miR-45过表达使线虫寿命显著延长，平均寿命为20.01天；miR-45类似物亦使线虫寿命延长，平均寿命为19.98天；miR_45缺失突变使线虫寿命缩短，平均寿命为14.78 ；miR-45抑制剂浸泡亦使线虫寿命缩短，平均寿命为
15.0天，对照野生型线虫平均寿命为17.46天，daf-2 (-/-)为daf-2缺失突变型，平均寿命为25.34天。
图6为HEK293转染PGL3-F09F7.53’ UTR及miR-45类似物，荧光素酶活力检测miR-45对R)9F7.5的调控。将PGL3-对照荧光素酶活性划归为I，miR-45使得PGL3-F09F7.53’UTR荧光素酶活性降低到0.59，其他阳性对照组活性均接近1，空细胞阴性对照荧光素酶活性为0.08，表明miR-45可显著抑制带R)9F7.53’ UTR的PGL3的表达。图7为实时PCR检测miR-45对R)9F7.5mRNA水平的影响。miR-45过表达组是通过L4440:miR-45喂食线虫，miR-45类似物组是通过miR-45类似物浸泡线虫，miR-45 (-/-)组为miR-45缺失突变线虫，miR-45抑制剂组是通过miR-45抑制剂抑制线虫，分别提取RNA进行实时PCR检测发现，miR-45过表达组和miR-45类似物组线虫体内H)9F7.5mRNA水平略低于野生型，miR-45 (-/-)组与miR-45抑制剂组线虫体内H)9F7.5mRNA水平都略高于野生型，但均无显著差异。图8为蛋白质印迹检测miR-45对R)9F7.5蛋白水平的影响。与图7—样，miR-45过表达组是通过L4440:miR-45喂食线虫，miR-45类似物组是通过miR-45类似物浸泡线虫，miR-45 (-/-)组为miR-45缺失突变线虫，miR-45抑制剂组是通过miR-45抑制剂抑制线虫，Western blot检测发现，miR-45过表达组和miR-45类似物线虫体内H)9F7.5蛋白水平显著低于野生型，而miR-45 (-/-)与miR-45抑制剂线虫体内H)9F7.5蛋白水平显著高于野生型。图9为检测R)9F7.5RNAi的干扰效率。F09F7.5 (-/-)组为R)9F7.5缺失突变型线虫，F09F7.5RNAi组为R)9F7.5RNA干扰线虫，实时PCR和western结果均显示R)9F7.5在F09F7.5 (-/-)和H)9F7.5RNAi线虫体内表达水平极低。
图10为检测R)9F7.5对线虫寿命的影响。H)9F7.5 (-/-)组为R)9F7.5缺失突变型线虫，F09F7.5RNAi组为R)9F7.5RNA干扰线虫，daf-2 (-/-)组为daf-2缺失突变型线虫，miR-45 (-/-)组为miR-45缺失突变型线虫，表明H)9F7.5表达抑制延长线虫寿命至与miR-45 (-/-)接近。图11为证明miR-45与R)9F7.5对线虫寿命的调节均依赖于sirt-2.1。在miR-45过表达的线虫体内RNAi sirt-2.1的表达使得线虫寿命缩短，与单独sirt-2.1RNAi的线虫寿命接近；在miR-45缺失突变的线虫体内RNAisirt-2.1的表达对线虫寿命无影响；F09F7.5缺失突变的线虫在RNAi sirt-2.1的表达后寿命亦缩短，与单独sirt-2.1RNAi的线虫寿命接近。图12为证明miR-45在daf-2突变背景上过表达无额外延长寿命能力。在daf-2-/-)线虫体内过表达miR-45不能额外延长线虫寿命,与daf-2 (-/-)线虫寿命曲线接近；在daf-2-/-)线虫体内抑制miR-45的表达，却使线虫寿命略缩短。图13为说明在targetscan中R)9F7.5是miR-45的靶基因的图。
具体实施例方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。以下各实施例中使用的主要材料、仪器信息如下:
L4440 载体:购自 addgene,货号为 Addgene plasmid 1654)PBST-1I载体:购自长沙爱科博生物科技有限公司大肠杆菌0P50:购自中国科学院生物物理研究所。大肠杆菌HTl 15 (DE3):购自中国科学院生物物理研究所。F09F7.5抗体:购自上海优宁维生物科技有限公司双荧光素梅检测试剂盒:购自普洛麦格公司，产品编号E1910。体式显微镜型号为zeiss, Discovery V20,可购自位于德国的卡尔蔡司公司。生化培养箱:上海树立仪器厂，型号150C。多功能酶标仪，购自Biotek，型号为SYNERCY 4。本案实施例中涉及的相关引物序列如下:表I实施例中涉及的相关引物序列。
权利要求
1.种微小RNA及其反义核苷酸在线虫寿命调控中的应用，其中: 所述微小RNA为包含miRNA-45的序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或变体， 所述的miRNA-45的序列为:序列 1:5’ -UGACUAGAGACACAUUCAGCU-3’ ； 优选地，所述的微小RNA为miRNA-45。
2.据权利要求1所述的应用，其中所述微小RNA及其反义核苷酸是通过调控靶基因F09F7.5的表达而实现对线虫寿命的调控。
3.据权利要求2所述的应用，其中所述微小RNA及其反义核苷酸是通过抑制F09F7.5蛋白翻译而调控靶基因H)9F7.5的表达。
4.据权利要求1至3中任一项所述的应用，其中所述线虫寿命的调控依赖于sirt-2.1基因的活性。
5.种调控线虫寿命的方法，通过调控线虫体内的miRNA-45而实现。
6.据权利要求5所述的方法，通过在线虫体内增加miRNA-45的表达量或加入miRNA类似物而实现延长线虫的寿命。
7.据权利要求5所述的方法，通过在线虫体内缺失突变miRNA-45或降低miR-45的表达量而实现缩短线虫的寿命。
8.据权利要求5至7中任一项所述的方法，所述调控线虫体内的miR-45是通过以下方法来实现的:1)喂食线虫能够表达需要调节的微小RNA序列的载体；或者2)用含需要调节的微小RNA的类似物或抑制剂的脂质体混合液浸泡线虫。
9.种调节线虫体内微小RNA表达量的方法，所述方法包括:1)喂食线虫能够表达需要调节的微小RNA序列的载体；或者2)用含需要调节的微小RNA的类似物或抑制剂的脂质体混合液浸泡线虫；优选地需要调节的微小RNA是miRNA-45。
10.种微小RNA在人类寿命调控中的应用,其中所述微小RNA为包含下序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或变体:hsa-miR-134 5， -UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG-3，；hsa-miR-708* 5’ _CAACUAGACUGUGAGCUUCUAG_3’。
全文摘要
本发明提供了miR-45及其反义核苷酸在线虫寿命调控中的应用，以及调控线虫寿命的方法和调节线虫体内微小RNA表达量的方法。本发明提供的调控线虫寿命的方法是通过调控线虫体内的miR-45而实现的，通过在线虫体内增加miR-45的表达量或加入miRNA类似物而实现延长线虫的寿命，通过在线虫体内缺失突变miR-45或降低miR-45的表达量而实现缩短线虫的寿命，miR-45的表达量可通过喂食或浸泡的方法来完成。
文档编号C12N15/85GK103088021SQ20111033789
公开日2013年5月8日 申请日期2011年10月31日 优先权日2011年10月31日
发明者李培峰, 丁素玲 申请人:中国科学院动物研究所