专利名称：一种显示刺激隐核虫微管骨架结构的直接荧光标记方法
技术领域：
本发明属于显示刺激隐核虫微管细胞骨架的方法领域，特别涉及一种显示刺激隐核虫微管骨架结构的直接荧光标记方法。
背景技术：
刺激隐核虫俗称“海水小瓜虫”，是一种寄生在海水硬骨鱼体的寄生纤毛虫。该纤毛虫体被分散排布且长短均一的纤毛，这些纤毛均由微管结构构成。刺激隐核虫生活史分为滋养体、包囊体和幼虫3个阶段。该寄生虫最早于1937年，由Sikama在日本的水族馆内发现。近年来，随着我国海水鱼人工养殖业的发展，养殖密度的增加，及养殖管理方面的失误，刺激隐核虫病在沿海省市常有发生，给养殖户和相关单位带来了极大的经济损失。长久以来，为了找到有效防治刺激隐核虫病的方法，研究者开展了大量探索。众所周知，所有真核生物细胞均具有高度发达、复杂的微管骨架系统。微管是细胞骨架中与细胞生命活动紧密联系的基本组分之一，除与维持细胞形态、承受外力、保持细胞内部结构的有序性、细胞的分裂增殖和运动等有关外，还与其致病性密切相关。因此，全面掌握刺激隐核虫生命过程中微管骨架的结构及其变化特征，可以为探明刺激隐核虫细胞结构的形成及致病机理提供基础资料，为找寻抗虫药物的作用靶点提供新的思路。目前，显示微管细胞骨架的方法包括银浸法、蛋白银法、抗α/β_微管蛋白免疫荧光法等。但上述方法步骤相对复杂，操作耗时较长，且对实验条件要求较高。因此需要一种既能与微管蛋白特异性结合，又便于操作，且高效省时的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种显示刺激隐核虫微管骨架结构的直接荧光标记方法，该方法操作简单，效率高，且环保无污染。本发明的一种显不刺激隐核虫微管骨架结构的直接突光标记方法，包括(I)将50-100μ O. 5-1.5% (V/V)多聚赖氨酸水溶液涂在洁净的载玻片上，风干，得到涂有多聚赖氨酸的载玻片；(2)吸取10-15只刺激隐核虫细胞，将其移入盛有ImL含有O. 5% (W/V)皂苷的 PHEM溶液的容器中，渗透O. 5-2min ；(3)吸除70-90%步骤(2)后的溶液，然后加入O. 5_2mL PHEM溶液浸浴3_5秒；(4)吸除70-90%步骤(3)后的溶液，得渗透后的细胞，然后将渗透后的细胞移入盛有O. 5-2mL 4% (W/V)多聚甲醛溶液的容器中，固定10-20秒；(5)吸除70-90%步骤(4)后的多聚甲醛溶液，然后加入O. 5_2mL PHEM溶液，浸浴 3-5 秒；(6)吸除70-90%步骤(5)后的溶液，得固定后的细胞，再将固定后的细胞转移至步骤(I)得到的涂有多聚赖氨酸的载玻片上；(7)吸除步骤(6)后的多余液体，然后迅速向细胞上滴加O. 05-0. 2mL O. 5% (V/V)Triton X-100 水溶液，处理 2_3min ；(8)吸除步骤(7)后的Triton X-100水溶液，然后向细胞上滴加O. 05-0. 2mL PHEM 溶液，浸浴3-5秒；(9)吸除步骤(8)后的PHEM溶液，然后向细胞上滴加O. 05-0. 2mL O. Olmol/L磷酸缓冲液PBS漂洗虫体2-3次，每次2-4min ；(10)吸除步骤(9)后的PBS溶液，随后迅速向细胞上滴加O. 01-0. 03mL含有 I μ mol/L荧光紫杉醇(FLUTAX-2)的0. 01mol/L的PBS溶液，于室温避光孵育5_15min ；(11)吸除步骤(10)后的溶液，随后向细胞上滴加O. 05-0. 