专利名称：一株草木樨中华根瘤菌及应用其发酵产锰过氧化物酶的方法
技术领域：
一株草木樨中华根瘤菌及应用其发酵产锰过氧化物酶的方法，具体的说是一种草木樨中华根瘤菌株，以及利用该菌株发酵生产锰过氧化物酶的方法以及在生物固氮方面的潜在应用。本发明属于微生物发酵技术领域。
背景技术：
锰过氧化物酶(MnP)最早是从黄孢原毛平革菌中分离纯化出的。它能氧化木质素等各类芳香化合物，随着人们对MnP的培养与分离纯化、结构与功能、理化性质等方面研究的深入，其具有极高工业应用潜力也得到了不断的开发，如在有机污染物的降解、染料的脱色、纸浆的生物漂白、农业废弃物的处理、褐煤的生物降解方面都有着重要应用。目前，能够产生锰过氧化物酶的基本为真菌，尤其是白腐真菌，如黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)，变色检 ^iTrametes versicolor),香燕 (Len tinus edodes )，平 (Pleuro tus pstrea tus )、虎皮香 (Panus tigrinus )、污叉丝孑L 菌(Michomi tus squalens )，虫拟錯菌(Ceriporiopsis subvermispora )，身寸脉菌(PAlebia radia ta )等。细菌来源广泛、生长快速，适应能力强，易于改造及大规模应用，同时也更容易采用固定细胞技术以利于锰过氧化物酶的应用。但是关于能够产锰过氧化物酶细菌的研究报道目前还十分的少，更没有关于草木樨中华根瘤菌在这方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有产锰过氧化物酶的草木樨中华根瘤菌菌株，以及利用该菌株液体发酵产锰过氧化物酶的方法和在生物固氮方面的应用。本发明的技术方案一株产锰过氧化物酶并具有生物固氮活性的菌株，命名为草木樨中华根瘤菌QSinorhizobiwn meliloti) J09，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为 CCTCC NO :M 2011318。用所述的草木樨中华根瘤菌CCTCC NO =M 2011318发酵产锰过氧化物酶的方法， 通过以下步骤实现
(1)斜面培养将草木樨中华根瘤菌CCTCCNO =M 2011318接种于斜面培养基上，在 33°C下培养24小时；
(2)种子培养将斜面长好的菌种接入种子培养基中，在33°C培养30小时，摇床转速 150转/分钟；
(3)液体发酵培养将培养好的种子接入发酵培养基中，接种量为体积百分比1%1%， 在32 36°C培养72、6小时，摇床转速150转/分钟；
发酵培养基组成，单位为克/升乳糖15 30，蛋白胨5 20，七水硫酸镁0. 025，硫酸锰 0. 015，以水定容至 1L, pH 7. 0 8· 0，121°C灭菌 30 min。
草木樨中华根瘤菌力meliIotiXClCCNO :M 2011318筛选、分离与鉴定详见实施例1。上述技术方案中所述的斜面培养基为(单位为g/L)氯化钠5，酵母膏5，蛋白胨 10，琼脂 20，pH 7. 0，115°C灭菌 20 分钟。上述技术方案中所述的种子培养基为(单位为g/L)氯化钠5，酵母膏5，蛋白胨 10，pH 7. 0，121°C 灭菌 30 min。锰过氧化物酶活力的测定配制50 mmol/L的乳酸-乳酸钠缓冲液(pH4. 5)，1. 6 mmol/L的硫酸锰溶液，1. 6 mmol/L的双氧水溶液，当天使用。取50 mmol/L的乳酸-乳酸钠缓冲液(pH4. 5) 3. 4 mL, 1. 6 mmol/L的硫酸锰溶液0.1 mL在37°C水浴锅中保温lOmin，加适量37°C保温IOmin酶液(发酵液8000rpm离心IOmin获得之清液)，混勻，加入1. 6 mmol/ L的双氧水溶液0.1 mL立即摇勻，开始计时，测定最初3 min内MO nm处吸光度变化。每分钟使IMfflol Mn2+转化为Mn3+所需的酶量为一个活力单位(U)。
其中 MnSO4 的 ε 24(|=8100 L/mol/cm
同时在本发明的过程中，研究发现该菌株具有较高的生物固氮活性，其固氮活性可以达到667nmol IT1 mL—1。这说明该菌株在培肥土壤，促进农作物高产方面同样具有潜在的应用价值。本发明的有益效果本发明所提供的草木樨中华根瘤菌CCTCC NO =M 2011318不仅具有产锰过氧化物酶的能力，而且还具有较高的生物固氮活性。利用该菌液体发酵产锰过氧化物酶具有生产周期短，生产成本低，易于控制生长条件等诸多优点，完全具有工业化生产的潜力。同时，高效的生物固氮活性也说明该菌株完全具有培肥土壤，促进农作物高产的能力。生物材料样品保藏一株产锰过氧化物酶并具有生物固氮活性的菌株，命名为草木樨中华根瘤菌QSinorhizobiwn meliloti) J09，已在中国典型培养物保藏中心保藏，简称CCTCC，保藏日期2011年9月18日，保藏编号为CCTCC NO =M 2011318。
具体实施例方式在下面所述的所有具体实施例中，如无特殊说明，均为本领域常用方法。实施例1
草木樨中华根瘤菌力iws meliloti) CCTCC NO :M 2011318筛选分离与鉴定一、草木樨中华根瘤菌J09 (.Sinorhizobium meliloti J09)筛选分离草木樨中华根瘤菌J09菌株是从从南通市通州区三余镇合兴村木材加工个体经营户取得的木屑中分离得到的。取1克木屑到250毫升灭菌三角瓶中，加入100毫升无菌的含无机盐的PH值为7.0的水溶液中(所含的无机盐及其浓度分别为=K2HPO4 1 g/L ；NaH2PO4 1 g/L ； (NH4)2SO4 0.5 g/L ；MgSO4 0.2 g/L ；MnSO4 0. 02 g/L)，在 33°C、150 转 / 分钟的条件下培养12小时；取上述培养液，将其稀释成10_5、10_6、ΙΟ"7倍稀释液，各浓度稀释液取100微升
