专利名称：植物端粒酶活性的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种植物端粒酶的鉴定技术，特别是一种植物端粒酶分离和检测的方法。
背景技术：
端粒是真核生物染色体末端的一种特殊结构，近年来，大量研究表明染色体端粒与细胞遗传稳定，与细胞分裂力、细胞生活力、生命力密切相关。它的长度随细胞的分裂次数而缩减，但它也能在端粒酶催化下合成和延伸，保持一定的长度。研究发现90%以上的人类癌变细胞具有端粒酶活性，突显出端粒酶对细胞癌变过程中的重要作用(正常人类细胞中端粒酶活性很低，一旦细胞癌变就会出现端粒酶活性提高的现象，目前已用于细胞癌变的一个重要生理指标之一)。尤其是植物生物体细胞的可持续性分裂，端粒酶是不可缺少的，且至关重要(少了端粒酶的作用，植物细胞很难维系不断的繁殖、生长过程)。由于在植物组织中端粒酶的活性远低于动物组织，即使在活性较高的植物分生组织或愈伤组织中通常都难以检测。因此，时至今日还没有一种技术方法能有效、快速地分离和检测植物端粒酶活性的方法。目前的现有的来源于动物端粒酶的检测为“TRAP方法”，是直接将提取液进行酶促反应，然后检测反应物的量。由于动物组织中，端粒酶活性较高，直接的提取液容易检测。但对于端粒酶活性较低的植物组织，这样直接检测就存在很大问题，主要是检测灵敏度不够 (酶含量很低)，甚至对一些低活性的组织就无法检测端粒酶活性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种工艺简洁、结论准确的植物端粒酶活性的检测方法。为了解决上述技术问题，本发明提供一种植物端粒酶活性的检测方法，包括以下步骤1)、植物端粒酶初提取液制备利用液氮将待测植物组织充分研磨后，于3 5°C加入提取液后继续研磨成勻浆； 然后，3 5°C，15000 17000g离心12 17min，所得的上清液作为初提液；所述提取液为50mMpH 7. 5Tris_HCl，5. OmM MgC12, IOOmM KCl,20mM EGTA, 1. OmM DT Τ，0· ImM PMS F, 1. 5% PVP, 10%甘油；即，每 IOOml 的所述提取液中，含有 50mM pH 7. 5Tris_HCl、5. OmM MgCl2UOOmM KCl、20mM EGTAU. OmM DTT、0. ImM PMSF、1.5g PVP 禾Π IOml 甘油，其余为水；植物组织与提取液的用量比为2. 5g待测植物组织/8 12ml提取液；2)、植物端粒酶的富集每IOml初提液中加入0. 9 11克经DEPC处理的PEG6000，于3 5°C下上下颠倒至PEG6000充分悬浮后继续震荡(轻微震荡)30min ；
然后于3 5°C、15000 17000g离心12 17min，去除上清后，加入3 4ml提取液，3 5°C悬浮搅拌，再于3 5°C、15000 17000g离心12 17min，得富集上清液；该富集上清液中含有植物端粒酶，至此步骤已完成植物端粒酶的分离；3)、蛋白含量的测定取步骤2)所得富集上清液测定蛋白含量；4)、端粒酶的酶促反应及产物的回收取步骤2)所得的富集上清液的一部分，经65°C 15min灭活预处理，得灭活预处理后富集上清液作为对照组；步骤2)所得的富集上清液的另一部分，作为实验组；将对照组和实验组分别进行以下处理取含有IOOmg蛋白的灭活预处理后富集上清液/含有IOOmg蛋白的富集上清液放入离心管中，加入30 μ 1 IOX酶促反应液，用ddH20 定容至300 μ 1，18 20°C保温12 14min ；然后92 96°C酶灭活处理0. 8 1. 2min ；再加入280 320 μ 1的氯仿，充分混勻，于3 5°C，20000 22000g离心12 17min，取上清，加入1/10氯仿体积量的3M醋酸钠溶液以及加入异丙醇，混勻，再置于-18 -22°C冷冻50 70min，所述异丙醇的体积是氯仿和3M醋酸钠溶液体积量之和的0. 8 1. 