专利名称：复合微生物发酵剂的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物饲料添加剂领域中的菌种及其混合菌发酵剂。
背景技术：
我国的秸秆资源十分丰富，年产量可达到5. 79亿吨。其中，玉米、小麦、和稻草秸秆三大作物秸秆产量达到了 4. 39亿吨，占整个秸秆产量的75. 88%。目前，随着畜牧业的快速发展，加剧了畜牧业对粮食的依赖性，但秸秆用作饲料数量较少，即使用作饲料也因加工利用不当，使得秸秆的利用率及饲料报酬率低。农作物秸秆营养价值低、适口性差、消化率低。如果对其进行合理的加工调剂，可用于饲喂家畜。据报道，秸秆经青贮、氨化等方法调治后，每6kg青贮秸秆或4kg氨化秸秆相当于Ikg玉米饲料的营养价值。因此，采用科学的方法对秸秆进行加工调剂，广泛用于畜牧业，具有良好的生态效益社会效益和经济效益。近年来在我国推广的氨化饲料，不仅成本高、能耗高，并且存在与农业争肥、污染环境，有些方法对于牲畜还有毒副作用。而饲料清楚技术的研究与应用已有上百年的历史， 目前关键的技术在于微生物优良菌株的选育、复合菌种的有效复配和发酵工艺的优化。在这些方面，国内外学者均进行了大量的研究工作，但对于综合解决清楚饲料发酵过程中抑制腐败菌、防治二次发酵，有效控制有机酸和降解木质纤维素，降低成本，便于使用等方面仍然存在问题。
发明内容
针对目前存在的问题，本发明的目的在于提供一种青储饲料用微生物发酵剂。本发明生产用复合微生物发酵剂黑曲霉孢子、鼠李糖乳杆菌CGMCC4430和植物乳杆菌组成。复合微生物发酵剂中各菌种活细胞数量范围如下鼠李糖乳杆菌为(0.1 60. 0) *109个/克，植物乳杆菌数量为(0. 01 6. 0) *109个/克，黑曲霉孢子数量为(1 50)*108 个 / 克。将发酵制得黑曲霉孢子、鼠李糖乳杆菌粉、植物乳杆菌粉以质量比例为 1 (0. 5-2) (0. 5-2)混合，以干重计。1)黑曲霉孢子的制备工艺为A.斜面培养方法试管，121°C，20min灭菌后，摆斜面，冷却，接种。30°C培养到黑色孢子铺满斜面。B. K式培养瓶孢子取10° Brix麦芽汁加入2%琼脂，装入500mL K式培养瓶，12rC，20min灭菌后， 铺斜面冷却。接入孢子悬浮液lmL，保证悬浮液接种于整个培养基表面；侧放入恒温箱， 30°C培养到黑色孢子铺满斜面。C.固态放大培养将K式瓶孢子制成孢子悬浮液，孢子浓度大于1. OX IO8个/mL。取200kg固态培养基(麸皮140kg、10° Brix麦芽汁60L)，充分混勻后放入浅盘，在121°C下灭菌1小时。 待放凉后，接入孢子悬浮液。培养温度控制在30°C，湿度80-90%，每隔10小时翻料一次， 培养时间3天；待培养料长满孢子即可结束培养干燥粉碎发酵结束后，将浅盘放在流化床干燥，干燥温度控制在60°C，待物料水分含量将低于10%以下时，用粉碎机将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在100目以上。2)鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌菌粉的制备工艺为植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌粉状菌粉生产步骤如下将斜面菌种转接到液体培养基并逐级扩培到要求的体积；将扩培得到的菌液进行离心分离，收集沉淀菌体；向沉淀菌体中加入保护剂并进行稀释；利用干燥设备制备粉状菌剂，复合菌粉混合时可以加入淀粉和糊精实现各菌活菌数的合适比例。最终菌粉产品中各菌种活细胞数量范围如下鼠李糖乳杆菌为(0. 1 60. 0) *109个/克，植物乳杆菌数量为(0.01- 6. 0) *109个/克，黑曲霉孢子数量为(1 50)*108个/克。鼠李糖乳杆菌所用培养基如下斜面培养基(g/L) 20葡萄糖，5酵母粉，10大豆蛋白胨，10 牛肉膏，5NaCl，10 乙酸钠，2 柠檬酸铵，0. 2MgS04 · 7Η20，0· 05MnS04 · 7H20，15 琼脂，pH 6.5。发酵培养基(g/L) :40葡萄糖，10酵母粉，10大豆蛋白胨，无机盐(0. OlNaCl，0. 5 乙酸钠，0. 2 柠檬酸铵，0. 2ΚΗ2Ρ04，0· 2MgS04 · 7Η20，0· 05MnS04 · 7H20)，pH 6. 