高敏感的内切核酸酶的生产方法、内切核酸酶的新制品及其用途的制作方法

文档序号:532752阅读:467来源:国知局
专利名称:高敏感的内切核酸酶的生产方法、内切核酸酶的新制品及其用途的制作方法
技术领域
本发明涉及鉴定和制备具有高活性和敏感性以及宽底物特异性的错配特异的内切核酸酶。
背景技术
上个世纪初,对通过辐射或化学品在DNA内部诱导突变的可能性的发现已经为理解活体内基因功能带来了相当大的希望。自那时起,诱变作用和自然序列变化已经被广泛地用于鉴定新功能、对应于特异功能的基因以及一个特异蛋白质内部的活性位点。实施这个方法的一个关键方面,特别是在点突变的情况下,是对突变检测方法的选择,这些方法被设计为对大段的DNA进行筛选而不减少诊断敏感性或特异性,并且同时能提供有关突变位点的信息。最常用的工具当中有基于不完全配对的DNA的方法,该DNA 能够通过两个DNA分子的变性和复性在试管内产生。使用如沟结合剂等化学品或能够在错配位点上特异地剪切单链DNA的分子在这些异源双链分子中检测到错配。可替代地,单链特异的内切核酸酶已经被用于在错配位点剪切DNA。目前已被描述的绝大多数内切核酸酶属于S1/P1类核酸酶。例如SI、Pl和绿豆核酸酶等核酸酶,属于被命名为“S1/P1族核酸酶”或为“S1 族核酸酶”的同一族,已知能用于在单链区域切开DNA。但是这些核酸酶所具有的酸性pH 最佳值是在4. 0-5. O的范围内。这对于错配检测是不利的,因为低pH值有利于DNA脱嘌呤并且使得DNA双链体不稳定,导致非特异的DNA降解,并且降低检测的敏感性和特异性。几年前,0LEYK0WSKI等人(Nucleic Acids Res,26,4597-4602,1998)从不同的植物提取物中检测到一个错配内切核酸酶的活性,其具有中性的pH最佳值(大约pH 8)并在错配位点的3’端完成一个单链切开。这些作者报道了该错配内切核酸酶的活性与苜蓿芽、 芦笑、疗菜和西红柿的提取物中的甘露糖基糖蛋白(mannosyl glycoproteins)有关。疗菜中的酶,称之为CEL I,是通过连续的硫酸铵沉淀步骤从芹菜茎中提纯,结合到一个刀豆体球蛋白A-琼脂糖柱并且被[a ]-d+-甘露糖洗提,结合到一个磷酸纤维素柱并且被线性梯度的KCl洗提,并且用尺寸排阻色谱法分级分离。因此获得的CEL I制品包含几个34-39KDa 的蛋白带。YANG 等人(Biochemistry,39,3533-3541,2000)和 PCT 申请 WO 01/62974 描述了一种改进的CEL I提纯,它是通过在提纯缓冲液中使用α-甲基甘露糖苷来克服CEL I与内源性选择素的聚集反应。这些文件还披露了 CEL I cDNA的克隆。以序列数据为基础,CEL I 被指定为S1/P1族核酸酶的一个亚族,并且鉴定出几个用拟南芥(Arabidopsis thaliana)的 BFNl (GenBank 核苷酸(nucleotide)AY040016)、百日草属植物的 ZENl (GenBank 核苷酸 AB003131)和萱草的DSA6 (GenBank核苷酸AF082031)的基因进行编码的可能的同系物。CEL I内切核酸酶活性已经显示出对于碱基替换的错配以及由于插入/缺失情况引起的错配是高度特异的,并且独立于侧翼序列环境。因此它在包括突变筛选等不同的方法中作为突变检测试剂是很有用的。CEL I错配检测系统是一个简单的测定法,它需要靶序列的聚合酶链反应扩增(PCR扩增)、变性和退火,以允许在野生型和突变体等位基因之间生成异源双链体,酶的错配剪切,以及通过凝胶电泳法的产品分析。因为它在对大段DNA中的错配进行检测时的特异性和敏感性,它比其他流行的错配检测系统有利,比如变性HPLC。通过实施例,0LEYK0WSKI等人和YANG等人(上面引用的出版物)报道将其用于检测人类与家族性乳腺癌有关的基因(BRCA1基因)的序列改变,并且S0KURENK0等人(Nucl. Acids Res.,29,elll,2001)披露了将其用于检测大范围基因组DNA的突变和多态性。