专利名称：一种水稻库源新基因(ss2)的紧密连锁分子标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种控制水稻库(每穗粒数)源(剑叶大小)新基因SS2的紧密连锁分子标记，属于水稻超高产育种和分子遗传学领域，适用于在水稻高产育种中引入新的产量相关基因SS2，并利用紧密连锁分子标记对该基因进行水稻库源相关性状的辅助选择育种。
背景技术：
从我国水稻育种历史分析，源、库、流三者的平衡对水稻产量潜力的提高发挥了重要作用。无论20世纪50年代的矮化育种，70年代的杂交水稻育种，还是近年的超级稻育种，每一次水稻产量的大幅度提高无不伴随着源、库、流状况的改善及新型源库平衡关系的建立。现已明确，水稻产量的高低主要取决于源、库、流三者的强弱及其相互间的协调程度， 其中穗部性状特别是每穗总粒数是光合产物积累的主要库性状，倒三叶尤其是剑叶是光合产物生产的主要源性状，穗茎中的大维管束数量通常被作为从叶片向穗部输送同化物的一个“流”性状。剑叶是穗部最重要的同化产物来源，其大小与每穗粒数、小穗育性、高容重籽粒、千粒重及籽粒产量密切相关。在不同条件下，源、库、流三者之一都有可能成为作物产量的限制因素，因而单方面强调源或库对产量的重要性都是不全面的。要获得高产，不仅源、 库要协调，还要考虑到流(运转)的协调，即源要足、库要大和运转通畅。由此可见，源、库、 流三者之间是相互促进、相互影响、相互制约的关系。目前一般采用源/库、源/流和流/ 库“三比”来评价源、库、流三者间的平衡关系，进而分析“三比”变化对水稻产量及生理的影响，从而找出水稻高产所需的最佳“三比”值。尽管人们已经认识到充足而且彼此协调的源库关系是水稻高产理想株型和超高产育种的重要目标，但至今对库源性状的遗传特别是两者间的分子调控机制还缺少研究。因此，鉴定影响库源性状的重要基因，通过分子标记辅助选择培育库源协调的高产品种进而解析库源性状调控的分子机制将具有重要意义。数量性状基因座(QTL)定位的应用极大地促进了对包括产量在内的许多重要复杂性状遗传机理的认识。鉴定影响库、源和流及产量性状的QTL有助于增加对这些复杂性状相互关系的理解，从而达到通过遗传操纵改良这些性状并最终提高产量的目的。一些学者利用不同的作图群体检测到影响源相关性状(剑叶、倒二叶和倒三叶)的QTL与库相关性状，诸如每穗总粒数，千粒重及单株产量的QTL定位在相同或相近的区域，认为一因多效或紧密连锁是籽粒产量与库、源之间相关的遗传基础(Erik等.2002 ；Cui等.2003 ； Ishimaru 2003 ；Thomson 等.2003 ；Yoon 等.2006)。Li 等(1997 ； 1998)在美国德州生态条件下种植利用粳稻Lemont与籼稻特青培育的早世代重组自交系群体，研究了水稻剑叶和倒二叶与库容量之间的遗传关系，发现作为主要库容量的每穗粒重有50%的变异是由剑叶大小引起，并利用分子标记鉴定出位于第3染色体RG910a-RG418区间同时影响库(每穗粒数和每穗粒重)、源(剑叶和倒二叶的叶面积和叶长度)性状的1个主效QTL (QL13b)，该基因座特青等位基因增加叶长和叶面积同时增加每穗粒数和每穗粒重，被认为是一个影响源库性状的重要主效QTL，并认为一因多效是控制源库性状的遗传基础。Mei等Q005)利用Lemont/特青BC1F1群体，在第3染色体的G249_RG418b区间检测到影响剑叶长度的主效 QTL，贡献率为8. 1%，其增加剑叶长度的等位基因也同样来自特青。申请人进一步在北京和海南两个不同的生态区下利用Lemont与特青培育的双向导入系群体及在北京环境下利用Lemont/特青F13重组自交系群体，在第3染色体的RM227-RM85区间均检测到影响每穗粒数和剑叶长度的主效QTL，该QTL增加叶长和每穗粒数的等位基因均来自亲本特青(未发表)。