专利名称：一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤的细胞免疫治疗，特别涉及一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备。
背景技术：
肿瘤发病率逐年上升，传统的手术、放疗、化疗三大模式中，化疗是唯一的全身治疗手段，但化疗的有效率低(25-30%)、副反应大、耐药性、只对分裂期细胞有效、严重的免疫抑制、对肿瘤干细胞无效六大缺陷，严重限制了临床应用。“细胞免疫治疗”作为一种全新的全身治疗新技术应用于临床，并获得了有效率高、副反应小的良好效果，被越来越多的肿瘤病患所接受，因而成为肿瘤的第四大治疗模式。目前国内外多用NK、TIL、CTL、或DC-CIK等技术进行肿瘤的细胞免疫治疗，临床疗效虽远高于化疗，但回输的效应细胞在体内存留时间短，有效率低仍是目前亟待解决的瓶颈问题。基础研究证实，肿瘤一旦形成，就会形成“肿瘤微环境”，产生大量的免疫抑制因子如IL-10、TGF-i3、IL-6等，同时调节性T淋巴细胞(Treg)水平大幅升高，结果导致病人本身的免疫系统不能辨认和清除体内的肿瘤细胞，致使肿瘤无限制生长，我们称之为肿瘤的 “免疫耐受”或“免疫逃逸”。因而只要这些免疫抑制因素存在，体外制备的效应细胞回输体内后很快被抑制，体内的存留时间只有3-5天，严重影响了效应细胞对肿瘤的杀伤效应。因而，消除以上免疫抑制因素，是打破肿瘤免疫耐受、提高免疫治疗疗效的关键。细胞免疫治疗方法很多，上世纪初就出现了应用LAK细胞治疗肿瘤的技术，但由于有效率低，疗效不确切而被放弃。以后，人们逐一探讨了 NK细胞、TIL细胞、CTL细胞、 DC疫苗等临床应用的可行性，均因疗效的不确切性而未被临床认可。本世纪初，人们发现 DC-CIK细胞具有强大的肿瘤杀伤功能，并能在体内产生免疫记忆，有利于持续的免疫杀伤， 而且副反应小、安全性高，因而国内外临床已广泛推广应用至今。DC-CIK技术的方法是从肿瘤病人外周血获取单状核细胞，体外分离出DC细胞 (贴壁)和T细胞(悬浮)。贴壁的DC细胞内加入GM-CSF、CI成熟化，第5-7天收集备用。悬浮的T细胞加入INF-γ冲击，然后加入CIK细胞因子，每48小时扩增一次。第5-7天，将成熟DC和CIK细胞混合培养8-10天获得DC-CIK，移至含有2. Og白蛋白的0. 9%生理盐水中制备成DC-CIK效应细胞制剂，直接静脉输注治疗(参照专利200510112381 )。上述方法存在的问题是①效应细胞制剂肿瘤杀伤力强但特异性相对差；②直接回输后，在肿瘤微环境中IL-10、TGF-i3及Treg的免疫抑制下，效应细胞在体内的存留时间短(3-5天)，杀伤效率低；③所产生的免疫记忆也被抑制而不能发挥免疫激发功能，因而，临床疗效有限。本发明在于提供一种在干扰肿瘤微环境、打破肿瘤免疫耐受基础上，DC-CIK-CTL 高效特异性细胞免疫治疗的新技术，解决了现有DC-CIK技术存在的特异性差、体内存留时间短、杀伤效率低等瓶颈问题。本发明的方法是外周血获得单状核细胞，体外分离出DC细胞和T细胞。DC细胞经过5天的培养扩增并加入病人自体肿瘤相关全抗原至第7天成熟，获得肿瘤特异性DC疫苗备用。T细胞经过INF-γ冲击后，应用CIK细胞因子扩增至第7天，半数移瓶加入DC疫苗激活制备肿瘤特异性CTL，另外半数继续CIK扩增，至第10天收集CIK和CTL效应细胞， 混合移入含有2. Og人血白蛋白的250ml 0. 9%氯化钠中，制备成高效DC-CIK-CTL。回输前首先对病人实施微环境干扰，方法是环磷酰胺(CTX)600-1200mg静脉滴入，2次/日，次日静脉回输DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。本发明还发现，单次应用小剂量替加氟或环磷酰胺(CTX)，能够有效的降低肿瘤病人外周血调节性T淋巴细胞(Treg)的比率，同时能够降低外周血中IL-10和TGF-β的量， 但并不能有效的杀伤肿瘤细胞。因而我们假设，尽管小剂量CTX的应用不能起到治疗肿瘤的作用，但降低外周血Treg、IL-10和TGF- β含量，恰恰能够达到消除肿瘤微环境中重要的免疫抑制因素，在此基础上实施细胞免疫治疗，可以有效的延长回输的效应细胞在体内的存留时间，强化细胞免疫对肿瘤的杀伤效应，获的更高的临床疗效。基于以上发现，我们建立了本发明，即首先应用小剂量替加氟和CTX对肿瘤病人进行预处理，然后给予DC-CIK-CTL高效特异性杀伤细胞，进行细胞免疫治疗。经过实验室研究、动物实验研究及临床试验研究，获得大量研究数据，证实了该技术的有效性和安全性。