CEL I也在TILLING(基因组中祀向诱导的局部损害(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes))的高产率筛选中得到使用,其中化学诱变之后对基因点突变进行筛选,或将其用于检测自然群体中的多态现象,也被称作“Ecotilling” ( COMAI等人,Plant Journal, 37,778-786,2004)。它已经被用在植物(COLBERT 等人,Plant Physiology 126,480-484, 2001 ;TILL 等人,Genome Research 13,524-530,2003 ;PERRY 等人,Plant Physiology 131,866-871,2003)和动物中,例如斑马鱼(WIENH0LDS 等人,Genome Res. , 13, 2700-2707, 2003)。PCT申请WO 03/066809提出在相关聚核苷酸之中重新配置序列变化的一种方法中使用CEL I,该方法称作“通过解决错配的基因重排列”("Genetic Reassortment by Mismatch Resolution" (GRAMMR))。但是CEL I的缺点是所具有的剪切效率由一个错配到另一个错配而变化在具有单一核苷酸插入的DNA环的情况下,0LEYK0WSKI等人(Nucleic Acids Res. 1998 0ctl5 ; 26(20) :4597-602)报道了 CEL I底物优选特性为G > A > C > T ;在碱基替换的错配情况下,CEL I底物优选特性为C/C彡C/A C/T彡G/G > A/C A/A T/C > T/G G/T G/A A/G > T/T。它的功效在错配C/A,C/C,C/T,G/G是很明显的。在其他的错配上观察到活性降低,它对于错配T/T几乎无效。当需要在一个DNA库中对某一等位基因进行检测时,这种剪切功效上的变化可能会导致在检测某些突变时的较低正确率。限制CEL I应用的另一个不便之处是可用的提纯法的低产率。OLEYKOffSKI等人从含有大约350克蛋白质的7千克芹菜茎开始获得了 3ml的0. I μ g/ μ I的CEL I ;由YANG等人和PCT WO 01/62974中披露的提纯过程得到5 μ g纯化的CEL I,特异活性为3. IxlO7CEL I单位/毫克蛋白质,从105千克芹菜茎开始。为了获得更大量的CEL I,已经提出它可以通过重组DNA技术来生产。PCT申请 W003/066809提出了一个可能合适的载体和宿主细胞的很大的清单,包括几乎任何已知的原核或真核生物表达系统;但是,这个文件中实际披露的唯一表达系统是基于烟草花叶病毒组的载体。通过在所述载体中将融合到一个编码为6-组氨酸标签的该CEL I的cDNA进行克隆的构造已经被用于感染烟草植物。重组CEL I从被感染植物的细胞内液中回收,在镍-NTA树脂上通过金属亲和层析法提纯。PCT WO 03/066809对于提纯的酶的产率没有叙述。它表明其在GRAMMR反应中的活性与芹菜中提纯的某一个天然酶近似。这个系统的一个不便之处是病毒倾向于重组,部分或全部失去该表达基因。这带来除了完整长度的CEL I之外还会产生截短的形式,降低了该酶的特异活性。PCT申请W02004/035771涉及一种在酵母中生产CEL I的方法。对于这个作用, 对CELI编码的一个合成基因是按照酵母中密码子的使用通过修饰CEL I的天然DNA序列而构成。这个文件表明由该合成基因生产的重组CEL I能够识别所有可能的错配组和,并且用例证说明了错配A/A的识别和剪切。另一方面,它对所述重组CEL I的错配优选特性没有叙述。从上面看来目前可用的生产重组CEL I的各种方法并没有提供与从芹菜生产天然 CEL I相比较的任何重大的改进。另外他们没有提及天然CEL I底物优选特性的问题。并且,希望能有像CEL I的其他内切核酸酶能够在中性pH下剪切异源双链DNA模板的单碱基对错配,但是它们具有不同的错配优选特性,或优选地,能对所有错配进行同样良好的剪切。但是,直到现在尚未鉴定出这样的内切核酸酶。像CEl I的内切核酸酶活性的存在已经在许多植物中被报道(Cf.例如上面引用的0LEYK0WSKI等人,1998)。但是带来这些活性的酶还没有进行特征标记,它们的生化特性例如底物优选特性还没有被研究,并且它们的序列还没有被鉴定。