2mL O. Olmol/L PBS缓冲液漂洗虫体2-3次，每次2-4min，然后吸除多余的溶液，加盖盖玻片；最后用显微镜观察并照相，其中荧光的激发波长为492nm，发射波长为520nm。步骤(I)中所述的涂有多聚赖氨酸的载玻片上的多聚赖氨酸呈直径Icm的圆形。步骤(2)所述的操作于莱卡Wild M5体视显微镜下进行。步骤⑵和⑷所述的容器为凹面皿。步骤⑵、(3)、(5)和⑶中所述的PHEM溶液为pH值为6. 9，含有60mmol/L PIPES, 25mmol/L HEPES, IOmmoI/L EGTA 和 6mmol/L MgCl2 · 6H20 的水溶液。步骤(9)、(10)和(11)中所述的磷酸缓冲液PBS为pH值为7. 4，含有136. 8mmol/ LNaCl, 2. 7mmol/L KCI, 10. lmmol/L Na2HPO4,1. 8mmol/L KH2PO4 的水溶液。步骤(10)中所述的荧光紫杉醇(FLUTAX-2)购买与分子探针公司，其产品号 P22310。步骤(11)中所述的显微镜为奥林巴斯BX51荧光显微镜，照相采用Cool SNAP-Pro 数码相机。紫杉醇(Taxol)是一类可以与β _微管特异性结合的物质，FLUTAX是紫杉醇的一种衍生物，是将荧光素与紫杉醇结合而成。FLUTAX与β -微管特异性结合后，通过荧光显微镜观察可以显示刺激隐核虫细胞的微管骨架结构。本发明中所涉及的V/V的单位均为mL/mL，所涉及的W/V的单位均为g/mL。有益效果本发明的方法操作简单，耗时少，且环保无污染。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例I(I)用微量移液器吸取100 μ L 1% (V/V)多聚赖氨酸水溶液在洁净的载玻片上涂一片直径为Icm的圆形区域，风干过夜待用；(2)于莱卡Wild M5体视显微镜下，用微吸管吸取10只状态良好的刺激隐核虫滋养体期细胞，将其移入盛有ImL含有0.5% (W/V)皂苷的PHEM缓冲液的凹面皿中，渗透 Imin ；
(3)用微吸管吸除80%左右上步皂苷溶液，随后用微量移液器向凹面皿中加入 ImLPHEM溶液浸浴5秒；(4)吸除80%左右上步PHEM溶液，随后用微吸管将渗透后的细胞移入盛有ImL 4% (W/V)多聚甲醛溶液的另一凹面皿中，固定20秒；(5)吸除80%左右上步多聚甲醛溶液，随后用微量移液器向凹面皿中加入ImL PHEM溶液，浸浴5秒；(6)吸除80%左右上步PHEM溶液，随后用微吸管将固定后的细胞转移至涂有多聚赖氨酸的载玻片上；(7)用微吸管吸除多余液体，随后迅速用微量移液器向细胞上滴加O. ImL 0.5% (V/V) Triton X-100 水溶液，处理 3min ；(8)吸除上步Triton X-100水溶液，随后用微量移液器向细胞上滴加O. ImL PHEM 溶液，浸浴5秒；(9)吸除上步PHEM溶液，随后用微量移液器向细胞上滴加O. ImL O.Olmol/L磷酸缓冲液(PBS，含有 136. 8mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCI, 10. lmmol/L Na2HPO4,1. 8mmol/ LKH2PO4, pH 7. 4)漂洗虫体3次，每次3min ；(10)吸除上步PBS溶液，随后迅速用微量移液器向细胞上滴加0.02mL含有 lymol/L荧光紫杉醇(FLUTAX-2，分子探针公司，产品号P22310)的PBS (0. 01mol/L)溶液，于室温避光孵育IOmin ；(11)吸除上步溶液，随后用微量移液器向细胞上滴加0. ImL 0. 