专利名称：包封乳铁蛋白脂质体的制备方法
技术领域：
本发明涉及化学领域的乳铁蛋白和磷脂类，具体地是包封乳铁蛋白的脂质体及其制备方法。
背景技术：
乳铁蛋白是一种非血红素铁结合蛋白，属于转铁蛋白家族的一部分。近年来有不少报道指出乳铁蛋白不仅可以作为营养补充剂，补充人体所需要的铁和氨基酸，同时具有抗菌、抗病毒、抗癌、调节机体免疫反应等生物学功能。乳铁蛋白主要在肠道中运送铁，对哺乳动物发挥高效的补铁作用，为了减少其他组织器官内的细菌等对乳铁蛋白的消耗和破坏，可以将乳铁蛋白使用脂质体技术包埋起来，起到保护作用，从而具有缓释和靶向作用， 提高了乳铁蛋白在哺乳动物体内的生物利用率。据报道目前制备乳铁蛋白脂质体的方法有复乳法，其制备的最佳条件是Lf与膜材的质量比1 150，卵磷脂三油酸甘油酯胆固醇质量比7 2 1，氯仿乙醚体积比1 1和初乳与葡萄糖溶液的体积比1 3。发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种包封乳铁蛋白脂质体的制备方法，采用该方法制备而得的包封乳铁蛋白脂质体能提高乳铁蛋白的抑菌效果。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种包封乳铁蛋白脂质体的制备方法，依次包括以下步骤
1)、将大豆卵磷脂和胆固醇按照10 1 1质量比溶解于溶剂I中，得溶液I ；大豆卵磷脂与溶剂I的质量/体积比为5 8毫克大豆卵磷脂/1毫升溶剂I ；
将乳铁蛋白溶解于溶剂II中，得溶液II ；乳铁蛋白与溶剂II的质量/体积比为 8 18毫克乳铁蛋白/1毫升溶剂II ；
将溶液I和溶液II放入容器中混合均质，然后减压蒸发直至形成脂质薄膜层；乳铁蛋白与大豆卵磷脂的质量比为1 1.2 4;
2)、按照每IOOmg大豆卵磷脂配25 40ml的混合溶剂的用量比，向容器中加入由吐温-80和溶剂II组成的混合溶剂，吐温-80和溶剂II的质量比为0. 005 0. 02 1 ；
3)、将步骤2、的所得物减压至0. 07 0. IMPa蒸发，直至脂质薄膜层溶解于混合溶剂中，得包封乳铁蛋白的脂质体。
作为本发明的包封乳铁蛋白脂质体的制备方法的改进溶剂I为三氯甲烷和/ 或乙醚；溶剂II为pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液(即磷酸二氢钠和的磷酸氢二钠浓度均为 0. 2mol/L)。
作为本发明的包封乳铁蛋白脂质体的制备方法的进一步改进步骤1)中的均质为在均质机上均质2 5min，从而形成稳定的体系。
作为本发明的包封乳铁蛋白脂质体的制备方法的进一步改进步骤1)中的减压蒸发的真空度为0. 07 0. IMPa0
作为本发明的包封乳铁蛋白脂质体的制备方法的进一步改进步骤幻的真空压为 0.09MPa。在本发明中，大豆卵磷脂、胆固醇和乳铁蛋白均能通过市购的方式获得，例如大豆卵磷脂可购自北京双旋微生物培养基制品厂，胆固醇可购自中国医药集团上海化学试剂公司，乳铁蛋白可购自南京天淳有限公司。本发明将脂质基质(即大豆卵磷脂和胆固醇)溶于三氯甲烷等溶剂中，然后加入一定浓度的乳铁蛋白磷酸盐缓冲溶液，从而将水溶性乳铁蛋白包封在脂质体的内水相中。本发明采用的分析方法和仪器如下1.乳铁蛋白纳米脂质体平均粒径用马尔文 2000粒度分布仪。2.乳铁蛋白纳米脂质体包封率用紫外分光光度法。3.细菌总数测定方法《食品卫生微生物学检测菌落总数测定》GB4789. 2测定。