专利名称：蓝色刺孢霉菌株的发酵方法
蓝色刺孢霉菌株的发酵方法
技术领域：
本发明涉及诱变选育的蓝色刺孢霉发酵方法，属于生物工程和酶制剂制备技术领域。
背景技术：
凝乳酶是奶酪生产中最关键性酶，自从被发现以来一直被广泛应用于奶酪制造工业。奶酪因其丰富的营养价值和美味的口感而受到世界人们的广泛喜爱，全球每年大约需要宰杀5000万头小牛来满足凝乳酶的市场需求。近年来随着人们生活水平的提高，奶酪的需求量不断增大，小牛皱胃酶供应短缺。因此，科学家们千方百计地寻找小牛皱胃酶的代用品O蓝色刺孢霉是我们从红曲米中分离纯化出的一株产凝乳酶的菌株。但是这株菌产的凝乳酶活力不高，我们以蓝色刺孢霉为出发菌株，应用紫外线和硫酸二乙酯复合因子诱变出发菌株。诱变选育的优良菌种DUlO (微生物保藏号是=CGMCC 5423)，以葡萄糖马铃薯培养基为发酵培养基，发酵液凝乳酶酶活在110SU/mL左右波动,但所产酶活仍不够理想。因而要对培养基进行了优化，通过优化选出了最优培养基，仍需对DUlO的发酵工艺参数进一步加深，来提高发酵液凝乳酶活性。发酵工艺参数的改进则需联系到培养温度、摇床转速、培养时间和三角瓶装液量等。
发明内容本发明的 目的是提供一种诱变选育后蓝色刺孢霉优良菌株发酵条件优化的方法，提高蓝色刺孢霉凝乳酶活力。主要工艺路线利用诱变后的蓝色刺孢霉优良菌株DUlO(微生物保减号是=CGMCC 5423)，通过改变发酵条件控制其代谢，生产出凝乳酶活力较高的发酵液。本技术方案如下I)无菌操作注入IOmL无菌水到保存的DUlO PDA斜面中，洗下斜面上的孢子，然后振荡使孢子分散，G3玻璃漏斗过滤，血球板计数并调整孢子浓度为IO7 IO8个/mL。2)接种由斜面制备的IO7 IO8个/mL孢子悬浮液，分别变换培养时间、装液量、接种量、培养温度、转速、发酵时间，进行单因素实验，考察每个培养条件对发酵产酶品质的影响。测定发酵液的凝乳酶酶活(MCA)和蛋白水解活性(PA)，发酵液凝乳酶活越高，MCA/PA比值越大，则发酵所产凝乳酶越好。3)最优发酵产酶条件的验证发酵罐验证根据实验选择的最优发酵条件，配制4L发酵培养基装入IOL发酵罐，最优发酵条件培养后测发酵液凝乳酶酶活。上述步骤2)中发酵培养基的优选配方如下，均为百分含量葡萄糖3. 3 3. 8 %，蛋白胨 O. 38 O. 42 %，酵母膏 O. 58 O. 62 %，CaCl2O. 05%, MnSO4 O. 25%，吐温-800. 1%，蒸馏水补足 IOOOmL, pH 自然，121°C灭菌 20min。
上述试剂和培养基配方，如无特别说明，均为本领域常规试剂和培养基。上述步骤2)中凝乳酶活力的测定方法为用O. 01mol/L的CaCl2配制100g/L的脱脂乳，放置40min使所形成的牛乳体系趋于稳定，然后取5mL脱脂乳于试管中36°C保温5min。发酵液5000r/min离心IOmin使菌丝沉淀,取其上清液O. 5mL加入保温的脱脂乳中，漩涡混合器上迅速混合均匀并开始计时，当试管壁上有凝结小块，准确记录发酵上清液使牛乳凝固的时间。定义40min凝固100g/L的脱脂乳ImL所需的凝乳酶量为一个索氏单位(Soxhelt unit, SU)。凝乳酶活公式为
权利要求
1.诱变选育后蓝色刺孢霉优良菌株发酵的方法，步骤如下 1)无菌操作注入无菌水到保存的DU10PDA斜面中，洗下斜面上的孢子，然后振荡使孢子分散，玻璃漏斗过滤，血球板计数并调整孢子浓度为IO7 IO8个/mL，其中所述的DUlO为蓝色刺孢霉优良菌株，其微生物保藏号是CGMCC 5423 ； 2)在含有培养基的三角瓶中接种由斜面制备的IO7 IO8个/mL孢子悬浮液，装液量为55 60mL，接种量为1. O 1. 3%，培养温度为27 30°C，转速为170 180r/min，培养时间为108 120h ； 所述的培养基由以下原料制成葡萄糖3. 3 3. 8%，蛋白胨O. 38 O. 42%，酵母膏O.58 O. 62 %，CaCl2 O. 03-0. 07 %，MnSO4 O. 15-0. 35 %，吐温-80 O. 05-0. 2 %，蒸馏水补足IOOOmL, pH自然，灭菌。
2.根据权利要求1所述的诱变选育后蓝色刺孢霉优良菌株发酵的方法，其特征在于包括发酵液的凝乳酶酶活和蛋白水解活性的测定步骤。
3.权利要求1所述的方法得到的发酵液在制备干酪中的应用。
全文摘要
本发明涉及诱变选育后蓝色刺孢霉优良菌株的发酵方法，属于生物工程和酶制剂制备技术领域，通过单因素实验改变发酵工艺参数中的培养温度、摇床转速、培养时间、接种量和装液量等因素，最终确定最优发酵条件。验证实验得到发酵液凝乳酶酶活可达610.52SU/mL，比初始酶活310.36SU/mL提高了96.71％。
文档编号C12Q1/37GK103045571SQ201110397690
公开日2013年4月17日 申请日期2011年12月5日 优先权日2011年12月5日
发明者王成忠, 赵晓红, 孙秋燕 申请人:山东轻工业学院