目前临床应用替加氟和CTX，目的是化疗，用量分别是替加氟800-1000mg，总量 20g-40g —疗程，CTX 500-1000mg/m2,每周1次，此剂量是化疗的常规剂量，具有较大的副反应，而小剂量虽可降低副反应，但达不到化疗目的。本技术应用小剂量替加氟和CTX，目的不是化疗，而是降低外周血Treg、IL-10和 TGF- β的含量，达到干扰肿瘤微环境，打破肿瘤免疫耐受的疗效，为随后进行的细胞回输治疗创造环境，因而目的和用途是不同的。本技术应用了替加氟和CTX复合制剂，对肿瘤病人进行预处理，使外周血Treg、 IL-10和TGF-β等免疫抑制因素显著降低，在此基础上，回输的效应细胞在体内的存留时间显著延长，达到20-30天，肿瘤的杀伤效率明显提高，使临床总体疗效提高到68%。所以， 本技术是国际国内最新研究成果，也是最合理的临床治疗模式。
发明内容
本发明的主要目的在于解决目前DC-CIK方法肿瘤杀伤率低、临床有效率低的瓶颈问题，应用本技术，可以显著提高肿瘤的杀伤效率，提高临床有效率和客观疗效。为保证上述技术的实施，本发明提供了一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备方法，本发明的制备方法，包括以下步骤
步骤1，外周血采集单状核细胞； 步骤2，DC和T细胞分离； 步骤3，DC成熟和DC疫苗制备； 步骤4，CIK制备； 步骤5，CTL制备；
步骤6，特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备。其中，步骤1的外周血采集单状核细胞的方法如下应用COBE SPECTRA细胞成分分离机，按照说明书设定参数设定程序，外周血循环 6000-8000ml，采集单状核细胞120_140ml。分装入50ml离心管，日立细胞离心机1500转 /分离心5分钟。收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清(方法加入10%葡萄糖酸钙2. 5ml吹打混勻，56°C水浴35分钟，2500转/分离心5分钟，收集上清)，4°C冷藏备用。收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液(FicOll，1.077)15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpmX15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层(单状核细胞)。分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混勻，离心1500rpmX 10分钟，弃上清。加入生理盐水45ml轻柔吹打混勻，离心IOOOrpmX 5分钟洗涤，弃上清。重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数(细胞总数量6-10X109)。其中，步骤2的DC和T细胞分离的方法如下
175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化。 将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在IX IO7个/ml，加入终浓度10-20%的自体血清，37°C，5%0)2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为T细胞，剩余贴壁细胞即为DC细胞。其中，步骤3的DC成熟和DC疫苗制备的方法如下
贴壁的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml (含GM-CSF 50ug/500ml, IL-4 30ug/500ml，庆大霉素2. 0万单位/500ml)，置于37°C，5%0)2饱和湿度培养箱中扩增培养5 天。第6天加入自体肿瘤相关全抗原50ug/ml (自体肿瘤相关抗原制备方法新鲜肿瘤组织0. 5cm3，剪除肿瘤周边组织后庆大霉素-生理盐水洗涤3-5遍，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量)，次日补充10-15%的自体血清， 培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测⑶83、HLA-DR表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗(附图1-5)。其中，步骤4的CIK制备的方法如下
