专利名称：一种利用微生物催化制备(s)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的方法
技术领域：
一种利用微生物全细胞催化不对称还原制备⑶-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的方法，即利用微生物全细胞不对称还原4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮合成倍他司汀类药物的重要手性中间体⑶-(4-氯苯基)_(卩比啶-2-基)_甲醇的方法，属于生物催化技术领域。
背景技术：
倍他司汀类药物是一类具有高效低毒副作用特性的第二代抗组胺药物，可用于治疗过敏性鼻炎等变态反应疾病，具有作用迅速，选择性高，副作用低，疗效显著等优点。由于最近几十年间过敏性疾病的发病率呈快速上升趋势，在过敏性疾病治疗领域发挥重要作用的倍他司汀类药物的需求量不断增加。同为第2代抗组胺药，特非那定、阿司咪唑，能诱
发心脏毒性反应，其次是氯雷他定、西替利嗪，倍他司汀则由于其高效低毒的特性而备受瞩目。⑶-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇(⑶-CPMA)是合成倍他司汀类药物的重要手性中间体，关于其合成方法的报道主要有2003年，Chen C等人使用手性催化剂 irafls-RuCUtO^-xylbinap]
将 CPMK 不对称还原合成产物(S)-CPMA 的e. e.值为60. 6% ； 1996年，Corey EJ等人使用儿茶酚硼烷(catecholborane)作为手性定位选择剂，BF3和BBr3作为还原剂，将(4-苯基)-(吡啶_2_基)-甲酮 [(4-phenyl)-(pyridin-2-yl)methaone]进行不对称还原，产物(4-苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇[C )44-phenyl)-(pyridin-2-yl)methanol]的 e. e.值和产率分别为 30%和19% ；2006年，Truppo MD等用酮还原酶(商品酶)对CPMK进行酶法不对称还原，产物 C ) -CPMA光学纯度仅有60%。由以上数据可以看出，化学还原制备C ) - (4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇效果不佳，产率和值较低，并且操作过程复杂，一些手性催化剂会在反应过程中引入重金属元素，不利于在制药行业的应用。仅有的一篇生物法的报道，采用酮还原酶(商品酶)还原制备(5)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇反应的产率和a a也不理想。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用微生物全细胞不对称还原制备C )-(4-氯苯基) _(吡啶-2-基)_甲醇的方法。利用筛选获得的具有高对映体选择性的微生物菌株克鲁维假丝酵母(Jluyveromycessp. ) CCTCC M 2011385进行不对称还原4_氯苯基-(吡啶-2-基)_甲酮的研究，为制备⑶-(4-氯苯基)_(卩比啶-2-基)-甲醇提供了一条可行的途径。本发明的技术方案以含有立体选择性羰基还原酶活性的微生物全细胞为催化剂，在单一水相或双水相反应体系中对潜手性4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮进行不对称还原，制备具有高光学纯度的(5) - (4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，步骤如下
(1)微生物来源从无锡长广溪湿地公园土壤样品中进行筛选，获得一株具有高立体选择性羰基还原酶活性的微生物菌株克鲁维假丝酵母Ο 7炒sp. ) JNU-KR1，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO =M 2011385。(2)湿菌体的培养培养基组成以g/L计为葡萄糖5 - 50，酵母膏3 — 30，磷酸二氢钾1 一 10，七水合硫酸镁0. 2 — 2，PH为4 一 9，发酵培养1 一 5天，发酵液过滤获得湿菌体；
(3)配置反应体系以4-氯苯基_(吡啶-2-基)-甲酮为底物，用磷酸盐缓冲液配制成的单一水相反应体系，底物浓度为0. 1-10 g/L，葡萄糖浓度10 — 100 g/L;或用不同分子量的PEG与不同无机盐溶液配制成的各种双水相反应体系，底物浓度为0.5 — 20 g/L，葡萄糖浓度 10 - 100 g/L。(4)酶转化反应在反应体系中加入步骤(2)所述克鲁维假丝酵母 (.Kluyveromycessv- )CCTCC NO :M 2011385 湿菌体 50-250 g/L，于 25-45 行酶反应，反应时间为3-72 h。(5)转化液后处理转化液用乙酸乙酯萃取转化液，将萃取获得的有机相蒸发回收溶剂，采用硅胶柱层析进一步分离纯化，再干燥脱水，蒸发回收溶剂，获得无色油状液体产物(5)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇。本发明方法所选用的反应体系为由0. 1 — 0. 5 mmol/L、pH6 — 8磷酸盐缓冲液配制的单一水相体系，或由分子量为2000 - 20000的不同PEG与各种无机盐(包括ΚΗ2Ρ04、 Na2HPO4, (NH4)2SO4和Na2SO4等)配制的不同双水相反应体系。