专利名称：调节细胞微管动态新机制的发现的制作方法
技术领域：
: 本发明属于基础生命科学，生物化学，细胞生物学，分子生物学,脑科学,神经细胞骨架学和神经细胞信号转导学等多个领域，创新性地揭示了细胞微管解聚的新机理和神经细胞形成及工作的基本原理。
背景技术：
:细胞微管的动态和神经细胞轴突的形成，细胞分裂以及细胞移动等有密切的关系。通常认为，细胞内微管的形成间接地被微管结合蛋白(MAP，tau)的磷酸化影响，但微管动态的基本机理仍然不明。还没有关于既直接磷酸化微管蛋白也以其磷酸化机理影响微管动态的激酶的报道。模式生物秀丽线虫和哺乳动物的神经系统在形态学和生物化学上是相似的；一个保存性基因在秀丽线虫和哺乳动物的不同实验系里能表达相同的功效。秀丽线虫的unc-51基因编码一个从线虫到人类的进化上具有保存性的丝/苏氨酸蛋白激酶，是神经形成所必须的；这个基因的突变引起线虫的神经形成及运动的欠缺和短粗体形。揭示unc-51基因所编码的蛋白激酶的靶蛋白和其生物化学功能的意义是重要的
发明内容
:本发明的目的在于揭示unc-51基因所编码的蛋白激酶的重要底物和其生物化学功能，弄清楚神经细胞形成的分子机理，为神经疾病的治疗提供崭新的原理和方法。本发明的内容为:(I)首次揭示微管蛋白既能和UNC-51激酶结合，更能作为此激酶的底物被磷酸化微管蛋白和 UNC-51激酶的结合如图1，图2和图7所示。图1是把表达UNC-51激酶蛋白的人胚肾HEKs293细胞的溶胞产物用于免疫印迹后的结果，这图显示在被转染的HEKs293细胞内，UNC-51激酶蛋白结合着微管蛋白。图2的体外酶联免疫吸附测定结果显示，来自秀丽线虫及牛脑的微管蛋白都能够结合UNC-51激酶蛋白。图7是激光扫描荧光共焦显微镜的图像，这图像显示在非州绿猴肾细胞(C0S-7)质基质中，带红色荧光的颗粒状UNC-51激酶蛋白和带绿色萤光的颗粒状微管蛋白结合产生了颗粒状的黄色荧光。图3显示UNC-51激酶在体外能够磷酸化来自牛脑的α / β微管蛋白亚基并自我磷酸化，ATP和GTP均可作为磷酸供体。图4显示UNC-51激酶在体内(人胚肾ΗΕΚ293细胞)磷酸化微管蛋白并自我磷酸化。图5显示UNC-51激酶蛋白本身，秀丽线虫和牛脑由来微管蛋白的丝氨酸被UNC-51激酶磷酸化。(2)首次揭示UNC-51蛋白激酶活性能解聚微管并能输送粒状微管到细胞质基质中去从图6可看出，过量表达UNC-51激酶蛋白(红色，图6左箭头所指)的C0S-7细胞的微管已经消失(图6右箭头所指)，这表明UNC-51激酶活性可在细胞里解聚微管。和图8中无激酶活性的UNC-51突变蛋白(Κ39Μ)在细胞核周围形成的积聚体相t匕，图7显示，UNC-51激酶活性能输送粒状微管到细胞质基质中去。
(3)首次揭示UNC-51蛋白激酶活性能够诱导HeLa细胞变成多分枝的神经性细胞图9显示，UNC-51激酶活性能诱导人宫颈癌海拉(HeLa)细胞成为分叉神经似的细胞。图10表示UNC-51激酶活性通过对细胞内微管的磷酸化解聚反应诱导神经轴突形成的模型。
:图1微管蛋白和UNC-51激酶的体内结合图2微管蛋白和UNC-51激酶的体外结合图3UNC-51激酶在体外磷酸化微管蛋白并自我磷酸化并自我磷酸化图4UNC-51激酶在体内磷酸化微管蛋白图5UNC-51激酶在体外磷酸化自我的和微管蛋白的丝氨酸图6UNC-51激酶活性能解聚细胞内微管