取175cm2培养瓶，分别加入AIM-V无血清培养基20ml (含IFN- y 50ug/500ml ；庆大霉素2万单位/500ml)，将悬浮的T细胞移入，置于37°C，5%0)2细胞培养箱中培养。次日， 补充半量的CIK培养基(该培养基为AIM-V无血清培养基500ml，含⑶3单抗25ug，庆大霉素2万单位)。第5天补充IL-2培养基(该培养基为=AIM-V无血清培养基500ml，含IL-2 15ug，庆大霉素2万单位)。以后根据培养液颜色适量补充IL-2培养基，每次补充40%以上。第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养。其中，步骤5的CTL制备的方法如下
第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，加入部分DC疫苗， 使CIK和DC比例控制为5 :1，继续培养3天获取CTL (附图6_9)。其中，步骤6的高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备的方法如下
第10天分批取DC疫苗1-2X107复苏、洗涤后、和数量分别为0.5X109的CIK和CTL 细胞混合，细胞总数量控制为1-2 X IO9,加入50ml离心管，用生理盐水洗涤3_6次去除细胞碎片，移入200ml回输用生理盐水瓶，(该生理盐水中含1%人血白蛋白2. 0g, IL-2 20万单位)，制备成高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂(细胞数量控制在1-2X109)，4°C环境输送病房备用。
通过以上方法得到的特异性DC-CIK-CTL细胞，在经过常规的制剂学处理后可以得到用于治疗的细胞制剂。因此本发明还包括，含有本发明特异性DC-CIK-CTL细胞的细胞制剂。本发明的另一个内容是，用本发明的细胞制剂治疗肿瘤病人，其方法是将本发明制备的特异性DC-CIK-CTL细胞制剂回输到肿瘤病人体内。本发明还包括制备一种干扰微环境制剂，该制剂为注射用替加氟和CTX，注射用替加氟和CTX均为小剂量，以干扰肿瘤微环境为目的，而不以抗肿瘤为目的，两种制剂的制备方法依据制剂学常规技术制备即可，如制备成水针或粉针，也可直接制备成输液剂。以上制剂的剂量范围分别为可一次性用于病人的剂量，如静脉注射用替加氟一次用量为800mg， CTX 一次用量为300-400mg/m2，制备成的制剂可直接输注，也可加入含有0. 9%氯化钠或 5%-10%的葡萄糖注射液中给病人输注，两种制剂可单独使用，也可混合使用，必要时可制备成复方药物制剂。本发明还包括一种组合试剂，其特征在于，包括制备特异性DC-CIK-CTL细胞及其制剂的全部需要使用的试剂，试剂的名称如下
DC-CIK-CTL组合试剂
1.单核巨噬细胞克隆刺激因子(GM-CSF)；
2.白细胞介素4(IL-4)；
3.庆大霉素；
4.自体肿瘤相关全抗原；
5.IFN- γ ；
6.CD3单抗；
7.白细胞介素-2(IL-2)；
8.0. 9%氯化钠；
9.人血白蛋白；
10.注射用白细胞介素-2(IL-2)； 干扰肿瘤微环境组合制剂
1.09%氯化钠；
2.注射用替加氟；
3.注射用环磷酰胺； 试剂的剂量如下
DC-CIK-CTL组合试剂的剂量和终浓度如下
1.GM-CSF :50ug/500ml ；
2.IL-4 :30ug/500ml ；
3.庆大霉素2.0万单位/500ml ；
4.自体肿瘤相关全抗原50ug/ml；
5.IFN-y :50ug/500ml ；
6.CD3 单抗:25ug/500ml ； 7.IL-2 :15ug/500ml ；
8. 0. 9% 氯化钠200ml ；9.人血白蛋白:2.Og ；
10.注射用白细胞介素-2(IL-2):20万U; 干扰肿瘤微环境组合制剂的剂量如下
1.0. 9% 氯化钠500ml ；
2.注射用替加氟800mg；
3.注射用环磷酰胺300-400mg/m2；
本发明还包括一种组合包装，其特征在于，将权利要求6中的注射用替加氟和注射用 CTX分别装入到各自的容器中，再一同装入同一包装盒中形成组合包装。本发明的细胞制剂和干扰微环境制剂的使用方法如下
