专利名称：利用微生物测定饲料中烟酸和烟酰胺含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定饲料中烟酸和烟酰胺含量的方法，具体地说，涉及一种利用微生物测定饲料中烟酸和烟酰胺含量的方法。
背景技术：
目前维生素预混料中烟酸及烟酰胺的测定方法主要为高效液相色谱法，尽管该方法具有快速简便的优点，但该法仅适用于纯度高且多为游离状态的样品，比如维生素预混料。但对动物全价料及天然饲料原料烟酸及烟酰胺的测定仍然没有合适的方法，这是因为全价料及天然饲料原料中烟酸含量极低，采用高效液相色谱法测定时出峰面积小或样品峰与杂峰粘连，误差很大。微生物植物乳杆菌(LactcAacillus plantarum)对烟酸及烟酰胺具有极高的特异性与灵敏性，缺乏烟酸与烟酰胺时其生长受到抑制，故利用植物乳杆菌的这一特性可以测定样品中烟酸和烟酰胺的有效含量。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用微生物测定饲料中烟酸和烟酰胺含量的方法，以克服采用高效液相色谱法测定动物全价料及天然饲料原料中烟酸和烟酰胺含量所存在的不足。为了实现本发明目的，本发明的一种利用微生物测定饲料中烟酸和烟酰胺含量的方法，其是将植物乳杆菌接种于含有除烟酸和烟酰胺外的植物乳杆菌生长所用的培养基中，则植物乳杆菌的生长量与所加入的烟酸和烟酰胺标准品的含量相对应，并绘制标准曲线；然后对饲料样品进行水解处理，制备待测样品溶液，将等量的植物乳杆菌接种于含有待测样品溶液的培养基中，从而根据植物乳杆菌的生长量定量计算出饲料样品中烟酸和烟酰胺的含量。具体地，前述方法包括以下步骤1)烟酸和烟酰胺标准溶液的配制精确称取烟酸标准品，用乙醇配制成已知浓度的溶液，向含有除烟酸和烟酰胺外的植物乳杆菌生长所用的培养基中加入该烟酸的乙醇溶液，配制成烟酸终浓度为0、2. 5、5、10、15、20、25、30、35、 40,45和50ng/mL的标准溶液；幻烟酸和烟酰胺标准曲线的绘制将定量的植物乳杆菌分别接种于上述不同烟酸浓度的标准溶液中，根据植物乳杆菌的生长量与烟酸标准品的含量绘制标准曲线；幻饲料样品的水解处理将饲料样品溶解于lmol/L硫酸溶液中，超声后灭菌，用NaOH调节pH值6. 0-6. 5，然后用盐酸调节pH值4. 5，将水解液转移至容量瓶中定容， 得到待测样品溶液；4)饲料样品中烟酸和烟酰胺含量的测定将等量的植物乳杆菌接种于含有待测样品溶液的培养基中，根据植物乳杆菌的生长量定量计算出饲料样品中烟酸和烟酰胺的含量。本发明的微生物测定法中所用的微生物为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) ATCC 8014，接种所用的植物乳杆菌为菌液形式，其制备过程如下1)菌种的活化将植物乳杆菌ATCC 8014冻干粉加入盛有MRS肉汤培养基的厌氧管中，置于37士 1°C培养箱中培养，首次培养48h，以后每24h传代一次，传代10次后用穿刺法转接于MRS琼脂培养基中，-20°C保存，每周转接一次；幻菌液的制备将转接于MRS肉汤培养基中的菌液倒入IOmL离心管中，2000rpm离心lOmin，弃去上清液，加入IOmL 0. 9%生理盐水，震荡混勻如前离心，反复两次，再加入IOmL生理盐水制成菌悬液，以生理盐水为对照，用分光光度计于 550nm波长下测定其透光率，透光率为60 80%的菌液为接种时可以使用的菌液。前述方法中使用的MRS肉汤培养基为葡萄糖30g、胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸粉5g、柠檬酸铵2g、醋酸钠5g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0. 3g、四水硫酸锰0. 12g、 吐温80 ImL和水lOOOmL，pH6. 7士0. 2 ；MRS琼脂培养基为向上述MRS肉汤培养基中按 1. 