专利名称：一组卷烟赋香菌株及复配的微生物制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及3种卷烟赋香菌株及复配的卷烟赋香微生物制剂，其中包括2株芽孢杆菌(Bacillus sp.)和1株酵母菌(Saccharomyces sp.)，该卷烟赋香微生物制剂能够用于卷烟发酵，替代传统的加香，经发酵处理的卷烟理化指标和评吸结果均达到商品化卷烟标准。
背景技术：
卷烟工业中，根据不同卷烟叶组中的烟叶品种、烟叶产地、烟叶等级、烟叶年份和烟叶配比等，通过加料加香，赋予卷烟产品特定产品风格，提供给消费者特定的感官体验。 通过加料，可以改善卷烟的吸食品质、改善烟丝的物理性状、改善烟丝的燃烧性和防止烟丝霉变等；通过加香，在不损害烟叶原有香气的情况下，衬托烟香，同时掩盖杂气，达到增香赋香、改善吃味和协调香味的作用，进而最终形成卷烟产品风格。按照来源不同，烟草香料包括天然香料和合成香料2大类。然而，世界卫生组织(WHO)在《烟草控制框架公约》中建议各国限制或禁止在烟草中使用香料等添加剂，包括葡萄糖、蜂蜜、香草醛和中草药等天然或合成烟香香料都在范围内。我国已于2005年正式批准《烟草控制框架公约》，减少和限制天然和合成香料的使用是大势所趋。采用烟叶表面微生物来达到替代传统加料加香的目的，以期形成新的卷烟的卷烟产品。本领域技术人员也做了大量的工作，实际上，微生物发酵已被证明可改善烟叶可用性，是烟叶吸食品质形成的重要环节，根据发酵方式的不同，可分为人工发酵和自然发酵， 国内外学者针对烟叶的人工发酵进行了大量的研究和实践。然而，但还未有仅使用复配微生物制剂用于卷烟产品风格形成的报道。
发明内容
针对卷烟工业发展的需求，本发明目的在于，通过分离、筛选、培养得到了 3株卷烟赋香菌株，经复配可以用于卷烟叶组的赋香，替代传统加料加香工艺。经实验证明，采用该复配菌株制剂用于卷烟发酵后，卷烟的理化指标和评吸结果均达到商品化卷烟标准。为了实现上述任务，本发明的方法通过以下技术方案得以实现一种卷烟赋香菌株，其特征在于，该卷烟赋香菌株命名为芽孢杆菌(Bacillus sp. )LBT1. 0007，保藏号为 CGMCC No. 5332。一种卷烟赋香菌株，其特征在于，该卷烟赋香菌株命名为芽孢杆菌(Bacillus sp. )LBT1. 0013，保藏号为 CGMCC No. 5333。一种卷烟赋香菌株，其特征在于，该卷烟赋香菌株命名为酵母菌(Saccharomyces sp. )LBT1. 0038，保藏号为 CGMCC No. 5334。一种卷烟赋香微生物复配制剂，其特征在于，该卷烟赋香微生物复配制剂含有芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1. 0007、芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1. 0013 和酵母菌(Saccharomyces sp.) LBT1. 0038，且芽孢杆菌(Bacillus sp.) LBT1. 0007 芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1. 0013 酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1. 0038 = (0. 001 1) (0. 001 1. 5) (0. 005 15)。上述芽孢杆菌(Bacillussp.)LBT1. 0007 或芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1. 0013 的分离筛选方法，其特征在于，该方法先用无菌生理盐水与Ig醇化烟叶混合后，用无菌取样的方法取ImL混合液加入到9mL灭菌生理盐水中制成KT1菌悬液，然后逐级稀释，取10_2、 10_3、10_4、10 5、10_6、10_7六个稀释度的菌悬液0. 2mL涂布到LB培养基上，37 °C恒温培养 24h,挑取长势良好，菌落饱满均勻，且稀释度适宜的平板的单菌落，镜检；LB培养基主要成分为胰化蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，NaCl 酵母提取物(yeast extract)，也称酵母膏，市售。镜检若为纯培养单一菌株，则接种于LB斜面固体培养基，37°C恒温培养24h后保藏于4°C冰箱；LB斜面固体培养基主要成分为胰化蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%, NaCl 1% ； 琼脂2% ；镜检若为混合菌株，则再次在LB培养基平板上进行划线分离，直至镜检为菌株纯培养物后，接种斜面试管，37°C恒温培养24h后保藏于4°C冰箱；对筛选所得的所有纯培养菌株用于烟叶发酵，并根据烟叶理化性质和评吸结果， 最终筛选和确定卷烟赋香菌株。上述酵母菌(Saccharomyces sp. ) LBT1. 