细胞培养的第9天，开始应用干扰微环境制剂对病人进行前处理，方法为替加氟 IOOOmg加入5%的葡萄糖或0. 9%的生理盐水500ml静脉输注，环磷酰胺(CTX)400_600mg加入0. 9%的生理盐水20ml静脉推注或入壶，1次/日，连续2天。细胞培养第11天，细胞回输治疗，方法为采用带滤器输血袋，生理盐水IOOml静脉点滴(冲袋)，换细胞制剂200ml静脉输注，速度40-60滴/分，期间每5-10分钟轻柔摇晃输液瓶(袋)，保持细胞混悬状态。细胞输注完成后，换生理盐水IOOml静脉点滴(冲洗输液器)。细胞回输治疗每日2次，上下午分开，共6次3天完成。细胞回输当日行DC疫苗局部淋巴结注射接种，以后每周接种一次共三次。细胞回输当日起IL-2 100万U肌肉注射，2次/日，连续5天。干扰微环境制剂处理前1天和处理后4天分别采取外周血(抗凝)，流式细胞学(FCM)检测Treg (⑶4+⑶25+) 水平，ELISA法检测IL-10和TGF-β水平(附图10-12)。本发明的优点在于，通过干扰肿瘤微环境能够有效降低肿瘤病人外周血中IL-10、 TGF-β等免疫抑制因子及调节性T淋巴细胞(Treg)水平，打破肿瘤免疫耐受，在此基础上回输体外制备的高强度、特异性肿瘤杀伤细胞(DC-CIK-CTL)进行细胞免疫治疗，可以有效延长效应细胞在体内的存留时间；同时，在打破肿瘤免疫耐受基础上实施DC疫苗接种，能够有效激发体内特异性肿瘤免疫，从而实现体内、体外双途径肿瘤杀伤效应，提高细胞免疫治疗的临床疗效(附图13-15)。本技术的意义在于，提出了一种全新的细胞免疫治疗理念，即“打破肿瘤免疫耐受基础上的细胞免疫治疗”；提出了一种高效特异性肿瘤杀伤细胞(DC-CIK-CTL)的制备方法； 提出了一种在打破肿瘤“免疫耐受”基础上实施高效特异性肿瘤杀伤的新技术、新方法。本技术解决了目前肿瘤免疫治疗中效应细胞在体内存留时间短，肿瘤杀伤效率低，临床疗效低的瓶颈问题，大幅提高了细胞免疫治疗的临床疗效。现有技术的主要缺陷是①、所制备的细胞制剂虽然杀伤力较强，但特异性较差； ②、虽然DC-CIK具有产生免疫记忆，诱导持续的肿瘤杀伤的优点，但由于体内的免疫抑制因素未被清除，抵消了持续肿瘤杀伤的功能；③、由于没有打破肿瘤免疫耐受，回输的 DC-CIK细胞，只能在体内存留3-5天，因而对肿瘤的杀伤效率低；④、临床疗效主要是改善患者生存质量，延长生存期，但肿瘤的客观缓解率(肿瘤缩小或消失)不明显。本技术的主要内容是实验室制备高效率DC-CIK-CTL细胞制剂，回输治疗前，首先干扰肿瘤微环境，降低外周血Treg、L-IO及TGF-β水平，并使其低水平状态保持4_10 天，从而打破肿瘤免疫耐受，解除免疫抑制因素(Treg、L-IO及TGF-β )对回输效应细胞的免疫抑制，然后进行细胞回输治疗。优势在于①、效应细胞DC-CIK-CTL，具备强大的杀伤功能，同时具备较高的特异性，对肿瘤的杀伤效率明显增高，较DC-CIK有显著的优势；②、 同样产生免疫记忆，并能诱导持续的肿瘤杀伤，而且由于打破了肿瘤的免疫耐受，消除了免疫抑制因素，免疫记忆功能不被抵消；③、由于打破了肿瘤免疫耐受，回输的DC-CIK-CTL效应细胞在体内的存留时间显著延长，能持续存在30天以上，因而对肿瘤的杀伤效率高；④、 临床疗效显著提高，特别是对肿瘤的客观有效率显著提高。
附图1. DC疫苗制备流程示意图
附图2. DC细胞不同培养时期的镜下形态。培养的1-5天，属于未成熟DC，形态特点是类圆形，细胞表面无树突样结构平滑，缺少树突样结构。随培养时间延长，细胞表面逐渐出现树突样结构。加入抗原后培养2天，DC成熟，细胞表面呈典型的树突样突起，如电镜图所
7J\ ο附图3. DC疫苗制备成功后，DC细胞表面的重要细胞因子表达显著增高。⑶80、 ⑶83、⑶86、HLA-DR的表达，在未成熟DC (im-DC)十分低下，因而不具备抗原提呈功能；而在成熟DC (m-DC)的表达显著增高，抗原提呈功能强大。附图4.体外制备的DC疫苗，其标志性细胞因子IL-12的分泌量显著升高。附图5.携带肿瘤抗原的DC疫苗，能有效的激活自体T细胞和同种异体T细胞，且在DC:T为1 :20时，激活效率最高。附图6.携带肿瘤抗原的DC疫苗，在第一信号和第二信号的共同参与下，能够有效的激活T细胞，制备成肿瘤特异性CTL。第一信号即，DC表面的MHC分子提供抗原给T细胞表面的T细胞受体(TCR)；第二信号即，DC表面的B7分子(⑶80、⑶86)激活T细胞表面的⑶观分子。附图7. DC细胞激活T细胞的电镜示意图
附图8.体外制备的CTL，其标志性细胞因子INF-γ的分泌量显著增高。附图9.体外制备的自体肿瘤特异性CTL，对肿瘤的特异性杀伤能力显著增强。附图10.应用CTX处理后，Treg的水平显著下调至正常人水平，从而消除Treg对免疫系统的免疫抑制效应。附图11.应用CTX处理后，IL-10水平显著下调至正常人水平。附图12.应用CTX处理后，TGF-β水平显著下调至低于正常人的水平。附图13.应用CTX处理后，荧光标记的效应细胞在肿瘤组织内存留时间长达30天以上，因而肿瘤杀伤效率明显提高。附图14.动物实验表明，干扰肿瘤微环境条件下，DC诱导的肿瘤特异性CTL，对肿瘤的特异性杀伤能力显著增强。附图15.在干扰肿瘤微环境基础上，肺癌病人应用本DC疫苗联合DC-CIK-CTL过继回输治疗，一个疗程后，肿瘤缩小50%以上。