5。本发明中各种菌种组成比例也是经过精心试验研究得到，上述菌种的选择和配比保障了产品的良好质量。复合菌粉混合时可以加入淀粉和糊精实现各菌活菌数的合适比例。复合菌粉中各菌种活细胞数量较好范围如下鼠李糖乳杆菌为(1 60.0)*109个 /克，植物乳杆菌数量为(0. 1 6. 0) *109个/克，黑曲霉孢子数量为(1 30) *108个/克。鼠李糖乳杆菌菌粉的具体生产方法已有较多报道，报道文章有黄良昌的硕士学位论文“真空冷冻干燥法生产干酸奶发酵剂工艺的研究”(2002年)，刘宇峰等在中国乳品工业杂志发表的“直接使用型酸奶发酵剂的研制”发表于1995年第5期。本发明采用的菌种如下鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No. 4430菌株特点如下在显微镜下观察，该菌株为杆状，宽度小于1 μ m，2到3个杆菌易于连成连接在一起；在固体培养基上，该菌菌落为乳白色，表面光滑，湿润，粘稠，边缘较整齐。与原始菌相比，该诱变菌株在形态上明显小于出发菌株。出发菌株鼠李糖乳杆菌CGMCC No. 1.2134购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明鼠李糖乳杆菌采用下述流程进行选育原始出发菌种一试管活化一高温驯化一硫酸二乙酯(DEQ诱变一高糖平板筛选一亚硝基胍(NTG)诱变筛选一高温菌筛选一摇瓶复筛一传代稳定性试验一5L发酵罐试验。将目的菌株CGMCC No. 4430做5L乳酸发酵罐实验，结果表明与出发菌株相比，CGMCC No. 4430葡萄糖耐受浓度可以达到270g/L，与原始菌相比提高了 95% ；发酵结束后，乳酸含量为60g/L，与原始菌相比提高了 158%。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No. 4430保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心。地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
黑曲霉(Aspergillusniger) CGMCC No. 3. 5洸9、植物乳杆菌(Lactobacillus ρlantarum CGMCC. No. 1. 2158)购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。保藏日期2010年 12月8日。微生物青储混合菌发酵剂制作青储饲料的工艺3)原料准备精选无腐烂的稻草、玉米秆及豆科类杆原料或其混合物，铡至2 5 cm 长。4)菌种活化将复合微生物发酵剂倒入1 2° Brix麦芽汁中，混合均勻，25°C 35°C下经2 3小时即活化好。原料(稻草、玉米秆及豆科类杆原料或其混合物)的水含量应控制在70% 80%，复合微生物发酵剂用量为青储饲料原料的0. 1-5% ；5)接种装料原料分层堆积，堆积20 30cm厚时，喷洒一遍菌液。堆积总高不应超过2米。6)好氧培养空气中放置5 30天，春、秋两季应适当延长时间为20 30天；夏天放置5 10天。7)厌氧培养用塑料薄膜密封，20 90天后可以供牲畜食用，春、秋两季时间为 60 90天。夏天20 30天。复合微生物发酵剂用量为青储饲料原料的0. 1-1% ；有益效果黑曲霉、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌组成高活性复合微生物发酵剂。复合微生物发酵剂使用时，将青储饲料发酵分为好氧和厌氧两个阶段。这样在好氧阶段促进了菌体的快速生长，厌氧阶段利于代谢物的快速积累，本发明有效的解决了青储饲料发酵中的技术难题，使用简单，便于农民大规模使用。