本发明具备如下优点1、本发明采用脂质逆向蒸发法制备乳铁蛋白脂质体，并采用均质机对脂质双分子层与含有乳铁蛋白的磷酸盐缓冲液混合体系均质，直至为稳定的体系，此技术大大提高了乳铁蛋白的包埋率，同时也提高了乳铁蛋白脂质体的稳定性。2、本发明制备的乳铁蛋白脂质体通过对冷藏鸭肉抑菌保鲜的应用后，发现脂质体包埋技术有效的提高了乳铁蛋白的抑菌能力，其机理应与乳铁蛋白脂质体缓释效果有关。3、本发明有效的采用乳铁蛋白脂质体对冷藏鸭肉进行了抗菌保鲜应用，探讨了乳铁蛋白脂质体对提高抗菌保鲜效果的作用机理。本发明的乳铁蛋白脂质体为脂质体载体的应用拓宽了道路，运用脂质体作为载体包埋乳铁蛋白，并首次应用于食品保鲜领域，具有重大的研究意义。综上所述，本发明采用纳米脂质体技术将乳铁蛋白保护起来，制备乳铁蛋白纳米脂质体，控释乳铁蛋白的释放，提高生物利用度。本发明的乳铁蛋白脂质体的平均粒径为 234nm，而现有方法制备而得的乳铁蛋白脂质体的粒径大小未见报道，由于该发明制备的脂质体属于纳米级别，所以具有更好的表面效应。本发明使用逆向蒸发辅助均质法制备所得乳铁蛋白纳米脂质体，相较于复乳法制备的脂质体而言，本发明使用的材料更为简单且制备的脂质体为纳米级别，具有纳米材料所具备的小尺寸效应和表面效应，具有良好的缓释效果。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是乳铁蛋白脂质体的平均粒径分布图。
具体实施例方式实施例1、一种包封乳铁蛋白的脂质体的制备方法，依次进行以下步骤1)、取IOOmg大豆卵磷脂和20mg胆固醇溶解于15ml氯仿和乙醚混合溶液中(氯仿和乙醚ν v = 2 3)，使其(即大豆卵磷脂和胆固醇)充分溶解，得溶液I。将26. 6mg乳铁蛋白溶解于:3ml pH值为7. 4磷酸盐缓冲溶液中，得溶液II。将溶液I和溶液II放入旋转蒸发瓶中混合后先磁力搅拌2h，再在均质机中均质 2 5分钟(均质机的功率200W)，从而使溶液I和溶液II形成稳定的单相体系。在37°C的水浴中，真空压于0. 09MI^下，在旋转蒸发仪上蒸发直至形成一层脂质薄膜(即附着于旋转蒸发瓶上的脂质薄膜层)。2)、向旋转蒸发瓶中加入30ml磷酸盐缓冲溶液(pH值为7. 4)和282 μ 1的吐温_80 组成的混合溶剂。3)、在37°C的水浴中，真空压于0. 09MPa下，于旋转蒸发仪上蒸发；直至附着于旋转蒸发瓶上的脂质薄膜层溶解于混合溶剂中，得包封乳铁蛋白的脂质体IOml。采用考马斯亮蓝法，测得该包封乳铁蛋白的脂质体中乳铁蛋白浓度为2毫克/毫升。大豆卵磷脂胆固醇的质量比为5 1。实验1、将实施例1制备所得的乳铁蛋白脂质体添加入冷藏鸭肉中研究其对冷冻鸭肉的抗菌作用，从而探索制备的乳铁蛋白脂质体对提高乳铁蛋白生物利用度的作用。实验方法与步骤1、将冷藏鸭肉进行去筋去膜处理，分为25g/份，待用。每组肉块在保鲜液(实施例 1所得的包封乳铁蛋白的脂质体，该包封乳铁蛋白的脂质体中乳铁蛋白的浓度为2mg/ml) 中浸泡2min，取出摆放于干净的盘筛中浙水3 5min ；作为实验组；分别设置如下对照组空白对照组以无菌蒸馏水替代上述保鲜液，其余处理方式同实验组；对照组1、以乳铁蛋白和pH7. 4的磷酸盐缓冲液的混合物(在2mg乳铁蛋白中用磷酸盐缓冲液定容至Iml所得)替代上述保鲜液，其余处理方式同实验组；对照组2、以乳铁蛋白、大豆卵磷脂、胆固醇和pH7. 4的磷酸盐缓冲液的混合物(在 2mg乳铁蛋白、IOmg大豆卵磷脂和2mg胆固醇中用磷酸盐缓冲液定容至Iml所得)替代上述保鲜液，其余处理方式同实验组；对照组3、按照背景技术制备而得复乳法脂质体悬液，乳铁蛋白浓度为2毫克/毫升。