具体实施例方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1
特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备，包括以下步骤 步骤1的外周血采集单状核细胞的方法如下应用COBE SPECTRA细胞成分分离机，按照说明书设定参数设定程序，外周血循环 6000-8000ml，采集单状核细胞120_140ml。分装入50ml离心管，日立细胞离心机1500转 /分离心5分钟。收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清(方法加入10%葡萄糖酸钙2. 5ml吹打混勻，56°C水浴35分钟，2500转/分离心5分钟，收集上清)，4°C冷藏备用。收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液(FicOll，1.077)15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpmX15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层(单状核细胞)。分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混勻，离心1500rpmX 10分钟，弃上清。加入生理盐水45ml轻柔吹打混勻，离心IOOOrpmX 5分钟洗涤，弃上清。重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数(细胞总数量6-10X109)。步骤2的DC和T细胞分离的方法如下
175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化。 将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在IX IO7个/ml，加入终浓度10-20%的自体血清，37°C，5%0)2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为T细胞，剩余贴壁细胞即为DC细胞。步骤3的DC成熟和DC疫苗制备的方法如下
贴壁的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml (含GM-CSF 50ug/500ml, IL-4 30ug/500ml，庆大霉素2. 0万单位/500ml)，置于37°C，5%0)2饱和湿度培养箱中扩增培养5 天。第6天加入自体肿瘤相关全抗原50ug/ml(自体肿瘤相关全抗原制备方法新鲜肿瘤组织0. 5cm3，剪除肿瘤周边组织后庆大霉素-生理盐水洗涤3-5遍，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量)，次日补充10-15%的自体血清， 培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测⑶83、HLA-DR表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗(附图1-5)。步骤4的CIK制备的方法如下
取175cm2培养瓶，分别加入AIM-V无血清培养基20ml (含IFN- y 50ug/500ml ；庆大霉素2万单位/500ml)，将悬浮的T细胞移入，置于37°C，5%C02细胞培养箱中培养。次日，补充半量的CIK培养基(AIM-V无血清培养基500ml，含⑶3单抗25ug，庆大霉素2万单位)。 第5天补充IL-2培养基(AIM-V无血清培养基500ml，含IL-2 15ug，庆大霉素2万单位)。 以后根据培养液颜色适量补充IL-2培养基，每次补充40%以上。第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养。步骤5的CTL制备的方法如下
第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，加入部分DC疫苗， 使CIK和DC比例控制为5 :1，继续培养3天获取CTL (附图6_9)。步骤6的高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备的方法如下
