专利名称：一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法
技术领域：
本发明属于植物保护技术领域，涉及番茄黄化曲叶病毒接种鉴定的研究，更具体的说是一种快速、简捷、高效的鉴定天津地区番茄黄化曲叶病毒抗性接种的方法。
背景技术：
番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)主要危害番茄、辣椒、茄子、甘蓝和黄瓜等蔬菜以及烟草等经济作物，特别是在番茄上危害更重。针对于TYLCV 病毒的发生和危害，如何准确、快速、高效地检测到该病毒的存在和发生，是蔬菜安全可持续生产的迫切需要。目前，鉴定番茄黄化曲叶病抗性的方法有烟粉虱传毒、嫁接接种和机械传毒等等。 其中，嫁接法以嫩病叶做接穗，采用腹接法接种到健康番茄上，它的优点是能够为待鉴定植株提供高含量的ITLCV病毒，但该方法耗时耗力，只适于少量鉴定。机械传播是在人工环境下把感染TYLCV的曼陀罗、心叶烟或潘那利番茄作为毒源，通过机械传播侵染健康番茄植株，成功率较低，且病毒从番茄传到番茄上成功的例子只有很少的报道，因此，在接种中一般不用该TYLCV病毒。在育种进程中最常用的接种方法是烟粉虱接种鉴定法，包括温室中烟粉虱接种、回型笼中烟粉虱接种、露地烟粉虱接种3种类型，但这个方法也有一些缺点1.虫口密度不均一对抗性鉴定的影响。若虫口密度过大，一些抗病品种也会表现出感病来；若虫口密度太小，又区分不出抗感品种。目前对虫口密度的要求还没有一个标准。 2.虫子逃逸引起病害的大面积发生。烟粉虱的体长一般为l_2mm，它可随着调查人员的进出而逃逸出来，从而给周围番茄产区带来灾害。3.受季节限制。烟粉虱的最佳活动温度是 ^_28°C，低于15°C虫子基本不活动，也就不能传毒，这就会延缓接种鉴定的进程。农杆菌接种法是近年来发展起来的一种病毒抗性鉴定方法。利用TYLCV-DNA侵染性克隆，通过根癌农杆菌侵染待鉴定植株，病毒DNA可在植物体内形成、复制、运输并诱发症状。侵染性克隆技术首先在噬菌体病毒Qβ、脊髓灰质炎病毒b^iorir皿)中获得成功，植物病毒侵染性克隆由Ahlquist等(1984)在雀麦花叶病毒virus, BMV)首次报道，至今国外已有大量的植物病毒被成功地构建了全长cDNA侵染性克隆 (2008)。^iang等(2010，2009)分别构建了番木瓜黄曲病毒的侵染性克隆和上海分离物 YLCV-[CN:SH2]的侵染性克隆，证明通过农杆菌注射能诱导出病毒侵染症状。本发明的研究表明(2011)天津地区的分离物与上海和山东等省的分离物基因序列不同，编码转录激活蛋白的序列有2处突变，导致天津地区分离物与其它地区分离物氨基酸的不同，分别是90位E到G和104位H到Y，推测这两个突变可能增强了其致病力。目前，国内还未见天津地区TYLCV的侵染性克隆工作的报道，因此，针对以天津为代表的华北地区抗番茄曲叶病毒栽培专用品种缺乏的现状，开展侵染性克隆构建工作，建立一套方便、可靠、安全的接种新方法，为抗病育种提供一种客观的评价体系，从而筛选培育出具有自主知识产权的专用品种，对于提高番茄市场竞争力，推进蔬菜产业可持续发展
4具有重要意义。
发明内容
针对传统技术不能准确地对TYLCV抗性进行鉴定的问题，本发明人进行了大量的研究工作，构建了针对天津地区TYLCV的侵染性克隆(代号为TYLCV-TJ)，通过茎杆注射接种番茄黄化曲叶病毒，鉴定不同番茄材料对该病毒的抗性。此方法无需饲养烟粉虱、操作简单、效率高、重复性好、可控性好，能提供相对一致的接种压力，结果准确，是一种简便有效的接种鉴定方法。本发明所公开的技术内容如下
一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，其特征在于按如下的步骤进行
1)DNA提取从收集的发病植株的叶片中提取基因组总DNA ；
2)引物的设计以植物总DNA为模板，设计简并引物-对病毒DNA-A进行PCR扩增，其中扩增所用PCR引物为
BamHI 上 ag tgggatccac ttctaaatg
BamHI Τ* aggatcc catattgcaagacagactac
2356Fbggatggaaatgtgctgacct
BamRbgtggatcccacatattgcaa
a:扩增全长的DNA-A序列；
b 扩增0. 4A的DNA-A序列；
3)扩增产物克隆到pMD-19T载体上，分别命名为1. OA-pMD和0. 4A_pMD并转化到 DH5a菌液中；
4)串联重复的克隆用BamHI酶切切下1.OA-pMD的病毒全长DNA ；用BamHI切开含有 0. 4A病毒基因组片段的0. 4A-pMD载体；利用试剂盒回收相应大小的片段，利用T4连接酶将二者相连得到1. 4A-pMD重组载体，转化至Dffia菌液中；
