一种鉴定山羊草属杀配子染色体2C的TRAP-SCAR₅₈₅标记及其应用的制作方法

专利名称：一种鉴定山羊草属杀配子染色体2C的TRAP-SCAR₅₈₅标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于杀配子染色体鉴定的技术领域，涉及一种鉴定山羊草属杀配子染色体 2C的标记及其应用。
背景技术：
小麦是世界上重要的粮食作物之一。在中国它是仅次于水稻的第二大农作物，小麦生产对国民经济发展有着十分重要的战略意义。由于小麦栽培品种单一化，使其遗传基础日益狭窄，抗源匮乏，极大地限制了其产量和品质的进一步改良。小麦的近缘物种中存在着大量的遗传变异，是小麦改良可以利用的有益基因资源，将这些有益基因导入小麦一直是遗传学家和育种学家经久不衰的研究课题。创制易位系是把外源有益基因导入小麦的一种有效途径。常用的创制易位系的方法有自发易位、辐射诱发、利用Wi基因、染色体错分裂与着丝点再融合、组织培养以及利用杀配子染色体等。国内外的研究都已证明，利用杀配子染色体诱导产生易位的频率要远远高于其它方法。山羊草属植物中的一些杀配子染色体，当单体附加到不同基因型普通小麦中时， 具有完全或不完全的杀配子作用，在不完全杀配子作用下，可高频诱导各种类型的染色体结构变异，变异频率可达10%以上，远远高于自发易位、辐射诱发、Wi基因等其他方法的诱导效率。这些杀配子染色体是经长期自然选择保留下来的，有的与小麦有部分同源关系，在诱导染色体结构变异中有特殊的意义。杀配子染色体不仅可诱导普通小麦染色体结构变异，而且对附加或代换到普通小麦中的外源染色体也具有同样的功能，这就为小麦的诱变育种开辟了一条新途径。杀配子染色体起源于不同的基因组(C，S或M)，就同祖性来说，现已识别出三种类型的山羊草杀配子染色体同祖群2中的杀配子染色体Ae. Iongissima (2), Ae. sharonensis、Ae. cylindrical Ae. speltoides (1)禾口 Ae. speltoides (2)；同祖群 3 中的杀配子染色体Ae. triuncialis(l)和Ae. triuncialis (2)；同祖群4中的杀配子染色体 Ae. Iongissima(1)、Ae. Iongissima(3)、Ae.sharonensis(2)禾口 Ae. sharonensis(3)。杀配子染色体效应的强度是多样的，从致死到半致死，而且也受不同小麦的遗传背景的影响，其作用特点、方式也各不相同。染色体2S1()，2Ssh，T2B-2Ssp'au,4Sl0,4Ssh,4Ssh#2, 在“中国春”小麦中引起不带这些染色体的配子完全不育，因此无法传递给下一代。3C染色体在“中国春”中发挥很强的杀配子效应，但在其它品种中却产生温和的、半致死效应，暗示在这些栽培品种中仍存在阻遏基因。染色体T2B-2SSP "，2C，3(fAT和4Mg，在中国春中诱导半致死效应的染色体断裂，而且结构重排的染色体可以被保留和分离。染色体3C和3Csat都起源于离果山羊草，但是它们的杀配子效应强度在“中国春”中却不相同；其中3C的效应是致死的，而3CSAT则是半致死的。杀配子染色体2C在普通小麦“中国春”等遗传背景下可诱导半致死效应的染色体断裂，使后代产生易位、缺失等染色体结构畸变。利用杀配子染色体2C在构建大麦染色体缺失图谱，诱导小麦-偃麦草、小麦-冰草易位等方面取得了很好的成效。在杀配子染色体2C的利用过程中，杂种后代中2C染色体的鉴定是非常重要的环节。有很多学者利用分带的方法对后代进行鉴定，但该方法非常繁琐，而且需要结合相关的细胞学技术。与之相比，利用DNA分子标记进行鉴定则是十分方便快捷的途径。靶位区域扩增多态性(TRAP)是一种新型的基于PCR的分子标记，由美国农业部北方作物科学实验室Hu与Vick于2003年提出，它借助大规模测序技术产生的许多生物的大量序列信息，利用生物信息学工具和表达序列标签(expressed sequence tag, EST)数据库信息设计引物，对目标候选基因序列区进行扩增产生多态性分子标记，该标记技术已广泛应用于动植物的研究中，主要在种质资源的鉴定评价、遗传图谱的构建、绘制基因组转录图谱、重要的性状标记、比较基因组学、亲缘关系和遗传多样性等方面取得了进展。目前，该标记已经在水稻、大麦、小麦、菜豆、向日葵、甜菜等植物中得到成功应用。

发明内容
本发明解决的问题在于提供一种鉴定山羊草属杀配子染色体2C的标记基因及其应用，为快速、准确地鉴定小麦遗传背景下的外源山羊草属杀配子染色体2C染色质或染色体奠定基础。本发明是通过以下技术方案来实现一种鉴定山羊草属杀配子染色体2C的标记基因，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3或 SEQ. ID. NO. 6 所示。一种扩增SEQ. ID. NO. 3所示的标记的引物对，其上、下游引物的核苷酸序列分别如 SEQ. ID. NO. 1、SEQ. ID. NO. 2 所示。一种扩增SEQ. ID. NO. 6所示的标记的引物对，其上、下游引物的核苷酸序列分别如 SEQ. ID. NO. 4、SEQ. ID. NO. 5 所示。