专利名称：检测结肠腺癌相关基因启动子甲基化引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一系列检测结肠腺癌相关基因启动子甲基化引物。
背景技术：
肿瘤相关特异基因的启动子CpG区域的甲基化修饰与肿瘤发生和形成相关。值得关注的是，不同类型的肿瘤以及同一肿瘤的不同病理分型和分级，会发生特异的基因甲基化修饰，因此，肿瘤相关基因的甲基化状态已经成为一类重要的肿瘤检测标志物，可用于肿瘤早期检测、肿瘤预后评价和药物敏感性预测和评价。共轭聚合物为基础的荧光共振能量转移技术(Cationic conjugated polymer-basedfluorescence resonance energy transfer, CCP—FRET)能提 1 检测白勺敏感性和特异性，将这个技术应用于甲基化半定量分析，具有高效、成本低廉、操作简单、无需标记技术和特殊设备优点。而传统的DNA测序方法操作繁琐，敏感性较低；Real time PCR尽管具有较高的敏感性，但是它的成本较高，此外，对检测仪器的需求也限制了其在临床的实际应用。因此，CCP-FRET方法有希望成为临床常规检测方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供检测待测DNA甲基化的引物。本发明提供的引物，为如下1)或2)1)所示的引物由引物对A-引物对F组成；所述弓丨物对A由引物1和引物2组成；所述弓丨物对B由引物3和引物4组成；所述弓丨物对C由引物5和引物6组成；所述引物对D由引物7和引物8组成；所述引物对E由引物9和引物10组成；所述引物对F由引物11和引物12组成；所述引物1-引物12的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-12 ；2)所示的引物为所述引物对A-引物对F中的至少一种。上述引物对A用于检测VIM基因的甲基化；所述引物对A具体用于检测VIM基因 CpG位点的甲基化；上述弓丨物对B用于检测MGMT基因的甲基化；所述弓丨物对B具体用于检测MGMT基因CpG位点的甲基化；上述引物对C用于检测TMEFF2或HPPl基因的甲基化；所述引物对C具体用于检测TMEFF2或HPPl基因CpG位点的甲基化；上述引物对D用于检测ESRl基因的甲基化；所述引物对D具体用于检测ESRl基因CpG位点的甲基化；
上述引物对E用于检测APC基因的甲基化；所述引物对E具体用于检测APC基因 CpG位点的甲基化；上述引物对F用于检测MLHl基因的甲基化；所述引物对F具体用于检测MLHl基因CpG位点的甲基化。上述的CpG位点为CCGG ；上述各引物均独立包装。本发明的另一个目的是提供一种检测待测DNA的甲基化的PCR试剂。本发明提供的PCR试剂，为如下1)或2):1)所示的PCR试剂包括PCR试剂A1-PCR试剂Fl ；所述PCR试剂Al由所述引物对A、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶组成；所述PCR试剂Bl由所述引物对B、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶组成；所述PCR试剂Cl由所述引物对C、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶组成；所述PCR试剂Dl由所述引物对D、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶组成；所述PCR试剂El由所述引物对E、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶组成；所述PCR试剂Fl由所述引物对F、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶组成；2)所示的PCR试剂包括PCR试剂Al-Fl中的至少一种。1)所示的PCR试剂还包括PCR试剂A2-PCR试剂F2 ；2)所示的PCR试剂还包括PCR试剂A2-PCR试剂F2中的至少一种；所述PCR试剂A2-PCR试剂F2为将所述PCR试剂A1-PCR试剂Fl中的dNIPs替换为 dNTlV ；所述dNIPs，由荧光素标记的dATP、荧光素标记的dGTP、dATP、dCTP和dTTP组成。1)所示的PCR试剂由PCR试剂A1-F1和PCR试剂A2-F2组成；2)所示的PCR试剂由PCR试剂Al-Fl中至少一种和与其对应的PCR试剂A2-F2中至少一种组成；所述荧光素为购于中国同位素公司。每条所述引物在对应的所述PCR试剂中的终浓度均为400nM。上述弓丨物对A用于检测VIM基因的甲基化；所述引物对A具体用于检测VIM基因 CpG位点的甲基化； 上述弓丨物对B用于检测MGMT基因的甲基化；所述弓丨物对B具体用于检测MGMT基因CpG位点的甲基化；上述引物对C用于检测TMEFF2或HPPl基因的甲基化；所述引物对C具体用于检测TMEFF2或HPPl基因CpG位点的甲基化；上述引物对D用于检测ESRl基因的甲基化；所述引物对D具体用于检测ESRl基因CpG位点的甲基化；上述引物对E用于检测APC基因的甲基化；所述引物对E具体用于检测APC基因 CpG位点的甲基化；上述引物对F用于检测MLHl基因的甲基化；所述引物对F具体用于检测MLHl基因CpG位点的甲基化。上述的CpG位点为CCGG。每一种所述PCR试剂均为独立包装。