第10天分批取DC疫苗1-2X107复苏、洗涤后、和数量分别为0.5X109的CIK和CTL 细胞混合，控制细胞总数量控制为1-2 X 109，加入50ml离心管，用生理盐水洗涤3_6次去除细胞碎片，移入200ml回输用生理盐水瓶，(含1%人血白蛋白2. 0g, IL-2 20万单位)，制备成高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂(细胞数量控制在1-2 X 109，4°C环境输送病房备用。实施例2
干扰微环境制剂的制备方法和用法成人按照静脉注射用替加氟lOOOmg，CTX 300-400mg/m2,计算病人用药剂量。一般采取替加氟800mg加入0. 9%的生理盐水500ml，用20ml注射器抽取CTX 400-600mg,然后抽取0. 9%的生理盐水20ml稀释，制备成干扰肿瘤微环境制剂。治疗时，首先静脉输注替加氟， 掌握速度为30-40滴/分，然后将CTX入壶或静脉推注。治疗前1天和治疗后4天，分别采取外周血anl，抗凝，FCM检测1Treg含量，ELISA检测IL-10和TGF-β含量。
实施例3
本发明还包括一种组合试剂，其特征在于，包括制备特异性DC-CIK-CTL细胞及其制剂的全部需要使用的试剂，试剂的名称如下 DC-CIK-CTL组合试剂
.11.单核巨噬细胞克隆刺激因子(GM-CSF)；
.12.白细胞介素4(IL-4)；
.13.庆大霉素；
.14.自体肿瘤相关全抗原；
.15.IFN-Y ；
.16.CD3 单抗；
.17.白细胞介素-2(IL-2)；
.18.0. 9%氯化钠；
.19.人血白蛋白；
.20.注射用白细胞介素-2(IL-2)； 试剂的剂量如下
DC-CIK-CTL组合试剂的剂量和终浓度如下
.11.GM-CSF :50ug/500ml ；
.12.IL-4 :30ug/500ml ；
.13.庆大霉素2.0万单位/500ml ；
.14.自体肿瘤相关全抗原50ug/ml；
.15.IFN-y :50ug/500ml ；
.16.CD3 单抗:25ug/500ml ； 17.IL-2 :15ug/500ml ；
.18.0. 9% 氯化钠200ml ；
.19.人血白蛋白2.Og ；
.20.注射用白细胞介素-2(IL-2):20万U; 干扰肿瘤微环境组合制剂
.4.09%氯化钠；
.5.注射用替加氟；
.6.注射用环磷酰胺；
干扰肿瘤微环境组合制剂的剂量如下
.4.0. 9% 氯化钠500ml ；
.5.注射用替加氟800mg；
.6.注射用环磷酰胺300-400mg/m2。
权利要求
1.一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤1，外周血采集单状核细胞；步骤2，DC和T细胞分离； 步骤3，DC成熟和DC疫苗制备； 步骤4，CIK制备； 步骤5，CTL制备；步骤6，特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备。
2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，其中，步骤1的外周血采集单状核细胞的方法如下应用COBE SPECTRA细胞成分分离机，循环外周血6000-8000ml，采集单状核细胞 120-140ml，分装入50ml离心管，离心机1500转/分离心5分钟，收集上层血浆移入50ml 离心管，加入10%葡萄糖酸钙2. 5ml吹打混勻，56°C水浴35分钟，2500转/分离心5分钟， 收集上清，得到自体血清，4°C冷藏备用；收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpmX 15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层，分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混勻，离心1500rpmX10分钟，弃上清，加入生理盐水45ml轻柔吹打混勻，离心IOOOrpmX 5分钟洗涤，弃上清，重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数； 其中，步骤2的DC和T细胞分离的方法如下175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化， 将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在IX IO7个/ml，加入终浓度10-20%的自体血清，37°C，5%0)2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为T细胞，剩余贴壁细胞即为DC细胞；其中，步骤3的DC成熟和DC疫苗制备的方法如下贴壁的DC细胞中加入含GM-CSF 50ug/500ml, IL-4 30ug/500ml，庆大霉素2. 