2倍；再 3 5°C、20000 22000g离心18 22min，去除上清后，用体积浓度为70 80%的乙醇洗涤沉淀；待沉淀自然干燥后，分别得对照组回收产物/实验组回收产物；备注说明上述灭活预处理不会使蛋白的含量发生变化；5)、DNA 含量测定将步骤4)所得的对照组回收产物/实验组回收产物分别加入无菌水充分溶解 ’然后分别测定ssDNA的量；将实验组回收产物的ssDNA含量减去对照组回收产物的ssDNA含量，得植物端粒酶活性。注植物组织的端粒酶活性定义为每IOOmg蛋白中所含端粒酶，在19°C，13min 能合成ssDNA的量。作为本发明的植物端粒酶活性的检测方法的改进步骤3)通过普通分光光度计测定富集上清液中蛋白含量。作为本发明的植物端粒酶活性的检测方法的进一步改进步骤4)中的 IOX 酶促反应液为0. 5M pH 8. 3Tris_HCl、50mM MgCl2、0. 5M KCl, IOOmM EGTA、0. 1% Triton χ-lOOUOmM DTT、0. 5mM dNTP_C、0· 1% BSA、2. OmM 的前导引物；前导弓丨物为5，-ATGATGTGCAACTCGACAACTT-3，。即，每 IOOml 的 IOX 酶促反应液中含有0. 5M pH 8. 3Tris_HCl、50mM MgCl2、0. 5M KClUOOmM EGTA、0. Iml 的 Triton χ-lOOUOmM DTT、0. 5mM dNTP_C、0· 1 克的 BSA 和 2. OmM 的前导引物，其余为水。备注说明dNTP_C即在dNTP中除去dCTP而得。作为本发明的植物端粒酶活性的检测方法的进一步改进步骤4)中酶促反应中前导引物寡核苷酸的3’端的4个碱基不可改变(即特定3’端的ACTT不可改变)，其余碱
基容许有一定变化。在本发明的步骤4)中，用于洗涤沉淀的乙醇(体积浓度为70 80% )的体积量一般为氯仿体积量的0. 8 1. 5倍。本发明具体是通过以下技术方案来实现的
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1、对所有用具、器皿进行常规的去RNase的处理。由于植物端粒酶的活性，除了它的蛋白质亚基外，关键是保持它的RNA模板序列的完整性。建议在整过分离过程中，按常规提取总RNA要求的条件进行。2、植物端粒酶初提取液的制备。利用液氮将待测植物组织充分研磨后，加入提取液，继续研磨成勻浆。然后，离心分离后，保留上清液。3、采用聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)从提取样品液中富集端粒酶蛋白。 不同分子量的PEG可选择性吸附分子量以及三维结构不同的蛋白。因此，选择最合适分子量的PEG对植物端粒酶蛋白的富集是至关重要的。因此，在本发明中选用了 PEG6000。4、植物端粒酶蛋白的洗脱。从富集植物端粒酶蛋白的PEG样品中，利用PEG/提取液的比例不同能进一步有选择性的将植物端粒酶蛋白从PEG中洗脱。因此，这也是对植物端粒酶蛋白的富集关键步骤。5、植物端粒酶样品总蛋白的定量测定。通过普通分光光度计测定样品中蛋白质含量，以确定酶促反应中加入样品提取液的体积。6、植物端粒酶酶促反应。根据Kim，1996年发现的端粒酶反应原理，端粒酶对特定条件的DNA寡聚核苷酸的前导引物作用，并能有效延伸其前导引物。由于任何酶促反应均涉及到反应温度，反应时间等反应条件。因此，获得最佳的反应条件是重要的。7、反应产物的回收与定量测定。反应产物仍为单链DNA，且片段较短，建议采用沉淀回收方法。由于回收样品中DNA含量较少，采用DNA微量分析仪进行定量测定，记录和分析测定结果。本发明的植物端粒酶活性的检测方法，涉及到植物端粒酶分离和检测，其具有如下优点1)本发明技术最重要的优点在于，它能对植物组织中处于低活性的端粒酶进行有效检测；2)通过微量DNA定量分析能准确、快速测得端粒酶的反应产物的含量。综上所述，本发明通过富集技术将直接提取液进行了端粒酶的富集(类似于浓缩过程)，达到了低活性的组织中也能检测到端粒酶活性。同时，由于有效提高了端粒酶浓度， 因此提高了检测的精度和可靠性。