5)正向串联重复序列的获得
1. OA和0. 4A两个片段，利用引物C扩增阳性克隆菌液，比较大小后选出正向串联的菌落形成1. 4A串联的克隆；所用引物为
PMD19F ccgcc aag ctt gca tgccg
BamR cgtggatcccacatattgcaa ；
6)表达载体的构建和转化
利用KnpI和Mil对含有1. 4A TYLCV的1. 4A_pMD质粒和植物表达载体pRI IOl-An 进行双酶切，然后利用T4连接酶将目的片段与表达载体进行连接得到1.4A- pRI，将连接产物转化至大肠杆菌DH5 α中；用冻融法将1. 4Α- pRI直接转化农杆菌LBA4404的感受态细胞，转化后的菌液涂布于含利福平和卡那霉素平板，温箱培养2 3d ；挑取单菌落接种于anl含利福平50ug / mL和卡那霉素50ug / mL的TCB培养基中培养过夜后，取ImI 菌液置于1.5ml离心管，离心收集菌体，加50 L无菌水煮沸lOmin，取上清作模板进行PCR 扩增，扩增产物用1. 0%琼脂凝胶电泳验证；
7)重组质粒的提取与鉴定
用 TAKARAMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0 (50 次量)试剂盒进行质粒 DNA的微量提取，利用Mil和KnpI双酶切1. 4A -pRI，37°C酶切消化Ih后琼脂糖凝胶电泳8)序列测定与分析
数据处理借助 DNAMAN Version 6. 0 (Lynnon Biosoft, QuebeCanada)进行，利用 BLAST 程序在GeneBank数据库中寻找与DNA-A序列最相近的基因组序列；
9)农杆菌接种及病毒DNA的检测和田间调查
将含有病毒DNA-A侵染性克隆的农杆菌LBA4404分别接种在含卡那霉素(50 ug/mL) 和利福平(50 ug/mL)的YEB液体培养基中，28°C，200 rpm振荡培养48 h，接种时，取一支 1 mL的一次性注射器，吸取培养好的农杆菌菌液，在距离供试植株根部1-2 cm处取三点进行韧皮部注射，接种植株置于防虫温室中培养，在注射接种后30天，采集叶片约0. 5克，抽 DNA-A后进行PCR检测，对植株高度和叶片进行症状的观察。本发明通过该方法能科学高效准确地鉴定出番茄对ITLCV的抗性，其特点在于 (1)本发明公开的接种鉴定方法与其它的侵染性克隆不同的是本发明是利用双子叶植
物表达载体pRI-101-AN。该载体能特异地在番茄体内高效表达有利于病毒症状的诱导且具有自主知识产权。(2)本发明将含有双向起动子的顶区序列串联在了全长基因组编码序列之后，而其它的如TYLCV的YlO分离物是将顶区串联在了全长基因组之前，实验证明这种策略同样能有效起动病毒的编码，为侵染性克隆的构建提供了更多的途径。(3)本发明是针对天津地区特有的番茄黄化曲叶病毒序列而构建的表达载体，其所编码的氨基酸与其它地区是不同的，见文献《华北农学报》2011年第1期“天津地区番茄黄化曲叶病毒DNA-A的克隆和序列分析”。本发明更加详细的方法如下 1材料和方法
1.1材料
毒源TYLCV侵染植株所引起的典型症状为黄脉、曲叶、曲茎、叶片皱缩、叶脉增厚、叶色褪绿、植株矮化等症状。采集表现这些症状的栽培番茄，-70°C保存待用。菌株与载体大肠杆菌和农杆菌L. BA4404DH5 α购均自北京博美科生物技术有限公司；分子量标准Taq酶和克隆载体pMD-19T植物表达载体pRI IOl-An均购自宝生物工程有限公司。限制性内切酶，T4 DNA连接酶及DNA购自宝信购自New England Biolabs01. 2 方法
(1)取材料，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5ml Eppendorf管中；
(2)加入800μ 1的CTAB提取缓冲液，混勻(CTAB在65°C水浴预热)，每5min轻轻震荡几次，20min 后 12000 r/min，离心 15 min ；
(3)小心吸取上清液，加入等体积的酚氯仿(各400μ 1)溶液，混勻，4°C，12000 r/min, 离心10 min ；
(4)小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混勻，4°C，12000r/min，离心10 min。(5)重复步骤(4) 1-2次，以蛋白层不出现为止；
(6)取上清，-20°C沉淀lh，4°C，12000 r/min，离心 10 min ；
(7)弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次；
(8)室温下干燥后(一般干燥5-15min)，溶于30-50 μ 1 DEPC去离子水中，于_20°C或者-70°C下保存备用。引物的设计