经比较作图，与该QTL紧密连锁的RM227和RM85正好落在RG910a_RG418区间。因此，可以推断该QTL与Li等(1998)定位到影响源库性状的QLUb位于同一染色体区间。由此表明，RM227-RM85区间确实存在一个在不同的生态条件下稳定表达的影响源库性状的基因，暂且将该基因命名为SS2 (Source-sink 2)。水稻库源性状是水稻产量形成的农学基础。库源相关性状(如剑叶长、宽及叶面积，每穗粒数及粒重)的QTL定位研究表明，影响水稻库源相关性状的QTL大致分成3种类型，一是同时控制叶片源性状和穗部库性状，二是只控制叶片源性状，三是只控制穗部库性状。在这3种类型中，只有第一种基因，对水稻库源协调起关键作用，是通过库源协调培育超高产品种的重要遗传基础。虽然叶片长短和叶片大小等源性状易于常规选择，但常规选择无法分辨影响源性状的不同基因位点，而只有通过标记辅助，有针对性地选择影响库源性状的基因(即上述的第一类基因)，才能快速有效地选育库源协调的超高产品种。因此， 鉴定和精细定位水稻库源性状的重要基因，寻找与其紧密连锁的分子标记，通过标记辅助选择技术培育水稻超高产新品种具有重要的现实意义。
发明内容
(一)技术问题本发明针对上述研究背景，从Lemont背景的高代回交导入系中选择出带有影响源(剑叶叶长)、库(每穗粒数)性状SS2的近等基因导入系GG306，其轮回亲本背景恢复率为91. 1%，进一步以Lemont作为轮回亲本与GG306进行3次回交，通过分子标记辅助选择的方法筛选到目标区段为SS2基因杂合导入、背景完全恢复为轮回亲本Lemont的近等基因系，利用该近等基因系所构建的F2次级分离群体为试材，筛选目标染色体区段的交换单株， 从而构建了一套亚区间的跨叠系，并结合表现型对目标基因进行高精确度的连锁分析，将 SS2基因精细定位到一个1041Λ的区间内；获得与之紧密连锁的基于PCR的分子标记SL14， 借助该标记可以有效筛选到带有SS2基因的长剑叶且每穗粒数多的个体，主要应用于库源充足且协调的水稻超产新品种的培育。( 二 )技术方案控制水稻库源新基因紧密连锁的分子标记方法，其特征在于用两对特异扩增水稻位于第3染色体上控制水稻库源新基因(SS2)的紧密连锁分子标记的引物SL14，其中正向引物序列为CTCATAATCGTTGCTACTCATC，反向引物序列为 CATGCAGACACGGAAATAC。共同扩增目标区段为杂合导入的近等基因系(携带有一个包含SS2 的1041Λ杂合片段)自交所衍生的F2分离群体中各单株的基因组DNA，电泳分离出2种分子量大小的片段，其中与Lemont亲本相同片段的分子量大小为18;3bp，与特青相同片段的分子量大小为166bp (
图1)。如果SL14的引物扩增后获得与亲本特青大小相同片段或者带有双亲杂合片段的单株，那么这些单株带有SS2高产等位基因，在性状上表现为剑叶增长且穗粒数增多，反之，则不带有SS2高产等位基因，表现剑叶较短且穗粒数较少。