5% 1. 8%的重量比添加琼脂。采用上述微生物测定法可对天然饲料及动物全价料中烟酸和烟酰胺的含量进行测定，所述动物全价料为鸡、鸭、猪、牛、羊全价料。微生物测定法的原理是当培养基中含有除烟酸及烟酰胺外的所有菌体生长所需的营养物质时，则在一定范围内植物乳杆菌的生长量就与标准管中标准溶液的烟酸含量以及未知浓度的待测溶液中烟酸和烟酰胺的有效含量相对应，从而可定量计算出样品中烟酸及烟酰胺的含量。本发明提供微生物法对天然饲料原料及动物全价料中烟酸及烟酰胺的含量进行测定，并对其精密度和准确度进行分析，结果证明利用该法测定饲料中烟酸和烟酰胺含量， 重现性好，灵敏性高，准确性高，为饲料中烟酸及烟酰胺含量的测定提供参考。
图1为本发明植物乳杆菌的生长量与烟酸含量的标准曲线。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1 10种天然饲料和8种全价料中烟酸及烟酰胺含量的测定本实施例的微生物测定法中所用的微生物为植物乳杆菌(Lactobacillus ρlantarum)ATCC 8014。植物乳杆菌生长所用的培养基为MRS肉汤培养基葡萄糖30g，胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，柠檬酸铵2g，醋酸钠5g，磷酸氢二钾2g，七水硫酸镁0. 3g，四水硫酸锰 0. 12g，吐温80 lmL，加水IOOOmL,调节ρΗ6· 7 士0. 2 ；MRS琼脂培养基将上述MRS肉汤培养基中按照1. 5% 1. 8%比例添加琼脂。1、菌种的复活与保存将植物乳杆菌ATCC 8014冻干粉转入装有MRS肉汤培养基的厌氧管中，37士 1°C培养箱中培养，首次培养48h，以后每24h传代一次，传代10次后用穿刺法转接于MRS琼脂培养基中，-20°C保存，每周转接一次。2、菌液的制备将转接于MRS肉汤培养基中的菌液倒于IOmL离心管中，2000转/ 分离心lOmin，弃去上清液，加入IOmL 0. 9%生理盐水，震荡混勻如前离心，反复两次，再加入IOmL生理盐水，混勻。吸取适量该菌悬液于IOmL生理盐水中，以生理盐水为对照，用分光光度计于550nm波长下测定其透光率，如在60 80%之间则可使用。3、饲料样品的处理方法称取0. 5g样品(选取10种天然饲料和8种全价料)于 250mL三角瓶中，加入lmol/L硫酸溶液50mL溶解试样，充分混合，在超声波中超声lOmin， 然后置于高压灭菌锅中121°C保存30min，取出冷却至室温，用NaOH调节pH至6. 5，剧烈震荡，再用盐酸调节PH至4. 5，将水解液转移至IOOmL棕色容量瓶中，定容，过滤，此水解液可保存于4°C冰箱中储藏。吸取适量此水解液，加入20mL蒸馏水，调节pH至6. 8，定容至适当刻度。4、烟酸标准曲线的绘制烟酸标准储备液(100yg/mL)称取20mg(精确值 0. Img)烟酸标准品(sigma)，用25%乙醇溶液溶解并定容至200mL，保存于4°C冰箱中，保存期为4个月。烟酸标准中间溶液(10 μ g/mL)从烟酸标准储备液中吸取IOmL至IOOmL棕色容量瓶中，用25%乙醇溶液定容，保存于4°C冰箱中，保存期为1个月。烟酸标准工作液 (100ng/mL)从标准中间液中吸取1. OmL至棕色容量瓶中，用水定容至IOOmL,临用前配制。标准曲线管的制备标准管中烟酸含量分别为(ng) :0、0、25、50、100、150、200、 250、300、350、400、450、500，以标准管中烟酸含量为横坐标，测得的OD值为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线管的制备如表1。表1标准曲线管的制备(单位，mL)
权利要求