另一方面,CEL I的结构同系物已经在计算机娃片上(in silico)被确认(上面引用的YANG等人,TILL等人Nucleic Acids Res.,32,2632—41,2004)。它们中的三个(拟南芥的BFN1,百日草属的 ZENl和萱草的DSA6)已经有报道涉及植物枯萎(PEREZ-AMAD0R等人,Plant Physiol. 122, 169-180 2000)。但是,它们没有被提纯,保持生化上未进行特征标记特别是试管内识别异源双链DNA错配的效率还没有被试验。已经从菠菜中提纯出被称作SP的一种内切核酸酶, 基于其活性它已经被归属为S1/P1族,并且它具有中性的pH最佳值。像CEL I,该酶剪切插入/缺失和碱基替换的错配;但是它不识别那些包含鸟嘌呤残基的错配(0LEYK0WSKI等人,Biochemistry,38,2200-5,1999)。在寻找获得重组CEL I的替代方法的过程中,诸位发明人已经尝试了通过土壤杆菌属介导的瞬时表达在植物中(in planta)对其进行表达。他们已经在农杆菌浸润的(agroinfiltrated)烟叶上表达了重组CEL I,并且用硫酸铵沉淀法从叶子提取物中将其提纯。他们已经惊讶地发现,他们获得了具有高活性的重组CEL I的非常高的产率,另外,比之现有技术中已知的CEL I的制品,该重组CEL I制品以更宽的特异性和更高的敏感性来识别错配,即使对例如T/T这样的错配也允许清楚地检测,而它们被认为用CEL I是很难识别的。

发明内容
鉴于这些结果,诸位发明人已经想到使用该方法通过在试管内测试它们的活性来筛选在计算机芯片上被鉴别为属于S1/P1族的各个内切核酸酶。因此本发明提供了从少量的起始材料获得大量内切核酸酶,特别是S1/P1核酸酶的一种简单快速的方法,并且还提供了一种在试管内评价候选内切核酸酶活性的方法,特别是为了鉴定错配特异的内切核酸酶。一个错配特异的内切核酸酶在此处定义为一种能够特定地剪切所有碱基替代的错配(即 A/A,G/G,C/C,T/T,A/G,A/C,G/T,C/T,G/A,C/A,T/C,T/G)以及一个或多个核苷酸的插入/缺失的内切核酸酶。
因此本发明的一个目的就是提供生产重组内切核酸酶的一种方法,其中所述方法包括-在宿主植物细胞中表达所述重组内切核酸酶,由包含表达载体的土壤杆菌属菌株瞬时转化,该表达载体包括对所述内切核酸酶进行编码的聚核苷酸;-从所述宿主植物细胞中分离出所述重组内切核酸酶。所述植物细胞可以是细胞悬液或者组织或器官培养的一部分。在这种情况下,该酶能够从上清液和/或从培养的细胞或组织或器官中收集。优选地,它们是整个植物或由此分离的器官的一部分;在这种情况下,以土壤杆菌属菌株的瞬时转化将通过农杆菌浸润 (agroinfiltration)来实现。农杆菌浸润是基于将包含有关基因的农杆菌送入完整的植物组织中的一种瞬时表达方法。—个包括有关基因的DNA结构被克隆成为一个二兀载体并且被转移进一个选定的土壤杆菌属菌株,并且该经转化的农杆菌生长至对数生长期或者饱和并且用与常规土壤杆菌属介导的转化相同的方法进行收集。经典地,农杆菌浸润是通过将被转化的土壤杆菌属细胞的悬浮液或者用没有针头的注射器注射进选定植物的一个器官(通常是叶子),或者通过几分钟的真空浸润。将该真空释放后,该器官或整个植物被放在一个生长室内。该有关的表达蛋白质从浸润的器官提取,一般在浸润后一至四天。各个农杆菌浸润方案在不同的发表物上有披露,例如 KAPILA 等人,(Plant Sci. 122,101-108,1997) ;BENDAHMANE 等人, (Plant Cell, 11,781-792,1999) ;SCOFIELD 等人,(Science.,274,2063-5,1996) JANG 等人,(Science.,274,2060-3,1996) ;MARILL0NNET 等人,(Proc Natl Acad Sci U S A, 101, 6852-7,2004) ;WROBLEffSKI 等人,(Plant Biotech. J.,3,pp. 259-273,2005)。用于土壤杆菌属介导的瞬时表达的、特别是用于农杆菌浸润的经典方案能够用在本发明的实践中。