SEQ. ID. NO. 6所示的序列作为SCAR标记应用于小麦遗传背景下的山羊草属杀配子染色体2C的鉴定或跟踪检测。应用于基于杀配子体系培育小麦品种的分子标记辅助育种。所述的应用是以SEQ. ID. NO. 4、SEQ. ID. NO. 5所示的上、下游引物对待测基因组进行PCR扩增，然后根据扩增产物的电泳结果，对是否含有山羊草属杀配子染色体2C进行判定。所述的PCR扩增的扩增程序为94°C预变性5min ；94°C变性30s，57°C退火30s， 72°C延伸60s，30 35个循环；72°C延伸lOmin。其判定为若扩增产物的电泳结果当中含有的目标片段，则待测基因组中含有山羊草属杀配子染色体2C ；若扩增产物的电泳结果当中没有的目标片段，则待测基因组中没有山羊草属杀配子染色体2C。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果1、本发明采用多个引物组合利用TRAP分子标记技术对“中国春”小麦、“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系、柱穗山羊草三种材料进行杀配子染色体2C的多态性的分析，筛选出与小麦染色体3B特异BAC库中的62个碱基具有95%的同源性的TRAP特异性的片段，然后再将其转换为稳定的SCAR标记；这样的SCAR标记具有了杀配子染色体2C的特异性和低背景，提高了检测的准确性，非常有利于小麦遗传背景下的杀配子染色体2C的鉴定和跟踪检测。与现有的利用分带的方法进行的鉴定相比，利用该SCAR标记进行鉴定则无疑正确率要明显提升，而且是十分方便、快捷的。2、本发明获得的SCAR标记称为SCAR585，在尾状山羊草(Ae. caudata2n = 2x, CC) 的染色体上进行了定位，结果显示该标记散布于尾状山羊草染色体的长短臂，属于染色体全身分布，这将为该标记提供更加广阔的应用前景。利用普通小麦“中国春”、“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系、柱穗山羊草、二倍体长穗偃麦草材料进行了 SCAR标记验证，在“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系、柱穗山羊草中扩增出了的片段，而在普通小麦“中国春”、二倍体长穗偃麦草中没有该产物，初步证明此标记可以用于杀配子染色体2C的检测。进一步用该对SCAR引物对“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系与“中国春”-长穗偃麦草7E 二体附加系的杂种F1代、F2代进行了分析，结果在全部F1代以及部分 F2代材料中扩增出了目的片段，进一步证明了此SCAR585标记可以用来检测小麦背景下的杀配子染色体2C，为小麦背景中杀配子染色体2C的快速跟踪检测提供了新途径。3、所用到的SCAR标记的检测，使用的PCR反应体系，不需要特殊的PCR反应仪器和特殊的反应试剂，与其它普通PCR反应要求一样；只需要在PCR扩增之后通过电泳检测， 就可以根据电泳结果有无大小相同的目的条带进行判定，操作简单方便。4、本发明提供的山羊草属杀配子染色体2C的标记，通过SCAR标记的检测，为快速鉴定小麦遗传背景下的杀配子染色体2C外源染色质或染色体奠定了良好的基础，同时也为分子标记辅助育种提供了十分方便快捷的途径。


图1为TRAP引物在三种不同材料中的扩增结果，泳道1为普通小麦“中国春”，泳道2为“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系，泳道3为柱穗山羊草；图2为核苷酸序列SEQ. ID No. 3 (称为RGA-IlR T13)，在NCBI中进行Blast搜索的结果；图3为SCAR585标记在四种不同材料中的扩增结果，泳道1为“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系，泳道2为柱穗山羊草，泳道3为“中国春”，泳道4为二倍体长穗偃麦草 (Marker :DL2000)；图4为SCAR585标记在尾状山羊草(Ae. caudata 2n = 2x, CC)染色体上的FISH定位结果。图5为SCAIi585标记在“中国春”-长穗偃麦草7E 二体附加系与“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂种后代F1I2中的扩增结果，泳道1为普通小麦-“中国春”，泳道2 为二倍体长穗偃麦草，泳道3为柱穗山羊草，泳道4 13为“中国春”-长穗偃麦草7E 二体附加系与“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交获得的F1代材料，泳道14 M为 F1代自交获得的F2代材料(Marker :DL2000)。
具体实施例方式