包装方式为保鲜膜托盘包装，贮藏保鲜温度为4 士 1°C。2、细菌总数测定方法(1)在无菌条件下，称取样肉样25g，无菌剪刀剪碎后，放入装有225ml的无菌生理盐水的三角瓶中。(2)摇床中振摇30min制成1 10 (体积比)的稀释液。(3)用Iml灭菌吸管吸取稀释液1ml，沿管壁缓缓注入装有9ml灭菌生理盐水的试管中，做成1 100的稀释液。(4)另取一支Iml灭菌吸管，按上面方法做一个1 1000的稀释度，在做递增稀释的同时，以吸取该样品稀释液的吸管吸取Iml稀释液于灭菌平皿内，每个样品稀释度做两个平皿。(5)样品稀释液倾入平皿后，及时将冷却至46°C的营养琼脂培养基注入平皿约 15ml，并转动平皿使混合均勻。(6)待琼脂凝固后，翻转平板，置37°C培养箱内培养对-4他。(7)计算平皿内细菌菌落数目，乘以稀释倍数，即得每毫升样品所含菌落总数。不同的保鲜天数后所对应的实验结果如表1所示表1、乳铁蛋白脂质体对冷藏鸭肉抗菌效果的影响
权利要求
1.包封乳铁蛋白脂质体的制备方法，其特征是依次包括以下步骤1)、将大豆卵磷脂和胆固醇按照10 1 1质量比溶解于溶剂I中，得溶液I ；所述大豆卵磷脂与溶剂I的质量/体积比为5 8毫克大豆卵磷脂/1毫升溶剂I ；将乳铁蛋白溶解于溶剂II中，得溶液II ；所述乳铁蛋白与溶剂II的质量/体积比为 8 18毫克乳铁蛋白/1毫升溶剂II ；将所述溶液I和溶液II放入容器中混合均质，然后减压蒸发直至形成脂质薄膜层；所述乳铁蛋白与大豆卵磷脂的质量比为1 1.2 4;2)、按照每IOOmg大豆卵磷脂配25 40ml的混合溶剂的用量比，向容器中加入由吐温-80和溶剂II组成的混合溶剂，所述吐温-80和溶剂II的体积比为0. 005 0. 02 1 ；3)、将步骤2、的所得物减压至0.07 0. IMPa蒸发，直至脂质薄膜层溶解于混合溶剂中，得包封乳铁蛋白的脂质体。
2.根据权利要求1所述的包封乳铁蛋白脂质体的制备方法，其特征是所述溶剂I为三氯甲烷和/或乙醚。
3.根据权利要求2所述的包封乳铁蛋白脂质体的制备方法，其特征是所述溶剂II为PH7. 4的磷酸盐缓冲溶液。
4.根据权利要求3所述的包封乳铁蛋白脂质体的制备方法，其特征是所述步骤1)中的均质为在均质机上均质2 5min，从而形成稳定的体系。
5.根据权利要求4所述的包封乳铁蛋白脂质体的制备方法，其特征是所述步骤1)中的减压蒸发的真空度为0. 07 0. IMPa0
6.根据权利要求5所述的包封乳铁蛋白脂质体的制备方法，其特征是所述步骤3)的真空压为0. 09MPa。
全文摘要
本发明公开了一种包封乳铁蛋白脂质体的制备方法，依次包括以下步骤1)将大豆卵磷脂和胆固醇按照10～1∶1质量比溶解于溶剂I中，得溶液I；将乳铁蛋白溶解于溶剂II中，得溶液II；将溶液I和溶液II放入容器中混合均质，然后减压蒸发直至形成脂质薄膜层；2)向容器中加入由吐温-80和溶剂II组成的混合溶剂；3)将步骤2)的所得物减压至0.07～0.1MPa蒸发，直至脂质薄膜层溶解于混合溶剂中，得包封乳铁蛋白的脂质体。采用该方法制备而得的包封乳铁蛋白脂质体能提高乳铁蛋白的抑菌效果。
文档编号A23B4/20GK102487990SQ20111035842
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月14日 优先权日2011年11月14日
发明者关荣发, 刘光富, 刘 英, 芮昶, 金慧伟, 马洁清, 黄斯 申请人:中国计量学院