01mol/L PBS缓冲液漂洗虫体3次，每次3min，然后吸除多余的溶液，加盖盖玻片；用奥林巴斯BX51荧光显微镜观察，Cool SNAP-Pro数码相机照相。荧光的激发波长为492nm，发射波长为520nm。实施例2(I)用微量移液器吸取50 μ L 1% (V/V)多聚赖氨酸水溶液在洁净的载玻片上涂一片直径为Icm的圆形区域，风干过夜待用；(2)于莱卡Wild M5体视显微镜下，用微吸管吸取15只状态良好的刺激隐核虫幼虫期细胞，将其移入盛有ImL含有0. 5% (W/V)皂苷的PHEM缓冲液的凹面皿中，渗透Imin ；(3)用微吸管吸除80%左右上步皂苷溶液，随后用微量移液器向凹面皿中加入 ImLPHEM溶液浸浴3秒；(4)吸除80%左右上步PHEM溶液，随后用微吸管将渗透后的细胞移入盛有ImL 4% (W/V)多聚甲醛溶液的另一凹面皿中，固定10秒；(5)吸除80%左右上步多聚甲醛溶液，随后用微量移液器向凹面皿中加入ImL PHEM溶液，浸浴3秒；(6)吸除80%左右上步PHEM溶液，随后用微吸管将固定后的细胞转移至涂有多聚赖氨酸的载玻片上；(7)用微吸管吸除多余液体，随后迅速用微量移液器向细胞上滴加0. ImL 0.5% (V/V) Triton X-100 水溶液，处理 2min ；(8)吸除上步Triton X-100水溶液，随后用微量移液器向细胞上滴加0. ImL PHEM 溶液，浸浴3秒；(9)吸除上步PHEM溶液，随后用微量移液器向细胞上滴加0. ImL O.Olmol/L磷酸缓冲液(PBS，含有 136. 8mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCI, 10. lmmol/L Na2HPO4,1. 8mmol/ LKH2PO4, pH 7. 4)漂洗虫体2次，每次3min ；(10)吸除上步PBS溶液，随后迅速用微量移液器向细胞上滴加O. 02mL含有 lymol/L荧光紫杉醇(FLUTAX-2，分子探针公司，产品号P22310)的PBS (O. Olmol/L)溶液，于室温避光孵育IOmin ；(11)吸除上步溶液，随后用微量移液器向细胞上滴加O. ImL O. Olmol/L PBS缓冲液漂洗虫体2次，每次3min，然后吸除多余的溶液，加盖盖玻片；用奥林巴斯BX51荧光显微镜观察，Cool SNAP-Pro数码相机照相。荧光的激发波长为492nm，发射波长为520nm。
权利要求
1.一种显示刺激隐核虫微管骨架结构的直接荧光标记方法，包括(1)将50-100μ O. 5-1.5% (V/V)多聚赖氨酸水溶液涂在洁净的载玻片上，风干，得到涂有多聚赖氨酸的载玻片；(2)吸取10-15只刺激隐核虫细胞，将其移入盛有ImL含有O.5% (W/V)皂苷的PHEM 溶液的容器中，渗透O. 5-2min ；(3)吸除70-90%步骤(2)后的溶液，然后加入O.5-2mL PHEM溶液浸浴3_5秒；(4)吸除70-90%步骤(3)后的溶液，得渗透后的细胞，然后将渗透后的细胞移入盛有O.5-2mL 4% (W/V)多聚甲醛溶液的容器中，固定10-20秒；(5)吸除70-90%步骤(4)后的多聚甲醛溶液，然后加入O.5-2mL PHEM溶液，浸浴3_5秒；(6)吸除70-90%步骤(5)后的溶液，得固定后的细胞，再将固定后的细胞转移至步骤(I)得到的涂有多聚赖氨酸的载玻片上；(7)吸除步骤(6)后的多余液体，然后迅速向细胞上滴加O.05-0. 