0038的分离筛选方法，其特征在于，该方法先用无菌生理盐水与Ig醇化烟叶混合后，用无菌取样的方法取ImL混合液加入到9mL灭菌生理盐水中制成 ο—1菌悬液，然后逐级稀释，取ιο-2、ιο-3、ιο-4、ιο-5、 (Γ6、ιο-7六个稀释度的菌悬液0. 2mL涂布到YPD培养基上，32°C恒温培养Mh，挑取长势良好，菌落饱满均勻，且稀释度适宜的平板的单菌落，镜检；YPD培养基主要成分为酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖；镜检若为纯培养单一菌株，则接种于YPD斜面固体培养基，32°C恒温培养24h后保藏于4°C冰箱；YPD斜面固体培养基主要成分为酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2% ；琼脂 2% ；镜检若为混合菌株，则再次在YPD培养基平板上进行划线分离，直至镜检为菌株纯培养物后，接种斜面试管，32°C恒温培养24h后保藏于4°C冰箱；对筛选所得的所有纯培养菌株用于烟叶发酵，并根据烟叶理化性质和评吸结果， 最终筛选和确定卷烟赋香菌株。上述芽孢杆菌(Bacillussp.)LBT1. 0007 或芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1. 0013 的培养方法，其特征在于，将保藏的芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1.0013或芽孢杆菌 (Bacillus sp. )LBT1. 0007从斜面接种2环至IOOmL的LB液体培养基中，于27°C 37°C, IOOrpm 180rpm恒温摇床振荡培养12h 36h，得到芽孢杆菌(Bacillus sp. )LBT1. 0013 或芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT 1. 0007发酵液；其中，LB液体培养基主要成分为胰化蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，NaCl 1% ；琼脂2%，pH自然；所得到的芽孢杆菌(Bacillussp.)LBT1. 0013 或芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT 1. 0007发酵液在4°C条件下，以8500r/min 11000r/min离心5min 15min，弃上清液得到湿菌体，进一步得到粉剂或冻干粉，保藏于4°C冰箱备用。上述酵母菌(Saccharomyces sp. ) LBT1. 0038的培养方法，其特征在于，将保藏的酵母菌(Saccharomyces sp.) LBT1. 0038从斜面接种2环至IOOmL的YPD液体培养基中，于 27°C 37°C，IOOrpm 180rpm恒温摇床振荡培养12h 36h，得到酵母菌(Saccharomyces sp.) LBT1. 0038发酵液；其中，YPD液体培养基主要成分为酵母膏1 %，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH自然；所得到的酵母菌(Saccharomyces sp. )LBT1. 0038发酵液在4°C条件下，以8500r/ min llOOOr/min离心5min 15min，弃上清液得到湿菌体，进一步得到粉剂或冻干粉，保藏于4°C冰箱备用。上述卷烟赋香微生物复配制剂的配制方法，其特征在于，将各菌株发酵液、粉剂或冻干粉在4°C条件下，于8500r/min 11000r/min离心5min 15min，弃上清液得到湿菌体，称量，然后以芽孢杆菌(Bacillus sp.) LBT1. 0007 芽孢杆菌(Bacillus sp.) LBT1. 0013 酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1. 0038 = (0.001 1) (0.001 1.5) (0.005 15)的比例复配。将上述烟赋香微生物复配制剂用于卷烟叶组发酵的应用，将卷烟赋香复配菌株制剂按照0. OOOlwt% IOwt %质量比例喷施于切后烟丝/叶组或烘后烟丝/叶组的表面进行发酵。本发明得到的3株卷烟赋香菌株，并配制成卷烟叶组赋香复配微生物制剂，具有易培养、增香效果好、发酵速度快、降害效果明显等，是一种新的卷烟赋香复配微生物制剂。
具体实施例方式为了获得卷烟叶组赋香菌株，申请人从烟叶表面分离、筛选可使卷烟叶组赋香的一组微生物菌株，即芽孢杆菌(Bacillus sp. )LBT1.0007、芽孢杆菌(Bacillus sp.) LBT1. 0013 和酵母菌(Saccharomyces sp.) LBT1. 0038，于 2011 年 10 月 12 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并配制成卷烟叶组复配赋香微生物，该复配微生物制剂其可实现卷烟叶组的增香和降害。在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号分别为 CGMCC No. 5332、CGMCC No. 5333 和 CGMCCNo. 5334。以下给出具体的分离、筛选的实施例。1)芽孢杆菌(Bacillus sp. )LBT1. 0007 或芽孢杆菌(Bacillus sp. )LBT1. 0013 的
