专利名称：海水盾纤毛虫体外活体培养培养基的制备及培养方法
技术领域：
本发明属于水产动物疾病研究领域，具体地涉及一种在水产动物体外实现海水盾纤毛虫活体长期培养的方法及其培养基的制备。
背景技术：
盾纤毛虫被公认为是海水养殖主要的一类病原体，国内外已经有多位学者研究报道了其对海水养殖造成的严重危害(Azusa Umehara, et al. 2003，ESterud et al. 2000)。 一般情况下，盾纤毛虫营自由生活，以水中悬浮的微小有机颗粒(细菌、原生动物、微藻、有机碎屑等)为食。然而，在高密度养殖的情况下，盾纤毛虫通常可以转变为寄生性，以棘皮动物、贝类、甲壳类和鱼类的细胞或组织碎屑为食，并在寄主组织内快速生长、增殖，进而造成组织的深度伤害，形成严重的病灶，最终导致寄主的器官功能衰竭而死亡。
由于盾纤毛虫已经严重威胁到海水养殖的健康发展，中国水产科学研究院黄海水产研究所已先后对我国对虾、鱼类和海参的盾纤毛虫病进行了全面、系统的疾病流行病学研究，发现盾纤毛虫可感染中国对虾、牙鲆、大菱鲆、河飩、海参等多种经济动物，并深入进行了盾纤毛虫的形态学观察(中国水产科学，2005年12卷第5期)和感染这些动物的病理学研究(水生生物学报，20075年31卷第5期)。同时，针对所分离的盾纤毛虫开展了中草药药物筛选(国家发明专利ZL200510044755. 2)和防治工艺技术研究(国家发明专利 ZL200510044757. 1)。这些研究集中于对盾纤毛虫病的组织病理学和防治等方面，并未深入进行盾纤毛虫的生活史、致病机理等方面的研究。
为了科学的防治盾纤毛虫病，除了加强其防治技术研究外，开展虫体生活史和致病机理等基础理论研究也是十分必要的，而这方面的研究依赖于在体外对虫体进行长时间的活体培养。在本发明作出之前，国内外有关海水盾纤毛虫病的研究报道主要集中于流行病学、病原学、分类学、防治药物筛选等方面，只有学者R. Iglesias等人就盾纤毛虫虫体体夕卜活体培养的营养需求进行过石幵究(In vitro growth requirements for the fish pathogen Philasterides dicentrarchi. Veterinary Parasitology，2003，111 :19-30.)。 他们主要利用含有多种成份的人工合成培养基在体外对纤毛虫进行持续培养，其培养基配方复杂，虫体培养时间也仅在10天左右。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种海水盾纤毛虫体外活体培养培养基的制备及利用该培养基进行海水盾纤毛虫体外活体培养的方法，培养基制备方法简单，能够实现盾纤毛虫活体在水产动物体外的长期培养，为深入研究盾纤毛虫的生活史、致病机理等基础理论研究提供必备的技术支撑。
本发明采用如下技术方案予以实现
—种海水盾纤毛虫体外活体培养培养基的制备方法，包括以下步骤剪取健康牙鲆鱼或大菱鲆鱼的脑组织和肌肉组织，将两者按照质量比1 1 3 1的比例混合后，加入经滤膜过滤后的灭菌海水体积为V1，用组织勻浆机制备成肉泥；在肉泥中加入经滤膜过滤后的灭菌海水体积为V2，肉泥与两次加入的海水总体积的质量体积比为1 45 1 55，振荡均勻后置于密封、无菌的玻璃容器中，65 70°C水浴2 3小时后制备成盾纤毛虫活体培养基，制备好的盾纤毛虫活体培养基放置在4°C条件下长期保存。进一步，所述的用于过滤海水的滤膜优选为孔径0. 