0万单位/500ml的无血清DC培养基20ml，置于37°C，5%C02饱和湿度培养箱中扩增培养5天，第 6天加入自体肿瘤相关抗原50ug/ml，其中，自体肿瘤相关全抗原制备方法新鲜肿瘤组织 0. 5cm3，剪除肿瘤周边组织后庆大霉素-生理盐水洗涤3-5遍，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量；次日补充10-15%的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测⑶83、HLA-DR表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗； 其中，步骤4的CIK制备的方法如下取175cm2培养瓶若干，分别加入含IFN-Y 1000U/ml，庆大霉素2万单位/500ml的 AIM-V无血清培养基20ml，将悬浮的T细胞移入，置于37°C，5%C02细胞培养箱中培养，次日， 补充半量的CIK培养基(AIM-V无血清培养基500ml，含⑶3单抗25ug，庆大霉素2万单位)， 第5天补充IL-2培养基(AIM-V无血清培养基500ml，含IL_2 15ug，庆大霉素2万单位)，以后根据培养液颜色，每次补充40 %以上的IL-2培养基，第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK 细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养； 其中，步骤5的CTL制备的方法如下第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制为5 :1，继续培养3天获取CTL ；其中，步骤6的高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备方法如下 第10天分批取DC疫苗1-2X107复苏、洗涤后、和数量分别为0.5X109的CIK和CTL 细胞混合，细胞总数量控制为1-2 X IO9,加入50ml离心管，用生理盐水洗涤3_6次去除细胞碎片，移入200ml回输用含1%人血白蛋白2.0g，IL-2 20万单位的生理盐水瓶，制备成高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂，4°C环境保存。
3.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1，外周血采集单状核细胞；步骤2，DC和T细胞分离；步骤3，DC成熟和DC疫苗制备；步骤4，CIK制备；步骤5，CTL制备；步骤6，特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备； 其中，步骤1的外周血采集单状核细胞的方法如下应用COBE SPECTRA细胞成分分离机，循环外周血6000-8000ml，采集单状核细胞 120-140ml，分装入50ml离心管，离心机1500转/分离心5分钟，收集上层血浆移入50ml 离心管，加入10%葡萄糖酸钙2. 5ml吹打混勻，56°C水浴35分钟，2500转/分离心5分钟， 收集上清，得到自体血清，4°C冷藏备用；收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpmX 15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层，分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混勻，离心1500rpmX10分钟，弃上清，加入生理盐水45ml轻柔吹打混勻，离心IOOOrpmX 5分钟洗涤，弃上清，重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数； 其中，步骤2的DC和T细胞分离的方法如下175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化， 将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在IX IO7个/ml，加入终浓度10-20%的自体血清，37°C，5%0)2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为T细胞，剩余贴壁细胞即为DC细胞；其中，步骤3的DC成熟和DC疫苗制备的方法如下贴壁的DC细胞中加入含GM-CSF 50ug/500ml, IL-4 30ug/500ml，庆大霉素2. 