具体实施例方式下面通过具体的实施方案叙述本发明中利用复合微生物发酵剂。 除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的培养剂组分、含量、培养条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。1)黑曲霉孢子的制备工艺为A.斜面培养方法试管，12rC,20min灭菌后，摆斜面，冷却，接种。30°C培养到黑色孢子铺满斜面。B. K式培养瓶孢子取10° Brix麦芽汁加入2%琼脂，装入500mL K式培养瓶，12rC，20min灭菌后， 铺斜面冷却。接入孢子悬浮液lmL，保证悬浮液接种于整个培养基表面；侧放入恒温箱， 30°C培养到黑色孢子铺满斜面。C.固态放大培养将K式瓶孢子制成孢子悬浮液，孢子浓度大于1. OX IO8个/mL。取200kg固态培养基(麸皮140kg、10° Brix麦芽汁60L)，充分混勻后放入浅盘，在121°C下灭菌1小时。 待放凉后，接入孢子悬浮液。培养温度控制在30°C，湿度80-90%，每隔10小时翻料一次， 培养时间3天；待培养料长满孢子即可结束培养干燥粉碎发酵结束后，将浅盘放在流化床干燥，干燥温度控制在60°C，待物料水分含量将低于10%以下时，用粉碎机将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在100目以上。鼠李糖乳杆菌 CGMCC4430 和植物乳杆菌(Lactobacillus ρlantarum CGMCC. No. 1. 2158)菌粉的制备工艺为植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌粉状菌粉生产步骤如下将斜面菌种转接到液体培养基并逐级扩培到要求的体积；将扩培得到的菌液进行离心分离，收集沉淀菌体；向沉淀菌体中加入保护剂并进行稀释；利用干燥设备制备粉状菌剂，上述方法制得鼠李糖乳杆菌菌粉中活细胞数为(0.1 6.0)*(101°)个/克，植物乳杆菌菌粉中活细胞数为(0. 1 6. 0) IO9个/克，复合菌粉混合时可以加入淀粉和糊精实现各菌活菌数的合适比例。最终菌粉产品中各菌种活细胞数量范围如下鼠李糖乳杆菌为(0.1 60.0)*109个/克，植物乳杆菌数量为(0.01 6.0) *109个/克，黑曲霉孢子数量为(1 50)*108 个 / 克。鼠李糖乳杆菌所用培养基如下斜面培养基(g/L) 20葡萄糖，5酵母粉，10大豆蛋白胨，10 牛肉膏，5NaCl，10 乙酸钠，2 柠檬酸铵，0. 2MgS04 · 7Η20，0· 05MnS04 · 7H20，15 琼脂，pH 6.5。发酵培养基(g/L) :40葡萄糖，10酵母粉，10大豆蛋白胨，无机盐(0. OlNaCl，0. 5 乙酸钠，0. 2 柠檬酸铵，0. 2ΚΗ2Ρ04，0· 2MgS04 · 7Η20，0· 05MnS04 · 7H20)，pH 6. 5。实施例1 :将发酵制的IOOg黑曲霉孢子、IOOg鼠李糖乳杆菌和IOOg植物乳杆菌混合组成，鼠李糖乳杆菌为30. 0*109个/克，植物乳杆菌数量为5*109个/克，黑曲霉孢子数量为20*108
个/克。
权利要求
1.一种复合微生物发酵剂，所述复合微生物发酵剂由黑曲霉孢子、鼠李糖乳杆菌 CGMCC4430和植物乳杆菌组成。
2.如权1所述复合微生物发酵剂，其特征在于所述复合微生物发酵剂中各菌种活细胞数量范围如下鼠李糖乳杆菌为(0.1 60.0) *109个/克，植物乳杆菌数量为(0.01 6.0)*109个/克，黑曲霉孢子数量为(1 50)*108个/克。
3.如权1-2所述一种复合微生物发酵剂，，其特征在于所述复合微生物发酵剂中鼠李糖乳杆菌为(1 60.0) *109个/克，植物乳杆菌数量为(0. 1 6.0)*109个/克，黑曲霉孢子数量为(1 30)*108个/克。
4.如权1-3所述一种复合微生物发酵剂，，其特征在于所述复合微生物发酵剂中鼠李糖乳杆菌为30. 0*109个/克，植物乳杆菌数量为5*109个/克，黑曲霉孢子数量为20*108 个/克。
全文摘要
本发明公开了一种复合微生物发酵剂，。所述复合微生物发酵剂由黑曲霉孢子、鼠李糖乳杆菌CGMCC4430和植物乳杆菌组成。通过向青储原料中加入此发酵剂，在好氧、厌氧条件下，微生物快速生长，分泌大量的纤维素酶来分解纤维素，蛋白酶分解蛋白产生游离氨基酸，同时产生大量代谢产物乳酸等。处理后的青储饲料pH值降低，基本无杂菌生长，是一种营养价值高、易消化的家畜用青储饲料。
文档编号C12N1/14GK102559546SQ20111042162
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者李政, 李绩, 王玉, 苏俊 申请人:李绩