含有的所述引物或含有所述试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。上述的引物、上述的PCR试剂、上述的试剂盒在检测或辅助检测待测DNA的甲基化中的应用也是本发明保护的范围。上述的引物、上述的PCR试剂、上述的试剂盒在检测或辅助检测待测DNA的甲基化程度中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中的所述甲基化程度体现在甲基化比值。上述的引物、上述的PCR试剂、上述的试剂盒在制备检测或辅助检测癌症产品中的应用也是本发明保护的范围；所述癌症为结肠腺癌或结肠腺瘤。用于检测CCP-FRET方法的基本原理和步骤涉及到HpaII消化处理待检测DNA，如果待测DNA中发生甲基化，HpaII识别的序列被保护，那么DNA序列是完整。因此，当以处理过的DNA为模板进行PCR扩增，就能得到特异性的PCR产物。该方法所用的PCR与常规的PCR不同的是，在PCR反应过程中，掺入了荧光素标记的dNTP，使共轭聚合物和荧光素标记的产物发生明显的能量共振转移，根据化合物和荧光素之间的荧光共振能量转移信号可以确定所述待测DNA的目标CpG位点或序列的甲基化状态。本发明的实验证明，本发明提供的检测DNA甲基化的引物包含了两个或者两个以上的5’-CCGG-3’序列，因此，能够真实特异地反应该基因的甲基化状态，而且在引物的设计方面也避免了链内和链间互补问题，降低背景干扰。此外，我们通过优化引物的碱基组成和长度来控制引物Tm值使其在60°C，保证PCR产物的特异性和扩增效率，它们能高效地检测结肠腺癌和腺瘤样本的甲基化状态。以下各实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
图1为应用引物1和2进行RCR扩增VIM琼脂糖凝胶电泳2为检测VIM甲基化的能量共振转移效率图3为应用引物1和2检测样本VIM基因启动子甲基化4为应用弓丨物1和2检测VIM甲基化敏感性分析图5为应用引物3和4进行RCR扩增MGMT琼脂糖凝胶电泳6为检测MGMT甲基化的能量共振转移效率图7为应用引物3和4检测样本MGMT基因启动子甲基化8为应用弓丨物3和4检测MGMT甲基化敏感性分析图9为应用引物5和6进行RCR扩增TMEFF2/HPP1琼脂糖凝胶电泳10为检测TMEFF2/HPP1甲基化的能量共振转移效率图11为应用引物5和6检测样本TMEFF2/HPP1基因启动子甲基化12为应用弓丨物5和6检测TMEFF2/HPP1甲基化敏感性分析图13为应用引物7和8进行RCR扩增ESRl琼脂糖凝胶电泳14为检测ESRl甲基化的能量共振转移效率图15为应用引物7和8检测样本ESRl基因启动子甲基化16为应用引物7和8检测ESRl甲基化敏感性分析图17为应用引物9和10进行RCR扩增APC琼脂糖凝胶电泳18为检测APC甲基化的能量共振转移效率
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图19为应用引物9和10检测样本APC基因启动子甲基化20为应用引物9和10检测APC甲基化敏感性分析图21为应用引物11和12进行RCR扩增MLHl琼脂糖凝胶电泳22为检测hMlHl甲基化的能量共振转移效率图23为应用引物11和12检测样本MLHl基因启动子甲基化M为应用引物11和12检测MLHl甲基化敏感性分析
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中PFP的结构式如下实施例1、引物的设计1、候选基因的选择选定与结肠腺癌相关的甲基化发生频率较高的候选基因，选定VIM(NM_003380)， MGMT(XM_003483574)，TMEFF2/HPP1(NM_016192)，ESRl(NM_000125)，APC (NIMJ)Ol127511)， 和MLHl (NM_000M9)基因序列。通过http://www. ensembl. org链接，可以查找到这些基因的序列，包括所有外显子和内显子序列。扩增序列的位点分别如下表
序列号基因位置起始碱基位置NM—003380VIM第三外显子-75 +105XM_003483574MGMT第一外显子-370 -224NM—016192TMEFF2/HPP1第一外显子-385 -213NM—000125ESRl第六外显子+62 +226+NIM—001127511APC第一外显子-140 -86NM—000249MLHl第一外显子-500 -207 2、设计引物
寻找和确定上述基因中富含CpG岛序列(CpG位点CCGG)，然后以该段序列为模板，设计、合成引物。设计的引物如下表表1为结肠腺癌关键基因的启动子扩增序列和PCR产物相关信息
权利要求