0万单位/500ml的无血清DC培养基20ml，置于37°C，5%C02饱和湿度培养箱中扩增培养5天，第 6天加入自体肿瘤相关全抗原50ug/ml，其中，自体肿瘤相关抗原制备方法新鲜肿瘤组织 0. 5cm3，剪除肿瘤周边组织后庆大霉素-生理盐水洗涤3-5遍，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量；次日补充10-15%的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测⑶83、HLA-DR表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗； 其中，步骤4的CIK制备的方法如下取175cm2培养瓶，分别加入含IFN- y 50ug/500ml，庆大霉素2万单位/500ml的AIM-V 无血清培养基20ml，将悬浮的T细胞移入，置于37°C，5%C02细胞培养箱中培养，次日，补充半量的CIK培养基(500ml AIM-V无血清培养基中含⑶3单抗25ug，庆大霉素2万单位)，第.5天补充IL-2培养基(AIM-V无血清培养基500ml，含IL_2 15ug，庆大霉素2万单位)，以后根据培养液颜色，每次补充40%以上的IL-2培养基，第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养；其中，步骤5的CTL制备的方法如下第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，加入部分DC疫苗， 使CIK和DC比例控制为5 :1，继续培养3天获取CTL ；其中，步骤6的高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备的方法如下第10天分批取DC疫苗1-2X107复苏、洗涤后、和数量分别为0.5X109的CIK和CTL 细胞混合，控制细胞总数量控制为1-2 X 109，加入50ml离心管，用生理盐水洗涤3_6次去除细胞碎片，移入200ml回输用含1%人血白蛋白2.0g，IL-2 20万单位的生理盐水瓶，制备成高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂，4°C环境保存。
4.含有权利要求1的方法制备的特异性DC-CIK-CTL细胞。
5.含有权利要求1的方法制备的特异性DC-CIK-CTL细胞的细胞制剂。
6.一种干扰微环境制剂，该制剂为注射用替加氟和注射用CTX，其特征在于，注射用替加氟和注射用CTX均为小剂量，以干扰肿瘤微环境为目的，而不以抗肿瘤为目的；制剂的剂量范围分别为一次性用于病人的剂量，注射用替加氟一次用量为800mg，注射用CTX—次用量为 300-400mg/m2。
7.根据权利要求6的制剂，其特征在于，制备成的制剂可直接输注，也可加入含有0.9% 氯化钠或5%-10%的葡萄糖注射液中静脉输注。
8.根据权利要求6的制剂，其特征在于，注射用替加氟和注射用CTX是水针、粉针或输液剂。
9.一种组合试剂，其特征在于，包括制备特异性DC-CIK-CTL细胞及其制剂的全部需要使用的试剂。
10.一种组合包装，其特征在于，将权利要求6中的注射用替加氟和注射用CTX分别装入到各自的容器中，再一同装入同一包装盒中形成组合包装。
全文摘要
本发明涉及一种抗肿瘤的细胞免疫治疗技术，特别涉及一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备，本发明的制备方法，包括以下步骤步骤1，外周血采集单状核细胞；步骤2，DC和T细胞分离；步骤3，DC成熟和DC疫苗制备；步骤4，CIK制备；步骤5，CTL制备；步骤6，特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备。
文档编号C12N5/078GK102526716SQ20111040258
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者杰弗里·梅德因, 蔡建辉, 马云龙 申请人:蔡颖