具体实施例方式下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。其中所用方法如无特别说明均为常规方法。(一 )控制水稻库源新基因的初步定位1.供试材料以美国南部的优质粳稻品种Lemont和我国广东的高产籼稻品种特青所构建的双向回交导入系为主要研究材料。其构建过程如下将Lemont与特青配制杂种FnF1植株分别与双亲回交，分别形成Lemont和特青背景的双向回交BC1F1群体，在双向回交后代随机选单株分别与各自的轮回亲本进行2-4次不等的连续回交并经自交多代稳定，最后分别获得了 201个Lemont背景导入系(LT-ILs)和252个特青背景的导入系(TQ-ILs)。另一套材料是来自同一个杂交组合(Lemont/特青)的294个高世代重组自交系(RILs)。2. DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳参考TemnyW!等(2000年)的DNA提取方法，对各株系的代表单株分别混合提取基因组DNA。根据参考图谱，选取均勻分布于全基因组的142个双亲间有多态的SSR标记，合成引物。以各个株系的基因组DNA为模板进行聚合酶链式(PCR)反应。PCR反应的产物通过8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，genefinder染色后，在凝胶成像系统下成像。 参考双亲的扩增条带，对后代株系的带型进行判别记录。3.完备区间作图分析根据后代株系的扩增条带所表示的基因型，将其对应的库(每穗粒数)和源(剑叶长度)相关性状调查的结果作为表型值，输入由中国农业科学院作物科学研究所王建康课题组所发展的完备区间作图软件(ICIMapping V3. 0，免费软件)，进行数据分析，获得与水稻库源相关的候选区间及相关标记。我们鉴定出1个在不同遗传背景(特青背景导入系、Lemont背景导入系和重组自交系)和不同环境(北京和海南)下均能稳定表达的同时影响库源性状的主效QTLdP 位于第3染色RM85标记附近同时影响每穗粒数(库性状)和剑叶叶长(源性状)的主效 QTL(SS2)，该基因座上来自特青的等位基因增加剑叶叶长的同时增加每穗粒数，一因多效是控制该库源性状的遗传基础。表1利用294个Lemont/特青重组自交系(RILs)、252个特青背景导入系 (TQ-ILs)和201个Lemont背景导入系(LT-ILs)定位影响剑叶叶长(FLL，厘米)和每穗粒数(SNP，粒/穗)的主效QTL
权利要求
1.水稻库源新基因(SS》紧密连锁分子标记方法，其特征在于以杂合近等基因系构建的F2次级分离群体为试材，筛选目标染色体区段的交换单株，从而构建了一套覆盖目标区段的跨叠系，结合表现型对目标基因进行高精确度的连锁分析，最终将SS2基因精细定位到104Kb的区间内，获得与库源新基因(SS2)紧密连锁的InDel分子标记SL14。
2.按照权利1所获得一种与水稻库源新基因(SS》紧密连锁分子标记的应用，其特征在于以剑叶长品种特青导入短剑叶品种Lemont培育的杂合近等基因系的后代分离群体为对象，通过SL14标记的带型数据，辅助选择由SS2基因控制的水稻库(每穗粒数)源(剑叶叶长)相关性状。
全文摘要
本发明涉及一种水稻库源新基因SS2的分子标记方法，属于水稻超高产育种和分子遗传学领域。本发明实质是根据连锁分离规律，利用携带SS2杂合片段的近等基因系自交所构建的F2次级分离群体为试材，构建一套目标区段的跨叠系，结合表现型对目标基因进行高精确度的连锁分析，经过两年两点的重复鉴定，最终将SS2精细定位到第3染色体上104Kb的区间内，并获得了与之紧密连锁的基于PCR的分子标记SL14。将本发明应用于水稻超高产育种，能够快速准确的鉴定出同时影响库(每穗粒数)源(剑叶叶长)性状的基因型个体，进行育种材料的早世代选择，大大加速水稻超高产分子育种的进程。
文档编号C12Q1/68GK102433334SQ20111041350
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者孙勇, 徐建龙, 王韵, 黎志康 申请人:中国农业科学院作物科学研究所