分离与筛选从自然醇化3年以上的烟叶表面分离卷烟叶组赋香菌菌株，其分离方法是先用无菌生理盐水与Ig醇化烟叶混合后，用无菌取样的方法取ImL混合液加入到9mL灭菌生理盐水中制成KT1菌悬液，然后逐级稀释，取10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7六个稀释度的菌悬液0. 2mL涂布到LB培养基上，37 °C恒温培养Mh，挑取长势良好，菌落饱满均勻，且稀释度适宜的平板的单菌落，镜检。镜检若为纯培养单一菌株，则接种于LB斜面固体培养基，37°C恒温培养24h后保藏于4°C冰箱。镜检若为混合菌株，则再次在LB培养基平板上进行划线分离，直至镜检为菌株纯培养物后，接种斜面试管，37°C恒温培养24h后保藏于4°C冰箱。LB培养基主要成分为胰化蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%, NaCl 1% ；pH自然，LB斜面固体培养基是在LB培养基的基础上加入2%琼脂成为LB斜面固体培养基；PH自然。镜检若为纯培养单一菌株，则接种于LB斜面固体培养基，37°C恒温培养24h后保藏于4°C冰箱；镜检若为混合菌株，则再次在LB培养基平板上进行划线分离，直至镜检为菌株纯培养物后，接种斜面试管，37°C恒温培养24h后保藏于4°C冰箱；对筛选所得的所有纯培养菌株用于烟叶发酵，并根据烟叶理化性质和评吸结果， 最终筛选和确定卷烟赋香菌株。2)酵母菌(Saccharomyces sp. )LBT1. 0038 的分离与筛选从自然醇化3年以上的烟叶表面分离卷烟叶组赋香菌菌株，其分离方法是该方法先用无菌生理盐水与Ig醇化烟叶混合后，用无菌取样的方法取ImL混合液加入到9mL灭菌生理盐水中制成10—1菌悬液，然后逐级稀释，取10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7 六个稀释度的菌悬液0. 2mL涂布到YPD培养基上，32°C恒温培养Mh，挑取长势良好，菌落饱满均勻，且稀释度适宜的平板的单菌落，镜检；YPD培养基主要成分为酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖；YPD斜面固体培养基是在YPD培养基加入2%琼脂成为YPD斜面固体培养基；pH自然。镜检若为纯培养单一菌株，则接种于YPD斜面固体培养基，37°C恒温培养24h后保藏于4°C冰箱；镜检若为混合菌株，则再次在YPD培养基平板上进行划线分离，直至镜检为菌株纯培养物后，接种斜面试管，37°C恒温培养24h后保藏于4°C冰箱；对筛选所得的所有纯培养菌株用于烟叶发酵，并根据烟叶理化性质和评吸结果， 最终筛选和确定卷烟赋香菌株。将所得的芽孢杆菌(Bacillussp.) LBT1. 0007 或芽孢杆菌(Bacillus sp.) LBT1. 0013进行培养，其方法是，将保藏的芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBTl. 0013或芽孢杆菌 (Bacillus sp. )LBT1. 0007从斜面接种2环至IOOmL的LB液体培养基中，于27°C 37°C, IOOrpm 180rpm恒温摇床振荡培养12h 36h，得到芽孢杆菌(Bacillus sp. )LBT1. 0013 或芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT 1. 0007新鲜发酵液；其中，LB液体培养基主要成分为胰化蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，NaCl 1% ；琼脂2%，pH自然；所得到的芽孢杆菌(Bacillussp.)LBT1. 0013 或芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT 1. 0007发酵液在4°C条件下，以8500r/min 11000r/min离心5min 15min，弃上清液得到湿菌体，进一步得到粉剂或冻干粉，保藏于4°C冰箱备用。将所得的酵母菌(Saccharomyces sp. ) LBT1. 0038进行培养，其方法是，将保藏的酵母菌(Saccharomyces sp.) LBT1. 0038从斜面接种2环至IOOmL的YPD液体培养基中，于 27°C 37°C，IOOrpm 180rpm恒温摇床振荡培养12h 36h，得到酵母菌(Saccharomyces sp.) LBT1. 0038新鲜发酵液；其中，YPD液体培养基主要成分为酵母膏1 %，蛋白胨2%， 葡萄糖2%，琼脂2%，pH自然；