本发明提供一种鉴定山羊草属杀配子染色体2C的TRAP-SCAR585标记及其应用，通过TRAP-SCAR法筛选获得特异性的TRAP片段，并转换为稳定的SCAR标记，并对其扩增进行了检测。由于采用了 TRAP-SCAR法进行筛选，因此该标记也可称为TRAP-SCAIi585标记。下面结合具体的实施例对标记的制备、扩增和鉴定做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。所涉及的材料来源“中国春”小麦来源于哈尔滨师范大学分子细胞遗传与遗传育种重点实验室， 2010年4月将材料种于哈尔滨师范大学分子细胞遗传与遗传育种重点试验苗圃基地，2个月后提取DNA进行分子标记筛选试验。“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系来源于日本国家生物资源计划小麦中心 (http//www. shigen. nig. ac. jp/-wheat/komugi/top. jsp) ,2010 年 4 月将材料种于哈尔滨师范大学分子细胞遗传与遗传育种重点试验苗圃基地，2个月后提取DNA进行分子标记筛选试验。柱穗山羊草来源于日本国家生物资源计划小麦中心，2010年1月将材料种于哈尔滨师范大学分子细胞遗传与遗传育种温室，3个月后提取DNA，保存备用。二倍体长穗偃麦草来源于日本国家生物资源计划小麦中心，2010年1月将材料种于哈尔滨师范大学分子细胞遗传与遗传育种温室，3个月后提取DNA，保存备用。1、TRAP分子标记方法筛选特异性TRAP片段利用TRAP分子标记方法，在普通小麦“中国春”、“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系、柱穗山羊草中进行多态性的筛选，获得特异性片段。1. 1采用CTAB法从新鲜的不同材料幼嫩叶片中分别提取基因组DNA，并检测DNA
浓度及质量。1. 2TRAP 片段扩增 PCR 反应体系=DNA 模板 50ng, 10 X PCR buffer 2· 0 μ 1，dNTPMix (2. 5mM) 1. 5 μ 1， 任意引物(0· 3pmol)ly 1，固定引物(IOpmol) 1 μ l，rTaq polymerase (5U/μ 1) 0· 2 μ 1，灭菌超纯水补足至20 μ 1 ；具体的PCR反应程序为
权利要求
1.一种鉴定山羊草属杀配子染色体2C的标记基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3 或 SEQ. ID. NO. 6 所示。
2.一种扩增SEQ. ID. NO. 3所示的标记的引物对，其特征在于，其上、下游引物的核苷酸序列分别如 SEQ. ID. NO. 1、SEQ. ID. NO. 2 所示。
3.一种扩增SEQ. ID. NO. 6所示的标记的引物对，其特征在于，其上、下游引物的核苷酸序列分别如 SEQ. ID. NO. 4、SEQ. ID. NO. 5 所示。
4.SEQ. ID. NO. 6所示的序列作为SCAR标记应用于小麦遗传背景下的山羊草属杀配子染色体2C的鉴定或跟踪检测。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，应用于基于杀配子体系培育小麦品种的分子标记辅助育种。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的鉴定或跟踪检测是以SEQ.ID. NO. 4、 SEQ. ID. NO. 5所示的上、下游引物对待测基因组进行PCR扩增，然后根据扩增产物的电泳结果，对是否含有山羊草属杀配子染色体2C进行判定。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增的程序为94°C预变性 5min ；94°C变性 30s, 57°C退火 30s, 72°C延伸 60s, 30 35 个循环；72°C延伸 IOmin0
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，若扩增产物的电泳结果当中含有585bp的目标片段，则待测基因组中含有山羊草属杀配子染色体2C;若扩增产物的电泳结果当中没有 585bp的目标片段，则待测基因组中没有山羊草属杀配子染色体2C。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定山羊草属杀配子染色体2C的TRAP-SCAR585标记及其应用，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3或SEQ.ID.NO.6所示。通过TRAP-SCAR法筛选获得特异性的TRAP片段，并转换为稳定的SCAR标记，并对其扩增进行了检测。本发明提供的山羊草属杀配子染色体2C的标记，通过SCAR标记的检测，为快速鉴定小麦遗传背景下的杀配子染色体2C外源染色质或染色体奠定了良好的基础，同时也为分子标记辅助育种提供了十分方便快捷的途径。
文档编号C12Q1/68GK102373289SQ20111040441
公开日2012年3月14日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者刘贺亮, 姜格格, 徐国辉, 束永俊, 苏文悦, 郭长虹 申请人:哈尔滨师范大学