具体实施例方式以下实施例的每个步骤中，没有特别说明的均为在3 5°C的低温下进行。实施例1、西兰花花蕾端粒酶分离及活性检测1、端粒酶初提取液的制备和富集取2. 5g西兰花花蕾放入研钵中，用液氮充分研磨后，于3 5°C加入IOml提取液， 继续研磨至勻浆，转移至50ml离心管中，4°C，16000g离心15min ；目的是为了除去植物碎片；共得到Ilml的上清。每100ml 的上述提取液中，含有 50mM pH 7. 5Tris_HCl、5. OmM MgCl2UOOmM KCl, 20mM EGTAU. OmM DTT、0. ImM PMSF、1.5g PVP 禾Π 10ml 甘油，其余为水。取IOml上清放入离心管中，加入1. Og的PEG6000 (经DEPC去RNase处理)，在4°C 下上下颠倒至PEG充分悬浮后，继续轻微震荡30min(目的是进行植物端粒酶蛋白的选择性吸附)。然后4°C，16000g离心15min，去除上清，加入3. 50ml提取液(目的将吸附的端粒酶蛋白从PEG6000上洗脱到溶液中从而达到富集的目的)，4°C悬浮搅拌30min，再4°C， 16000g离心15min;取上清。该上清(即富集上清液)能直接用于下述步骤2和步骤3 ；也可于-80°C保存，需要时取出，自然解冻至4°C再用于下述步骤2和步骤3。2、样品中总蛋白含量的测定(mg/ml)。通过ThermoSCIENTIFIC公司的NAN0DR0P 2000spectrophotometer测定样品(即步骤1)所得的上清)中蛋白质含量，重复三次。第一次19. 5 ；第二次19. 6 ；第三次19. 6 ； 取平均值19. 57。3、酶促反应及产物回收酶促反应需要将正常提取酶液，通过对端粒酶的高温灭活处理，作为对照；具体如下取样品(即步骤1所得的上清)约20μ1经65°C处理15min灭活预处理，得灭活预处理后富集上清液，作为对照组。将正常酶液(即步骤1所得的上清，作为实验组)和灭活处理的酶液样品(即对照组)，根据样品蛋白含量各取5. 11 μ 1 (含IOOmg蛋白)分别进行如下处理放入1.5ml离心管中，加入10Χ酶促反应液30 μ 1，加264. 89 μ 1 ddH20从而定容至300 μ 1，混勻，19°C保温13min ；然后94°C，Imin进行酶灭活处理。加入等体积(即 300 μ 1)的氯仿，充分混勻，4°C，21 IOOg离心15min ；取上清，在所得上清中加入30ul 3M醋酸钠溶液和330ul异丙醇，混勻后置于_20°C冷冻60min ；再4°C，21100g,离心20min，去除上清，用300ul 75% (体积浓度)的乙醇洗涤沉淀；沉淀自然干燥，得对照组回收产物/实验组回收产物；每IOOrnl 的 10X 酶促反应液中含有0. 5M pH 8. 3Tris_HCl、50mM MgCl2、0. 5M KClUOOmM EGTA、0. Iml 的 Triton χ-lOOUOmM DTT、0. 5mM dNTP_C、0· 1 克的 BSA 和 2. OmM 的前导引物，其余为水；dNTP-C即在dNTP中除去dCTP而得。前导引物为5，-ATgATgTgCAACTCgACAACTT-3，。4、样品DNA含量测定将上述步骤所得的对照组回收产物/实验组回收产物分别进行如下操作加入20. Oul 无菌水溶解；通过 Thermo SCIENTIFIC 公司的 NAN0DR0P 2000spectrophotometer测定DNA的含量。由于端粒酶合成的DNA为单链DNA，将测定仪器设置到ssDNA测定功能，重复三次，取平均值。将处理样品和对照样品DNA含量的差值确定为一定蛋白质量中所含端粒酶，在一定条件下对前导引物延伸的DNA量。具体如下取1. Oul产物回收样品(即上述20. Oul无菌水溶解后所得的溶液)，通过Thermo SCIENTIFIC 公司的 NAN0DR0P 2000spectrophotometer 测定 ssDNA 的含量，结果如下表 1 所述(ng/ μ 1)表 权利要求