22 μ m的混合纤维素滤膜。本发明还提供一种利用所述方法制备的海水盾纤毛虫体外活体培养的培养基。本发明还提供一种海水盾纤毛虫体外活体培养的方法。本发明是按如下技术方案实现的一种海水盾纤毛虫体外活体培养方法，具体步骤是剪取感染盾纤毛虫病的养殖动物部分病灶组织，无菌操作在玻璃培养皿中剪碎后，滴入15 20倍体积的经滤膜过滤后的灭菌海水，置于18 20°C恒温培养箱内静置2 4个小时；在解剖镜下用无菌胶头滴管吸取静置后的培养皿内液体中游离的虫体，滴入装有15 30ml制备好的盾纤毛虫培养基的玻璃培养皿中，置于18 20°C恒温培养；每隔20 M小时，吸取5 IOml培养液转移至另一装有15 30mL新鲜的盾纤毛虫培养基的玻璃培养皿中，轻轻晃动数次混合均勻后， 再将其置于18 20°C恒温培养箱继续培养，以此实现活虫体长期培养的目的，原培养皿中剩余的培养液用于虫体计数。进一步，所述的用于过滤海水的滤膜优选为孔径0. 22 μ m的混合纤维素滤膜。本发明与现有技术对比的有益效果1.盾纤毛虫活体培养基的制作方法简单，无需添加多种复杂成份，方便在实验室大量、快速的制备。2.培养方法简单易行，所需仪器设备少，在一般的实验室条件下都可进行培养。3.体外盾纤毛虫活体的培养时间长，可连续培养30天以上，远远超过相似文献报道的10天左右。
图1体外培养15天在显微镜下观察到的活体盾纤毛虫。图2加入鲁哥式碘液固定后的盾纤毛虫虫体。
具体实施例方式下面通过实施例结合附图对本发明的技术方案进行详细说明实施例12011年6月，山东烟台某大菱鲆养殖厂养殖的大菱鲆发生盾纤毛虫病，将患病的大菱鲆打包充氧后带回青岛黄海水产研究所实验室进行病原分离和培养。在实验室内首先制备盾纤毛虫活体培养基。挑选20条从养殖厂带回的健康大菱鲆，剪取其脑组织约Ig和其背部去皮肌肉约lg，将两者混合装入一个大离心管中，加入 20ml灭菌海水用组织勻浆机勻浆10分钟后，再加入70ml灭菌海水充分振荡，混合均勻。将混合好的90ml混合物转移至带有密封盖的200ml玻璃瓶中，密封好后放在65 °C水浴锅中水浴2小时，期间每隔15分钟轻轻摇晃一次。水浴完毕后，将玻璃瓶自然冷却至室温后放入 4°C保存。
挑选严重感染盾纤毛虫的患病大菱鲆放入解剖盘，用无菌海水冲洗其病灶部位3 次。然后用解剖剪剪取约5g病灶组织放入一个无菌的直径9cm的玻璃培养皿中，无菌操作将该病灶组织剪碎，并向培养皿中加入约75ml经孔径为0. 22 μ m混合纤维素滤膜过滤后的灭菌海水，轻轻晃动培养皿使组织均勻散开后，盖上培养皿盖子并放入18°C恒温培养箱静置2小时。然后将静置后的培养皿放在解剖镜下，用无菌胶头滴管吸取一定数量液体中游离的盾纤毛虫虫体，转移至另一个新的经高温灭菌后装有15ml盾纤毛虫活体培养基的玻璃培养皿中，盖上培养皿盖子轻轻晃动数次，放入18°C恒温培养箱培养。
培养M小时后，拿出培养皿轻轻晃动数次，然后用无菌胶头滴管吸取5ml的培养液转移至另一个新的经高温灭菌后装有15ml新鲜的盾纤毛虫活体培养基的玻璃培养皿中，盖上培养皿盖子轻轻晃动数次后，继续放入18°C恒温培养箱培养。剩余的培养液用于虫体计数。此后每隔M小时重复这一步骤，直至实验结束。实验期间，及时制备并补充新鲜的盾纤毛虫活体培养基。