本发明方法所选用的酶转化反应条件为底物浓度为1 一 10 g/L，湿菌体浓度 50 - 250 g/L，反应温度 25 — 35 °C，反应时间 12 — 72 h。本发明方法在PEG 4000 (20%, ff/ff) /Na2HPO4 (14%, W/W)双水相反应体系中，最终产物e. e.值和产率分别可以达到86. 7%和92. 1%。萃取处理用乙酸乙酯萃取转化液得到含有(5·) - (4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的有机相，用适量的无水硫酸镁干燥过夜使用0. 22 μ m孔径膜滤后进行液相色谱检测以测定反应的对映体过量值和产率。转化反应产物经萃取、干燥和0. 22 μ m孔径膜滤后，采用液相色谱法测定产物产率及对映体过量值，具体条件如下Daicel Chiralcel OB-H (5 ym,250 mm X 4. 6 mm)液相色谱柱，流动相为正己烷异丙醇(90: 10，V/V)，流速1 mL /min，柱温38 °C，紫外检测波长254 nm，进样量10 yL，保留时间20 min。产物光学纯度通过对映体过量值来评价。
权利要求
1.一株具有高立体选择性羰基还原酶活性的微生物菌株，其分类命名为克鲁维假丝酵母aauFeroWCM sp. ) JNU-KRl，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO: M 2011385。
2.用微生物CCTCCNO =M 2011385不对称氧化还原制备(5)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的方法，(S) - (4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇简写⑶-CPMA,其特征是以CCTCC NO =M 2011385全细胞为催化剂，在单一水相或双水相反应体系中对潜手性4-氯苯基_(吡啶-2-基)_甲酮CPMK进行不对称还原，制备具有高光学纯度的C )_(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，步骤如下(1)湿菌体的培养培养基组成以g/L计为葡萄糖5— 50，酵母膏3 - 30，磷酸二氢钾1 一 10，七水合硫酸镁0. 2 — 2，pH4 - 9，发酵培养1 一 5天，发酵液过滤获得湿菌体；(2)配置反应体系以4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮为底物，用磷酸盐缓冲液配制成的单一水相反应体系，底物浓度为0. 1-10 g/L，葡萄糖浓度10 — 100 g/L;或用不同分子量的PEG与不同无机盐溶液配制成的各种双水相反应体系，底物浓度为0. 5 — 20 g/L,葡萄糖浓度 10 - 100 g/L ；(3)酶转化反应在反应体系中加入CCTCCNO =M 2011385湿菌体50-250 g/L，于25-45 °C进行酶反应，反应时间为3-72 h ；(4)转化液后处理用乙酸乙酯萃取转化液，将萃取获得的有机相蒸发回收溶剂， 采用硅胶柱层析进一步分离纯化，再干燥脱水，蒸发回收溶剂，获得无色油状液体产物 ⑶-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于反应体系为由0.1 — 0. 5 mmol/L、pH6 一 8磷酸盐缓冲液配制的单一水相体系，或由分子量为2000 - 20000的不同PEG与ΚΗ2Ρ04、 Na2HPO4, (NH4)2SO4或Na2SO4各种无机盐配制的不同双水相反应体系。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于酶转化反应条件为底物浓度为1一 10 g/ L，湿菌体浓度50 - 250 g/L，反应温度25-35 °C，反应时间12 — 72 h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于在质量浓度20%PEG 4000 /质量浓度14% Na2HPO4双水相反应体系中，最终产物e. e.值达到85%，产率达到92%。
全文摘要
一种利用微生物催化制备(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的方法，属于生物催化技术领域。本发明利用克鲁维假丝酵母(Kluyveromycessp.)CCTCCM2011385全细胞不对称还原4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮，合成(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，首先筛选出对潜手性酮底物具有高立体选择性羰基还原酶活性的微生物，然后确定不对称还原反应的一系列条件，如反应温度、pH、细胞浓度、底物浓度、反应时间以及添加剂(包括各种辅溶剂、PEG、磷酸盐等)的添加进行优化，产物(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的对映体过量值和产率分别可以达到86.7%e.e.和92.1%。利用硅胶柱层析法对产物进行了初步的分离提取，分离后产物的纯度为99.2％，提取收率为56.7％。
文档编号C12P17/12GK102559520SQ20111041999
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者倪晔, 周婕妤, 孙志浩 申请人:江南大学