1.一种检测待测DNA甲基化的引物，为如下1)或2)1)所示的引物由引物对A-引物对F组成； 所述引物对A由引物1和引物2组成； 所述引物对B由引物3和引物4组成； 所述引物对C由引物5和引物6组成； 所述引物对D由引物7和引物8组成； 所述引物对E由引物9和引物10组成； 所述引物对F由引物11和引物12组成；所述引物1-引物12的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-12 ；2)所示的引物为所述引物对A-引物对F中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于所述引物对A用于检测VIM基因的甲基化；所述引物对A具体用于检测VIM基因CpG 位点的甲基化；所述引物对B用于检测MGMT基因的甲基化；所述引物对B具体用于检测MGMT基因CpG 位点的甲基化；所述引物对C用于检测TMEFF2或HPPl基因的甲基化；所述引物对C具体用于检测 TMEFF2或HPPl基因CpG位点的甲基化；所述引物对D用于检测ESRl基因的甲基化；所述引物对D具体用于检测ESRl基因CpG 位点的甲基化；所述引物对E用于检测APC基因的甲基化；所述引物对E具体用于检测APC基因CpG 位点的甲基化；所述引物对F用于检测MLHl基因的甲基化；所述引物对F具体用于检测MLHl基因CpG 位点的甲基化。
3.一种检测待测DNA的甲基化的PCR试剂，为如下1)或2)1)所示的PCR试剂包括PCR试剂Al-PCR试剂Fl；所述PCR试剂Al由所述引物对A、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶组成； 所述PCR试剂Bl由所述引物对B、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶组成； 所述PCR试剂Cl由所述引物对C、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶组成； 所述PCR试剂Dl由所述引物对D、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶组成； 所述PCR试剂El由所述引物对E、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶组成； 所述PCR试剂Fl由所述引物对F、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶组成；2)所示的PCR试剂包括PCR试剂Al-Fl中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于1)所示的PCR试剂还包括PCR试剂A2-PCR试剂F2；2)所示的PCR试剂还包括PCR试剂A2-PCR试剂F2中的至少一种；所述PCR试剂A2-PCR试剂F2为将所述PCR试剂Al-PCR试剂Fl中的dNIPs替换为 dNTPs'；所述dNIPs，由荧光素标记的dATP、荧光素标记的dGTP、dATP、dCTP和dTTP组成。
5.根据权利要求3或4所述的试剂，其特征在于每条所述引物在对应的所述PCR试剂中的终浓度均为400nM ；所述引物对A用于检测VIM基因的甲基化；所述引物对A具体用于检测VIM基因CpG 位点的甲基化；所述引物对B用于检测MGMT基因的甲基化；所述引物对B具体用于检测MGMT基因CpG 位点的甲基化；所述引物对C用于检测TMEFF2或HPPl基因的甲基化；所述引物对C具体用于检测 TMEFF2或HPPl基因CpG位点的甲基化；所述引物对D用于检测ESRl基因的甲基化；所述引物对D具体用于检测ESRl基因CpG 位点的甲基化；所述引物对E用于检测APC基因的甲基化；所述引物对E具体用于检测APC基因CpG 位点的甲基化；所述引物对F用于检测MLHl基因的甲基化；所述引物对F具体用于检测MLHl基因CpG 位点的甲基化。
6.根据权利要求3-5中任一所述的试剂，其特征在于1)所示的PCR试剂由PCR试剂Al-Fl和PCR试剂A2-F2组成；2)所示的PCR试剂由PCR试剂Al-Fl中的至少一种及其对应的PCR试剂A2-F2中的至少一种组成。
7.含有权利要求1或2的所述引物或含有权利要求3-6中任一所述试剂的试剂盒。
8.权利要求1或2所述的引物、权利要求3-6中任一所述的PCR试剂、权利要求7所述的试剂盒在检测或辅助检测待测DNA的甲基化中的应用；或权利要求1或2所述的引物、权利要求3-6中任一所述的PCR试剂、权利要求7所述的试剂盒在检测或辅助检测待测DNA的甲基化程度中的应用；或权利要求1或2所述的引物、权利要求3-6中任一所述的PCR试剂、权利要求7所述的试剂盒在制备检测或辅助检测癌症产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述癌症为结肠腺癌或结肠腺瘤。
全文摘要
本发明公开了检测结肠腺癌相关基因启动子甲基化引物，本发明提供的检测待测DNA的甲基化引物，为如下1)1)所示的引物由引物对A-F组成；所述引物对A由引物1和引物2组成；所述引物对B由引物3和引物4组成；所述引物对C由引物5和引物6组成；所述引物对D由引物7和引物8组成；所述引物对E由引物9和引物10组成；所述引物对F由引物11和引物12组成；所述引物1-12的核苷酸序列为序列表中的序列1-12；本发明的实验证明，本发明提供的检测DNA甲基化的引物控制引物Tm值使其在60℃，保证PCR产物的特异性和扩增效率，它们能高效地检测结肠腺癌和腺瘤样本的甲基化状态。
文档编号C12Q1/68GK102373286SQ20111038343
公开日2012年3月14日 申请日期2011年11月28日 优先权日2011年11月28日
发明者吴蔚, 杨琼, 王树 申请人:中国科学院化学研究所