1.植物端粒酶活性的检测方法，其特征是依次包括以下步骤1)、植物端粒酶初提取液制备利用液氮将待测植物组织充分研磨后，于3 5°C加入提取液后继续研磨成勻浆 ’然后，3 5°C, 15000 17000g离心12 17min，所得的上清液作为初提液；每 IOOml 的所述提取液中，含有 50mM pH 7. 5Tris_HCl、5. OmM MgCl2UOOmM KCl、20mM EGTAU. OmM DTT、0. ImM PMSF、1.5g PVP 禾口 IOml 甘油，其余为水；植物组织与提取液的用量比为:2. 5g待测植物组织/8 12ml提取液；2)、植物端粒酶的富集每IOml初提液中加入0. 9 11克经DEPC处理的PEG6000，于3 5°C下上下颠倒至 PEG6000充分悬浮后继续震荡30min ；然后于3 5°C、15000 17000g离心12 17min，去除上清后，加入3 4ml提取液， 3 5°C悬浮搅拌，再于3 5°C、15000 17000g离心12 17min，得富集上清液；3)、蛋白含量的测定取步骤2)所得富集上清液测定蛋白含量；4)、端粒酶的酶促反应及产物的回收取步骤2)所得的富集上清液的一部分，经65°C 15min灭活预处理，得灭活预处理后富集上清液作为对照组；步骤2)所得的富集上清液的另一部分，作为实验组；将对照组和实验组分别进行以下处理取含有IOOmg蛋白的灭活预处理后富集上清液 /含有IOOmg蛋白的富集上清液放入离心管中，加入30 μ 1 IOX酶促反应液，用ddH20定容至300 μ 1，18 20°C保温12 14min ；然后92 96°C酶灭活处理0. 8 1. 2min ；再加入 280 320 μ 1的氯仿，充分混勻，于3 5 °C, 20000 22000g离心12 17min，取上清，加入1/10氯仿体积量的3M醋酸钠溶液以及加入异丙醇，混勻，再置于-18 -22°c冷冻50 70min,所述异丙醇的体积是氯仿和3M醋酸钠溶液体积量之和的0. 8 1. 2倍；再3 5°C、 20000 22000g离心18 22min，去除上清后，用体积浓度为70 80%的乙醇洗涤沉淀； 待沉淀自然干燥后，分别得对照组回收产物/实验组回收产物；5)、DNA含量测定将步骤4)所得的对照组回收产物/实验组回收产物分别加入无菌水充分溶解；然后分别测定ssDNA的量；将实验组回收产物的ssDNA含量减去对照组回收产物的ssDNA含量，得植物端粒酶活性值。
2.根据权利要求1所述的植物端粒酶活性的检测方法，其特征是所述步骤3)通过普通分光光度计测定富集上清液中蛋白含量。
3.根据权利要求1或2所述的植物端粒酶活性的检测方法，其特征是所述步骤4)中的IOX酶促反应液为每 IOOml 的 IOX 酶促反应液中含有0. 5M pH 8. 3Tris_HCl、50mM MgCl2、0. 5M KCl, IOOmM EGTA、0. Iml 的 Triton χ-lOOUOmM DTT、0. 5mM dNTP_C、0. 1 克的 BSA 和 2. OmM 的前导引物，其余为水；所述前导引物为 5’ -ATGATGTGCAACTCGACAACTT-3，。
4.根据权利要求3所述的植物端粒酶活性的检测方法，其特征是所述步骤4)中酶促反应中前导引物寡核苷酸的3’端的4个碱基不可改变，其余碱基容许有一定变化。
全文摘要
本发明公开了一种植物端粒酶活性的检测方法，依次包括以下步骤1)植物端粒酶初提取液制备；2)植物端粒酶的富集每10ml初提液中加入0.9～11克经DEPC处理的PEG6000；3)蛋白含量的测定取步骤2)所得富集上清液测定蛋白含量；4)端粒酶的酶促反应及产物的回收将灭活预处理后富集上清液作为对照组；将富集上清液作为实验组；经处理后，分别得对照组回收产物/实验组回收产物；5)DNA含量测定将步骤4)所得的对照组回收产物/实验组回收产物分别加入无菌水充分溶解；然后分别测定ssDNA的量；将实验组回收产物的ssDNA含量减去对照组回收产物的ssDNA含量，得植物端粒酶活性值。
文档编号C12Q1/68GK102443631SQ20111035799
公开日2012年5月9日 申请日期2011年11月13日 优先权日2011年11月13日
发明者刘小川, 刘红彦, 马登旭 申请人:浙江理工大学