培养过程中虫体计数的方法为将吸取5ml后剩余的培养液用无菌胶头滴管完全吸尽，滴入装有滤纸的漏斗中进行过滤。过滤时，用胶头滴管将培养液尽可能的滴于滤纸中心底部，使过滤的横截面积尽可能的小。过滤完成后，用IOml经孔径为0. 22μπι混合纤维素滤膜过滤后的灭菌海水反向滴洗滤纸的过滤部位，滴洗液收集至一个灭菌的离心管中，获得IOml的虫体收集液体。向收集液中加入的鲁哥式碘液(Lugol’ s solution)固定， 充分振荡均勻后吸取0. Iml收集液放入浮游生物计数框中在显微镜下计数，计数体积的衡量以最终的IOml虫体收集液为标准。
本次体外盾纤毛虫活体培养实验共进行了 37天，虫体计数每3天一次，计数结果见表1。实验过程中，培养液中的盾纤毛虫虫体始终保持着旺盛的生命力和繁殖力(见图1)。
表1盾纤毛虫活体培养的计数结果
权利要求
1.一种海水盾纤毛虫活体培养基的制备方法，其特征在于它的制备过程是a.剪取健康牙鲆鱼或大菱鲆鱼的脑组织和肌肉组织，将两者按照质量比1 1 3 1 的比例混合后，加入经滤膜过滤后的灭菌海水体积为V1，用组织勻浆机制备成肉泥；b.在肉泥中加入经滤膜过滤后的灭菌海水体积为V2,肉泥与两次加入的海水总体积的质量体积比为1 45 1 55，振荡均勻后置于密封、无菌的玻璃容器中，65 70°C水浴 2 3小时后制备成盾纤毛虫活体培养基，制备好的盾纤毛虫活体培养基放置在4°C条件下长期保存。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述的用于过滤海水的滤膜为孔径0.22 μ m 的混合纤维素滤膜。
3.根据权利要求1或2所述方法制备的一种海水盾纤毛虫活体培养基。
4.一种海水盾纤毛虫的体外活体培养方法，其特征在于它的方法步骤是a.剪取感染盾纤毛虫病的养殖动物部分病灶组织，无菌操作在玻璃培养皿中剪碎后， 滴入15 20倍体积的经滤膜过滤后的灭菌海水，置于18 20°C恒温培养箱内静置2 4 个小时；b.在解剖镜下用无菌胶头滴管吸取静置后的培养皿内液体中游离的虫体，滴入装有 15 30ml制备好的盾纤毛虫培养基的玻璃培养皿中，置于18 20°C恒温培养；c.每隔20 M小时，吸取5 IOml培养液转移至另一装有15 30mL新鲜的盾纤毛虫培养基的玻璃培养皿中，轻轻晃动数次混合均勻后，再将其置于18 20°C恒温培养箱继续培养，以此实现活虫体长期培养的目的。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于所述的用于过滤海水的滤膜为孔径0.22 μ m 的混合纤维素滤膜。
全文摘要
一种海水盾纤毛虫体外活体培养的培养基制备及培养方法，涉及水产动物疾病研究领域。活体培养基制备方法是将牙鲆鱼或大菱鲆鱼新鲜脑组织和肌肉组织按照质量比1∶1～3∶1混合并匀浆成肉泥，按肉泥与海水质量体积比1∶45～1∶55的比例在肉泥中加入灭菌海水，在65～70℃水浴2小时后制成活体培养基。制备好的培养基放在4℃长期保存。本发明的培养基制备方法简单，无需添加复杂成分，利用本发明方法制备的培养基对海水盾纤毛虫体进行体外活体培养，虫体能够存活30天以上，为深入进行盾纤毛的致病机理和防治技术研究奠定了基础。
文档编号C12R1/90GK102492623SQ20111041412
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者于雯雯, 廖梅杰, 张正, 李彬, 王印庚, 王岚, 荣小军, 陈贵平 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所