具有二元载体的土壤杆菌属菌株以及控制有关基因表达的调控元素有很大的选择范围,一位本领域有技能的人士可以在它们中间选择更适合的、例如按照计划使用的宿主植物。在以下实施例中披露的实验中,诸位发明人使用了一个pBIN19-衍生的二元载体,PBIN61,和潜伏了高毒性pCH32质粒的土壤杆菌属菌株C58C1,并且cDNA或基因组编码序列已经在CaMV 35S启动子下进行了表达。但是,其他二元载体、其他土壤杆菌属菌株和其他构成或可诱导启动子能够被用于到达同样的结果。有利的是,农杆菌浸润将在叶子中进行,它能够任选地在浸润之前或之后立即从所述植物分离。能够在本发明的方法中使用的宿主植物包括与土壤杆菌属转化相容的任何植物。 优选的植物特别包括烟草属的那些植物,尤其是本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana) 和普通烟草(Nicotiana tabacum)。根据本发明的一个优选的实施方案,通过包含下列步骤的方法从农杆菌浸润的植物器官,特别是从农杆菌浸润的叶子中分离出所述内切核酸酶-从表达所述内切核酸酶的农杆菌浸润的器官提取细胞内含物;-将终浓度为30%或以上的硫酸铵加入到所述提取物中,并从上清液中分离蛋白质沉淀物;
-将终浓度为80%或以上的硫酸铵加入到所述上清液中,并回收含内切核酸酶的蛋白质沉淀物。所述蛋白质沉淀物在一个合适的缓冲液中被再次悬浮,例如是一个包含Tris HCl (pH 8)、PMSF和10%甘油的缓冲液。它可以直接使用,或者在_80°C下保存至使用。可替代地,上面表明的该第一个步骤之后所获得的全部提取物可以如此使用,而不用进行多个硫酸铵沉淀的步骤。可任选地,本发明的方法生产的内切核酸酶能够用本身已知的任何适当方法进一步提纯,例如柱亲和提纯法,其中用一个标签将CEL I标记为在柱中对某一特殊成分具有亲和力。按照一个优选的实施方案,本发明的CEL I被标以6-组氨酸标签,用在镍-NTA上的金属亲和层析法提纯。本发明还提供了一种方法,用于测试候选内切核酸酶是否为错配特异的内切核酸酶,其中所述方法包括a)用如上定义的本发明的方法以重组方式生产所述候选内切核酸酶;b)对所述重组内切核酸酶的降解单链DNA的能力进行测试;c)对所述重组内切核酸酶在一个预定的错配位点剪切试验异源双链DNA片段的能力进行测试;d)对所述重组内切核酸酶剪切携带所有类型错配(即碱基替代错配A/A,G/G, C/C,T/T,A/G,A/C,G/T,C/T,G/A,C/A,T/C,T/G,以及插入或缺失错配)的异源双链DNA片段的能力进行测试。如果内切核酸酶通过了步骤b)、c)和d)的测试(即如果它能够降解单链DNA, 能够在预定的错配位点剪切试验异源双链DNA片断,并且能够剪切携带所有类型错配的异源双链DNA片断),它就被认为是错配特异的内切核酸酶。本发明还提供了一种筛选错配特异的内切核酸酶的方法,其中所述方法包括a)用如上定义的本发明的方法以重组方式生产所述候选内切核酸酶;b)对所述重组内切核酸酶降解单链DNA的能力进行测试;c)对该重组内切核酸酶能够降解单链DNA进行测试,并且对它们在已知并且有良好特征标记的错配位点剪切试验异源双链DNA片段的能力进行测试;d)选择能够在已知并且有良好特征标记的错配位点剪切试验异源双链DNA片段的重组内切核酸酶,并对它们剪切携带所有类型错配的异源双链DNA片断的能力进行测试;e)选择通过步骤b)、c)和d)测试的重组内切核酸酶。按照上面定义的方法的一个优选的实施方案,它们还包含一个步骤,它包括在过量的野生型等位基因的存在下测试在DNA库中检测突变体等位基因的能力来对所述内切核酸酶测试它们的敏感性,并且选择在至少9倍过量(即10个一群中有一个突变体等位基因)的野生型等位基因存在下能够检测出所述突变体等位基因的内切核酸酶,优选至少 14倍过量存在,还更加优选至少19倍过量存在,并且按照增加的优选特性的顺序,29倍过量、39倍过量、49倍过量、59倍过量的野生型等位基因。优选地,以上定义的试验是在具有pH值7至8,更有利7. 4至7. 8,并含有5至 20mM,更有利IOmM的MgCl2的反应混合物中进行。有利的是,所述反应混合物还包括O. 