所得到的酵母菌(Saccharomyces sp. )LBT1. 0038发酵液在4°C条件下，以8500r/ min llOOOr/min离心5min 15min，弃上清液得到湿菌体，进一步得到粉剂或冻干粉，保藏于4°C冰箱备用。3)将得到的芽孢杆菌(Bacillus sp. )LBT1. 0007、芽孢杆菌(Bacillus sp.) LBT1. 0013和酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1. 0038的发酵液在4 °C条件下，按照芽孢杆菌(Bacillus sp.) LBT1. 0007 芽孢杆菌(Bacillus sp.) LBT1. 0013 酵母菌 (Saccharomyces sp. )LBT1. 0038 = (0. 001 1) (0. 001 1. 5) (0. 005 15)的比例复配，得到卷烟赋香微生物复配制剂。如果采用粉剂或冻干粉可直接进行复配。4)用于卷烟叶组发酵将得到卷烟赋香微生物复配制剂，按照0. 0001Wt% IOwt^质量比例均勻喷洒到卷烟叶组上进行恒温恒湿发酵。发酵后的卷烟叶组经烘丝、卷接和包装，获得卷烟成品经实验证明，采用该复配菌株制剂用于卷烟发酵后，卷烟的理化指标和评吸结果均达到商品化卷烟标准(表1，表2)。表1赋香复合微生物制剂的卷烟理化指标
总氮(％)氯(％)钾(％ )烟碱(％ )赋香复合微生物制剂卷烟2. 040. 321. 5372. 04对照组(喷施等量去离子水)2. 010. 322. 312. 12表2赋香复合微生物制剂的卷烟评吸结果
权利要求
1.一种卷烟赋香菌株，其特征在于，该卷烟赋香菌株命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.) LBT1. 0007，保藏号为 CGMCC No. 5332。
2.一种卷烟赋香菌株，其特征在于，该卷烟赋香菌株命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.) LBT1. 0013 保藏号为 CGMCC No. 5333。
3.一种卷烟赋香菌株，其特征在于，该卷烟赋香菌株命名为酵母菌(Saccharomyces sp. )LBT1. 0038，保藏号为 CGMCC No. 5334。
4.一种卷烟赋香微生物复配制剂，其特征在于，该卷烟赋香微生物复配制剂含有芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1. 0007、芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1. 0013 和酵母菌(Saccharomyces sp.) LBT1. 0038，且芽孢杆菌(Bacillus sp.) LBT1. 0007 芽孢杆菌(Bacillus sp. )LBT1. 0013 酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1. 0038 = (0. 001 1) (0. 001 1. 5) (0. 005 15)。
5.权利要求1或2所述的卷烟赋香菌株的分离筛选方法，其特征在于，该方法，先用无菌生理盐水与Ig醇化烟叶混合后，用无菌取样的方法取ImL混合液加入到9mL灭菌生理盐水中制成KT1菌悬液，然后逐级稀释，取10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7六个稀释度的菌悬液 0. 2mL涂布到LB培养基上，37°C恒温培养Mh，挑取长势良好，菌落饱满均勻，且稀释度适宜的平板的单菌落，镜检；LB培养基主要成分为胰化蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，NaCl 1% ；镜检若为纯培养单一菌株，则接种于LB斜面固体培养基，37°C恒温培养24h后保藏于 4°C冰箱；LB斜面固体培养基主要成分为胰化蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，NaCl 1% ；琼脂；镜检若为混合菌株，则再次在LB培养基平板上进行划线分离，直至镜检为菌株纯培养物后，接种斜面试管，37°C恒温培养24h后保藏于4°C冰箱；对筛选所得的所有纯培养菌株用于烟叶发酵，并根据烟叶理化性质和评吸结果，最终筛选和确定卷烟赋香菌株。