根据于力等人设计的1对简并引物，用于扩增该保守区的的片段。引物序列分别为
CoPR,5，>GA(AGCT)G(GC)ATG(ACT)GT(AG)CA (AGT)GCCATATA<3，， AV494，5，>GCC (CT)AT (AG)TA (CT)AG (AG) AAGCC (AC)AG<3，。对该部分区域进行克隆及序列测序，BLAST比较确定其是否为TYLCV分离物。根据已知片段的序列扩增未知的全长序列。在设计引物时加入载体的酶切位点
表1克隆所用PCR引物
权利要求
1. 一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，其特征在于按如下的步骤进行1)DNA提取从收集的发病植株的叶片中提取基因组总DNA ；2)引物的设计以植物总DNA为模板，设计简并引物-对病毒DNA-A进行PCR扩增，其中扩增所用PCR引物为BamHI _tag tgggatccac ttctaaatgBamHI Τ" aggatcc catattgcaagacagactac2356FbggatggaaatgtgctgacctBamRbgtggatcccacatattgcaaa 扩增全长的DNA-A序列；b 扩增0. 4A的DNA-A序列；3)扩增产物克隆到pMD-19T载体上，分别命名为1. OA-pMD和0. 4A_pMD并转化到 DH5a菌液中；4)串联重复的克隆用BamHI酶切切下1.OA-pMD的病毒全长DNA ；用BamHI切开含有 0. 4A病毒基因组片段的0. 4A-pMD载体；利用试剂盒回收相应大小的片段，利用T4连接酶将二者相连得到1. 4A-pMD重组载体，转化至Dffia菌液中；5)正向串联重复序列的获得1. OA和0. 4A两个片段，利用引物C扩增阳性克隆菌液，比较大小后选出正向串联的菌落形成1. 4A串联的克隆；所用引物为PMD19F ccgcc aag ctt gca tgccgBamR cgtggatcccacatattgcaa ；6)表达载体的构建和转化利用KnpI和Mil对含有1. 4A TYLCV的1. 4A_pMD质粒和植物表达载体pRI IOl-An进行双酶切，然后利用T4连接酶将目的片段与表达载体进行连接得到1.4A- pRI，将连接产物转化至大肠杆菌DH5 α中；用冻融法将1. 4Α- pRI直接转化农杆菌LBA4404的感受态细胞，转化后的菌液涂布于含利福平和卡那霉素平板，温箱培养2 3d ；挑取单菌落接种于anl含利福平50ug / mL和卡那霉素IOOug / mL的YEB培养基中培养过夜后，取ImI 菌液置于1.5ml离心管，离心收集菌体，加50 L无菌水煮沸lOmin，取上清作模板进行PCR 扩增，扩增产物用1. 0%琼脂凝胶电泳验证；7)重组质粒的提取与鉴定用 TAKARAMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0 (50 次量)试剂盒进行质粒 DNA的微量提取，利用Mil和KnpI双酶切1. 4A -pRI，37°C酶切消化Ih后琼脂糖凝胶电泳检查结果；8)序列测定与分析数据处理借助 DNAMAN Version 6. 0 (Lynnon Biosoft, QuebeCanada)进行，利用 BLAST 程序在GeneBank数据库中寻找与DNA-A序列最相近的基因组序列；9)农杆菌接种及病毒DNA的检测和田间调查将含有病毒DNA-A侵染性克隆的农杆菌LBA4404分别接种在含卡那霉素(50 ug/mL) 和利福平(50 ug/mL)的YEB液体培养基中，28°C，200 rpm振荡培养48 h，接种时，取一支 1 mL的一次性注射器，吸取培养好的农杆菌菌液，在距离供试植株根部1-2 cm处取三点进行韧皮部注射，接种植株置于防虫温室中培养，在注射接种后30天，采集叶片约0. 5克，抽DNA-A后进行PCR检测，对植株高度和叶片进行症状的观察。
全文摘要
本发明涉及一种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，它是针对天津地区特有的番茄黄化曲叶病毒序列而构建了针对天津地区TYLCV的侵染性克隆，通过茎杆注射接种番茄黄化曲叶病毒，鉴定不同番茄材料对该病毒的抗性。此方法无需饲养烟粉虱、操作简单、效率高、重复性好、可控性好，能提供相对一致的接种压力，结果准确，是一种简便有效的接种鉴定方法。
文档编号C12Q1/68GK102392080SQ20111036516
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者刘仲齐, 王建江, 薛俊, 金凤媚 申请人:天津市农业生物技术研究中心