1.一种利用微生物测定饲料中烟酸和烟酰胺含量的方法，其特征在于，将植物乳杆菌接种于含有除烟酸和烟酰胺外的植物乳杆菌生长所用的培养基中，则植物乳杆菌的生长量与所加入的烟酸和烟酰胺标准品的含量相对应，并绘制标准曲线；然后对饲料样品进行水解处理，制备待测样品溶液，将等量的植物乳杆菌接种于含有待测样品溶液的培养基中，从而根据植物乳杆菌的生长量定量计算出饲料样品中烟酸和烟酰胺的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤1)烟酸和烟酰胺标准溶液的配制精确称取烟酸标准品，用乙醇配制成已知浓度的溶液，向含有除烟酸和烟酰胺外的植物乳杆菌生长所用的培养基中加入该烟酸的乙醇溶液， 配制成烟酸终浓度为0,2. 5、5、10、15、20、25、30、35、40、45和50ng/mL的标准溶液；2)烟酸和烟酰胺标准曲线的绘制将定量的植物乳杆菌分别接种于上述不同烟酸浓度的标准溶液中，根据植物乳杆菌的生长量与烟酸标准品的含量绘制标准曲线；3)饲料样品的水解处理将饲料样品溶解于lmol/L硫酸溶液中，超声后灭菌，用NaOH 调节PH值6. 0-6. 5，然后用盐酸调节pH值4. 5，将水解液转移至容量瓶中定容，得到待测样品溶液；4)饲料样品中烟酸和烟酰胺含量的测定将等量的植物乳杆菌接种于含有待测样品溶液的培养基中，根据植物乳杆菌的生长量定量计算出饲料样品中烟酸和烟酰胺的含量。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌 (Lactobacillus ρIantarum)ATCC 8014。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，接种所用的植物乳杆菌为菌液形式，其制备过程如下1)菌种的活化将植物乳杆菌ATCC8014冻干粉加入盛有MRS肉汤培养基的厌氧管中，置于37 士 1°C培养箱中培养，首次培养48h，以后每24h传代一次，传代10次后用穿刺法转接于MRS琼脂培养基中，-20°C保存，每周转接一次；2)菌液的制备将转接于MRS肉汤培养基中的菌液倒入IOmL离心管中，2000转/分离心lOmin，弃去上清液，加入IOml 0. 9%生理盐水，震荡混勻如前离心，反复两次，再加入 IOml生理盐水制成菌悬液，以生理盐水为对照，用分光光度计于550nm波长下测定其透光率，透光率为60 80%的菌液为接种时使用的菌液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述MRS肉汤培养基为葡萄糖30g、胰蛋白胨log、牛肉膏10g、酵母浸粉5g、柠檬酸铵2g、醋酸钠5g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁 0. 3g、四水硫酸锰0. 12g、吐温80ImL和水IOOOmL, pH6. 7 士0. 2 ；所述MRS琼脂培养基为向上述MRS肉汤培养基中按1. 5% 1. 8%的重量比添加琼脂。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述饲料为天然饲料或动物全价料。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述动物全价料为鸡、鸭、猪、牛、羊全价料。
全文摘要
本发明提供了一种利用微生物测定饲料中烟酸和烟酰胺含量的方法，其是当培养基中含有除烟酸及烟酰胺外的所有菌体生长所需的营养物质时，则在一定范围内植物乳杆菌的生长量就与标准管中标准溶液的烟酸含量以及未知浓度的待测溶液中烟酸和烟酰胺的有效含量相对应，从而可定量计算出饲料样品中烟酸及烟酰胺的含量。微生物法具有重现性好，灵敏性高，准确性高等优点，能够准确反映饲料中烟酸和烟酰胺的有效含量。
文档编号C12Q1/02GK102505038SQ20111035338
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者董爽, 计成, 赵丽红, 马秋刚 申请人:中国农业大学