6.权利要求3所述的卷烟赋香菌株的分离筛选方法，其特征在于，该方法，先用无菌生理盐水与Ig醇化烟叶混合后，用无菌取样的方法取ImL混合液加入到9mL灭菌生理盐水中制成10—1菌悬液，然后逐级稀释，取10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7六个稀释度的菌悬液0. 2mL 涂布到YPD培养基上，32°C恒温培养Mh，挑取长势良好，菌落饱满均勻，且稀释度适宜的平板的单菌落，镜检；YPD培养基主要成分为酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2% ；镜检若为纯培养单一菌株，则接种于YPD斜面固体培养基，37°C恒温培养24h后保藏于 4°C冰箱；YPD斜面固体培养基主要成分为酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖；琼脂2% ；镜检若为混合菌株，则再次在YPD培养基平板上进行划线分离，直至镜检为菌株纯培养物后，接种斜面试管，37°C恒温培养24h后保藏于4°C冰箱；对筛选所得的所有纯培养菌株用于烟叶发酵，并根据烟叶理化性质和评吸结果，最终筛选和确定卷烟赋香菌株。
7.权利要求1或2所述的卷烟赋香菌株的培养方法，其特征在于，将保藏的芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1. 0013 或芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT 1. 0007 从斜面接种 2 环至 IOOmL的LB液体培养基中，于27°C 37°C，IOOrpm 180rpm恒温摇床振荡培养1 36h， 得到芽孢杆菌(Bacillus sp.) LBT1. 0013 或芽孢杆菌(Bacillus sp.) LBT 1.0007 发酵液； 其中，LB液体培养基主要成分为胰化蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，NaCl 1% ；琼脂 2%,pH自然；所得到的芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1. 0013或芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT 1.0007 发酵液在4°C条件下，以8500r/min 11000r/min离心5min 15min，弃上清液得到湿菌体，进一步得到粉剂或冻干粉，保藏于4°C冰箱备用。
8.权利要求3所述的卷烟赋香菌株的培养方法，其特征在于，将保藏的酵母菌 (Saccharomyces sp. )LBT1. 0038从斜面接种2环至IOOmL的YPD液体培养基中，于27°C 37°C, IOOrpm 180rpm恒温摇床振荡培养12h 36h，得到酵母菌(Saccharomyces sp.) LBT1. 0038发酵液；其中，YPD液体培养基主要成分为酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖 2%，琼脂2%，pH自然；所得到的酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1. 0038发酵液在4°C条件下，以8500r/ min llOOOr/min离心5min 15min，弃上清液得到湿菌体，进一步得到粉剂或冻干粉，保藏于4°C冰箱备用。
9.权利要求4所述的卷烟赋香微生物复配制剂的配制方法，其特征在于，将各菌株发酵液在4°C条件下，于8500r/min 11000r/min离心5min 15min，弃上清液得到湿菌体，称量，然后以芽孢杆菌(Bacillus sp.) LBT1. 0007 芽孢杆菌(Bacillus sp.) LBT1. 0013 酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1. 0038 = (0.001 1) (0.001 1.5) (0.005 15)的比例复配。
10.权利要求4所述的卷烟赋香微生物复配制剂用于卷烟叶组发酵的应用，将卷烟赋香复配菌株制剂按照0. 0001Wt% 10wt%质量比例喷施于切后烟丝/叶组或烘后烟丝/ 叶组的表面进行发酵。
全文摘要
本发明公开了一种卷烟叶组赋香复配微生物制剂及其复配方法，该卷烟叶组赋香微生物制剂组成为芽孢杆菌(Bacillus sp..)LBT1.0007、芽孢杆菌(Bacillus sp..)LBT1.0013和酵母菌(Saccharomyces.sp.)LBT1.0038，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号分别为CGMCCNo.5332、CGMCC No.5333和CGMCC No.5334。该复配菌株均由醇化烟叶表面分离筛选获得，是一种新的卷烟叶组赋香微生物制剂，经该微生物处理后，卷烟叶组的吸食品质改善明显，达到商品化卷烟相关技术要求。
文档编号C12R1/85GK102399725SQ201110369808
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月19日 优先权日2011年11月19日
发明者吕欣, 张岗, 张晓妮, 牟含军, 王颖, 胡喜怀, 赵德学, 郭志刚, 陈宝成 申请人:西北农林科技大学, 陕西中烟工业有限责任公司