2mL 0.5% (V/V) Triton X-IOO 水溶液，处理 2_3min ；(8)吸除步骤(7)后的TritonX-100水溶液，然后向细胞上滴加O. 05-0. 2mL PHEM溶液，浸浴3-5秒；(9)吸除步骤(8)后的PHEM溶液，然后向细胞上滴加O.05-0. 2mL O. Olmol/L磷酸缓冲液PBS漂洗虫体2-3次，每次2-4min ；(10)吸除步骤(9)后的PBS溶液，随后迅速向细胞上滴加O.01-0. 03mL含有I μ mo I/L 荧光紫杉醇的0. 01mol/L的PBS溶液，于室温避光孵育5_15min ；(11)吸除步骤(10)后的溶液，随后向细胞上滴加0.05-0. 2mL 0. 01mol/L PBS缓冲液漂洗虫体2-3次，每次2-4min，然后吸除多余的溶液，加盖盖玻片；最后用显微镜观察并照相，其中荧光的激发波长为492nm，发射波长为520nm。
2.根据权利要求I所述的一种显示刺激隐核虫微管骨架结构的直接荧光标记方法，其特征在于步骤(I)中所述的涂有多聚赖氨酸的载玻片上的多聚赖氨酸呈直径Icm的圆形。
3.根据权利要求I所述的一种显示刺激隐核虫微管骨架结构的直接荧光标记方法，其特征在于步骤(2)所述的操作于莱卡Wild M5体视显微镜下进行。
4.根据权利要求I所述的一种显示刺激隐核虫微管骨架结构的直接荧光标记方法，其特征在于步骤(2)和(4)所述的容器为凹面皿。
5.根据权利要求I所述的一种显不刺激隐核虫微管骨架结构的直接突光标记方法， 其特征在于步骤(2)、(3)、(5)和(8)中所述的PHEM溶液为pH值为6.9，含有60mmol/ LPIPES,25mmol/L HEPES, IOmmoI/L EGTA 和 6mmol/L MgCl2 · 6H20 的水溶液。
6.根据权利要求I所述的一种显不刺激隐核虫微管骨架结构的直接突光标记方法，其特征在于步骤(9)、(10)和(11)中所述的磷酸缓冲液PBS为pH值为7. 4，含有136. 8mmol/ L NaCl, 2. 7mmol/L KCI, 10. lmmol/L Na2HPO4,1. 8mmol/L KH2PO4 的水溶液。
7.根据权利要求I所述的一种显示刺激隐核虫微管骨架结构的直接荧光标记方法， 其特征在于步骤(11)中所述的显微镜为奥林巴斯BX51荧光显微镜，照相采用Cool SNAP-Pro数码相机。
全文摘要
本发明涉及一种显示刺激隐核虫微管骨架结构的直接荧光标记方法，包括先制备涂有多聚赖氨酸的载玻片；然后将刺激隐核虫细胞用含有皂苷的PHEM溶液渗透，加入PHEM溶液浸浴；然后将渗透后的细胞用多聚甲醛溶液固定后用PHEM溶液浸浴，再将固定后的细胞移至上述涂有多聚赖氨酸的载玻片上；吸除多余液体后向细胞上滴加Triton X-100水溶液，然后用PHEM溶液浸浴、0.01mol/L磷酸缓冲液漂洗；用含有1μmol/L荧光紫杉醇的PBS溶液于室温避光孵育后用0.01mol/L PBS缓冲液漂洗，再吸除多余的溶液，加盖盖玻片；最后用显微镜观察并照相。本发明的方法操作简单，效率高，且环保无污染。
文档编号C12Q1/02GK102608082SQ20111040748
公开日2012年7月25日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者孙鹏, 尹飞, 彭士明, 施兆鸿 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所