4涂布在苯胺蓝平板(酵母膏5 g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，苯胺蓝(Azure B ) 0. Ig/ L)上，每个浓度三次重复，33°C培养M-36小时。产锰过氧化物酶菌株可水解培养基形成透明圈。挑选透明圈较大的单个菌落多次纯化，将纯化后的菌株接种到斜面培养基(酵母膏5 g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，琼脂 20g/L)上，33°C培养24-36小时后放于4°C冰箱保存待用。将4°C冰箱保存待用的菌株接种到发酵培养基中(葡萄糖20g/L，蛋白胨10 g/L，七水硫酸镁0.025 g/L，硫酸锰0.015 g/L, pH 7. 0)，在33°C，150转/分钟的条件下培养120小时，并检测培养过程中锰过氧化物酶活力的变化，从结果中筛选出一株产锰过氧化物酶活力最高的菌株，定名为J09。二、草木樨中华根瘤菌 J09 (.Sinorhizobium meIiIoti J09)鉴定 (1)形态特征
在LB培养基平板上培养菌体成杆状，不产生芽孢，革兰氏阴性，椭圆形，好氧。35°C培养36小时，菌落表面干燥，直径1 2毫米，可扩散生长，微黄色。(2)16SrDNA 测定
利用PCR技术扩增该菌的16S rDNA序列，其寡核苷酸引物为 5，-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，(上游引物)禾口 5，-CGGTTACC TTGTTACGACTT-3，(下游引物)。通过DNA自动测序仪(美国Applied Biosystems公司，型号ABI 3130)测定扩增的16S rDNA序列，其序列如SEQ ID NO: 1。 将测序结果与GeneBank中已知的16S rDNA序列进行同源性比较，发现与 Sinorhizobium meIiIoti strain KYA71 (登入号为 EU603721)的同源性最高，为 99%。(3)生理生化特征
根据〈〈Bergey，s manual of systematic bacteriology))(第二版，第二卷)(George Μ. Garrity, Don J. Brenner, Noel R. Krieg, James T. Staley, springer, 2004)禾口参考文献(Polyphasic taxonomy of rhizobia:emendation of the genus sinorhizobium and description of sinorhizobium meliloti comb. nov. , sinorhizobium saheli sp. nov., and sinorhizobium teranga sp. nov. . International journal of systematic bacteriology, 1994，44: 715-733)对菌株J09进行生理生化鉴定(如下表)，其生理生化特征与草木樨中华根瘤菌力meliloti)相吻合。
权利要求
1.一株产锰过氧化物酶并具有生物固氮活性的菌株，命名为草木樨中华根瘤菌 (.Sinorhizobium meliloti) J09,已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO :M 2011318。
2.用权利要求1所述的草木樨中华根瘤菌CCTCCNO =M 2011318发酵生产锰过氧化物酶的方法，其特征在于通过以下步骤实现(1)斜面培养将草木樨中华根瘤菌CCTCCNO =M 2011318接种于斜面培养基上，在 33°C下培养24小时；(2)种子培养将斜面长好的菌种接入种子培养基中，在33°C培养30小时，摇床转速 150转/分钟；(3)液体发酵培养将培养好的种子接入发酵培养基中，接种量为体积百分比1%1%， 在32 36°C培养72、6小时，摇床转速150转/分钟；发酵培养基组成，单位为g/L 乳糖15 30，蛋白胨5 20，七水硫酸镁0. 025，硫酸锰 0. 015，用水定容至 1 升，pH 7. 0 8· 0，121°C灭菌 30 min。
3.权利要求1所述的草木樨中华根瘤菌CCTCCNO =M 2011318，其特征在于具有较高的生物固氮活性，达到667nmol h—1 mL—1。
全文摘要
一株草木樨中华根瘤菌及其应用，属于微生物发酵技术领域。草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)J09，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NOM2011318。应用该菌株通过液体发酵生产锰过氧化物酶，步骤为(1)斜面培养；(2)种子培养；(3)液体发酵培养将培养好的种子接入发酵培养基中，接种量为1%~2%，在32~36℃培养96~136h，摇床转速150rpm。本发明的优点在于CCTCC NOM2011318具有产锰过氧化物酶的能力，还具有较高的生物固氮活性。利用该菌液体发酵产锰过氧化物酶具有生产周期短，生产成本低，易于控制生长条件等诸多优点，具有工业化生产的潜力。同时，高效的生物固氮活性也说明该菌株具有培肥土壤，促进农作物高产的能力。
文档编号C12N1/20GK102417890SQ201110407709
公开日2012年4月18日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者丁重阳, 张梁, 彭林, 李国辉, 杨晔, 石贵阳, 章克昌, 顾正华 申请人:江南大学