5mM至2禮,优选ImM的DTT。诸位发明人还已经观察到在2%至10% (w/v),特别是5%的最终反应混合物中添加PEG-8000,增加了该内切核酸酶的总体活性。能够用本发明的方法试验的候选内切核酸酶能够在该S1/P1族之中找到。在PFAM 数据库中(BATEMAN 等人,Nucleic Acids Res. 32,D138-41,2004),该族被指定为 PFAM 02265。例如可以使用从PFAM 02265建立的HMM分布(隐含马尔代夫模型(Hidden Markov Models))作为探针来筛选可用的DNA序列数据库,使用HMMER软件在不同的植物中识别候选内切核酸酶。可替代地,InterPro IPR003154代码(对应于S1/P1核酸酶)能被用于筛选数据库内容,例如使用下列地址http://www. ebi. ac. uk/interpro/ISpy ipr = IPR003154用此代码筛选Trembl/Swissprot数据库识别出了 43个蛋白质(表I)。表I :用IPR003154代码筛选Trembl/Swissprot数据库的结果
权利要求
1.一种重组体BFNl内切核酸酶制品,其中所述重组体BFNl具有以下错配优选特性 G/G G/A A/G G/T T/G > T/T A/A C/C T/C > C/T A/C C/A,并且能够在59倍过量野生型等位基因存在下识别突变体等位基因。
2.一种如权利要求I所述重组体内切核酸酶制品的用途,用于检测在DNA双链体内由碱基替代引起的错配,或者在所述双链体中的一个链内插入或缺失一个或多个核苷酸引起的错配。
3.—种如权利要求I所述的重组体内切核酸酶制品在基因组中靶向诱导的局部损害 (Targeting-Induced Local Lesions IN Genomes, TILLING)错配剪切方案中的用途。
4.一种如权利要求I所述重组体内切核酸酶制品的用途,用于通过Ecotilling鉴别自然群体中DNA的多态性。
5.一种如权利要求I所述重组体内切核酸酶制品作为错配检测试剂的用途。
6.一种如权利要求I所述重组体内切核酸酶制品在错配筛选方法中的用途。
7.—种如权利要求I所述重组体内切核酸酶制品的用途,用于在任何有机体种群或由此衍生的细胞系中的靶基因中同时筛选一个或多个突变,其通过下列步骤进行a)对所述种群中每一个体的所述靶基因或其部分进行扩增,b)将所述扩增产品在2维或3维矩阵中进行排序,包括行、列(2维矩阵)和柱(3维矩阵),c)将所述扩增产品集中,以此获得不同的库,每一个库代表所述矩阵的一列、一行或一柱,d)向每一个库添加从非突变基因获得的参照扩增产品,并在允许形成异源双链的环境下对这些库进行培养,以及e)用所述内切核酸酶制品对每一个库进行培养,以及f)在所述培养的库中检测异源双链的存在。
8.—种如权利要求I所述重组体内切核酸酶制品的用途,用于在任何有机体种群中或由其衍生的细胞系中对一个靶基因中的一个或多个突变同时进行筛选,其中进行以下步骤a)在包括行、列(2维矩阵)和柱(3维矩阵)的2维或3维矩阵中对所述种群的每一个体进行排序,b)将每一列、行和柱集中以此获得不同的库,从而使每一个库代表所述矩阵的一列、一行或一柱,c)向每一个库中添加从非突变基因获得的参照基因产品,d)在每一个库内对所述靶基因或其部分进行扩增,以此获得扩增产品的库,e)在允许形成异源双链的环境下对所述扩增产品的库进行培养,f)用所述内切核酸酶制品对所述扩增产品的库进行培养,以及g)在所述培养的库中检测异源双链的存在。
全文摘要
本发明涉及生产具有高敏感性的重组体内切核酸酶的方法,并且涉及用所述方法获得的内切核酸酶制品,以及其用途,特别是用于检测错配。
文档编号C12Q1/68GK102604914SQ20111039317
公开日2012年7月25日 申请日期2005年7月29日 优先权日2004年7月30日
发明者卡利内·特里凯斯, 米歇尔·卡博什, 贝内迪克特·斯图勒保耶斯, 阿卜杜勒菲德·本达马内 申请人:法国国家农业科学研究院, 法国植物基因组研究计划-华莱
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