图7UNC-51激酶活性能输送粒状微管到细胞质基质中去图8无激酶活性的UNC-51突变蛋白(K39M)和微管蛋白在细胞核周围形成积聚体图9UNC-51激酶活性能诱导海拉(HeLa)细胞成为分叉神经似的细胞图10UNC-51激酶活性通过对细胞内微管的磷酸化解聚反应诱导神经轴突形成的模型
具体实施方式
:1UNC_51蛋白激酶和微管蛋白结合的测定用细胞溶解缓冲液溶解表达UNC-51蛋白激酶的HEK293细胞，得到的溶胞产物的上清用于免疫印迹。利用亲和层析法从以上溶胞产物的上清纯化得到UNC-51蛋白激酶。运用固相酶联免疫测定法(ELISA)分析微管蛋白和UNC-51蛋白激酶的体外结合。2激酶活性的测定在含有50μΜ末端放射性表记的腺苷三磷酸[Υ-32Ρ]-ΑΤΡ或者鸟苷三磷酸[Y-32Pl-GTP的H印es激酶缓冲反应液(pH7.4)中，进行了 UNC-51蛋白激酶磷酸化微管蛋白的反应。用6.5%的SDS-PAGE和X-线胶片放射自显影法分析测定了激酶活性。薄层纤维素板(TLC)上的双向分离电泳法用于磷酸化丝氨酸的同定。3激光扫描荧光共焦显微镜的观察DAPI用于细胞核染色，TexasRed和FITC分别用于UNC-51和微管蛋白的染色。ZeiSSLSM510共焦显微镜被用于细胞观察和记录。
权利要求
1.本发明首次发现了 UNC-51的激酶活性能够直接地磷酸化微管蛋白并解聚细胞微管成为粒状构造和运输粒状构造微管到细胞质基质。UNC-51是第一个既磷酸化微管蛋白也直接地以其激酶活性影响微管构造和分布的激酶。其关键发现为:在试管内和在活体内的生化实验中，UNC-51的激酶活性直接地磷酸化α-，β-的丝氨酸，UNC-51结合α -，β -微管蛋白，无激酶活性的UNC-51突变体(Κ39Μ)不能磷酸化α-, 微管蛋白。
2.UNC-51的激酶活性解聚细胞微管成为粒状构造并使粒状构造微管分布到细胞质基质，UNC-51也能诱导HeLa细胞成为分叉神经似的细胞，无激酶活性的UNC-51突变体(Κ39Μ)蛋白和微管在细胞核周围形成积聚体构造物，不能诱导HeLa细胞成为分叉神经似的细胞。
纤维状微管+UNC-51+GTP(ATP)—磷酸化粒状微管+GDP(ADP)
3.上记二项要求的技术原理在生命科学，脑科学，肿瘤科学，计算机科学，宇宙科学，交通科学，医学，药学和制药学，中药科学，各种疾病的治疗法，医疗技术以及所有其他方面的应 用和推广。
全文摘要
细胞骨架的动态变化是神经细胞为代表的极性细胞的分化形成所必须的。微管是主要细胞骨架之一，微管的解聚在细胞骨架的动态变化中占有重要位置，其分子机理还不清楚。本研究首次发现，从秀丽线虫到哺乳动物具有保守性的UNC-51蛋白激酶既能结合又能磷酸化微管蛋白，而且能导致细胞内微管的解聚，使微管成颗粒状分布并输送颗粒状微管到细胞质基质中去；UNC-51蛋白激酶还能把非神经由来的HeLa细胞诱导变成为分叉神经状的细胞；无激酶活性的UNC-51突变体(K39M)蛋白则和微管在细胞核周围一起形成积聚体构造物，不能诱导HeLa细胞变成为分叉神经状的细胞。根据以上发现结果，提出以下模型UNC-51蛋白激酶通过直接地磷酸化微管蛋白，导致细胞微管的解聚，并且输送颗粒状微管到细胞质基质的分子机理，调节神经细胞轴突的形成和功能。
文档编号C12Q1/48GK103160572SQ20111040780
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者田怀泽, 李素云, 田华希 申请人:彩虹天健康科技研究(北京)有限责任公司