用于对照核酸的通用基质的制作方法

专利名称：用于对照核酸的通用基质的制作方法
技术领域：
本发明属于体外诊断的领域。在这个领域内，特别地涉及利用水性缓冲液中用于定性和/或定量目的的内部对照核酸以及至少一种外部对照核酸，对可能存在于至少一个流体样品中的至少第一目标核酸的分离、扩增和检测。
背景技术：
在分子诊断的领域中，从多种来源的核酸扩增是相当重要的。核酸扩增和检测的诊断应用的实例有病毒如人类乳头状瘤病毒(HPV)、西尼罗河病毒(WNV)的检测，或对于人类免疫缺陷病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)和/或C型肝炎病毒(HCV)的血液捐赠者的常规筛查。此外，所述扩增技术适合于细菌靶点例如分支杆菌，或者肿瘤学标志物的分析。最重要的和广泛使用的扩增技术是聚合酶链式反应(PCR)。其他扩增反应包含，连接酶链式反应、 聚合酶连接酶链式反应、Gap-LCR、修复链式反应、3SR、NASBA、链交换扩增(SDA)、转录作用介导的扩增(TMA)以及扩增，等等。用于基于PCR的分析的自动化系统常常运用了同一反应容器中PCR方法期间产物扩增的实时检测。这样的方法的关键是使用带有报告基团或标记物的修饰的寡核苷酸。已经显示的是，在同一个容器中超过一种目标核酸的扩增和检测是可能的。这种方法通常称为“多路”扩增，如果进行实时检测，需要不同的标记物用于区分。在临床的核酸诊断领域中最希望的或甚至是强制性的是利用具有已知序列的对照核酸来控制相应的扩增，用于定性(性能控制)和/或定量(利用对照作为参考物测定目标核酸的量)的目的。特别是考虑到诊断靶点的多样性，包括原核的、真核的以及病毒的核酸， 以及不同类型的核酸例如RNA和DNA之间的多样性，通常以特别的方式设计对照核酸。在体外诊断环境中，基于核酸扩增和检测的分析一般外部地对照，即，相应的对照核酸在与目标核酸分离的容器中处理。它可以充当定性的或定量的外部对照核酸。在定性的情境中，对照物充当阳性对照用于评估扩增和检测反应的有效性。在定量的情境中，对照物做为选择或另外地充当了参考物用于确定目标核酸的量或浓度。来自生物流体的流体样品，例如，人类血液，经常展现了显著的复杂性。因而，为了模拟可能含一种或更多种目标核酸的生物样品的流体基质，体外诊断中使用的外部对照核酸通常必需在与所述生物样品基本上相同的流体基质中提供。例如，对于人血浆的核酸诊断分析，外部对照核酸一般在正常人血浆(NHP，来自几个健康供体的集中的血浆)中提供，特别是为了符合规章要求(Guidance for Industry and FDA Staff-Assayed and Unassayed Quality Control Material, 2007 ；Section IV, B, 1. Matrix Effects)。本发明提供了利用不同的方式的对照的扩增方法，其展现了各种优点。发明的说明
在第一个方面，本发明涉及分离和扩增可能存在于至少一个流体样品中的目标核酸的方法，所述方法包括以下自动化的步骤
a.向所述流体样品添加内部对照核酸；
b.在足以允许包含所述目标核酸的核酸以及所述内部对照核酸固定在固相支持物材料上的时间段和条件下，将固相支持物材料和所述流体样品在容器中组合在一起；
c.在分离站中从所述流体样品中存在的其他材料中分离出所述固相支持物材料；
d.在所述分离站中纯化所述核酸以及用洗涤缓冲液洗涤所述固相支持物材料一次或更多次；
e.使至少第一容器中的纯化的目标核酸和纯化的内部对照核酸，以及至少第二容器中水性缓冲液中的至少一种外部对照核酸与一种或更多种扩增试剂接触；
f.在足以发生指示所述目标核酸和所述对照核酸的存在或不存在的扩增反应的时间段和条件下，在所述反应容器中孵育所述纯化的目标核酸、所述纯化的内部对照核酸和所述在水性缓冲液中的至少一种外部对照核酸与所述一种或更多种扩增试剂，
其中步骤e到f中扩增的条件对于所述纯化的目标核酸、所述内部对照核酸和所述在水性缓冲液中的至少一种外部对照核酸是相同的。如上所述的方法是特别有益的，因为它不涉及任何天然的或复杂的介质，例如正常人血浆作为用于外部对照的流体基质，而是涉及水性缓冲液，对于生产、操作和保存，所述水性缓冲液是最显著地更容易和更便宜的。此外，由于正常人血浆来自几个个体的血液， 它的内容物展现了相当大的变异性。这包括可能存在的例如扩增抑制物，或核酸酶例如 DNase活性。在前一种情况下，所述抑制物的存在可能妨害正常人血浆充当外部对照核酸的流体基质的适用性。这样的外部对照核酸的扩增和检测的结果相当可能在所述正常人血浆的批次与批次之间、或甚至样品与样品之间变化。在正常人血浆的批次显示了例如显著的DNase活性的情况下，由于其中的核酸是不稳定的，整个批次可能必需丢弃。如在本发明中使用的，充当外部对照核酸的流体基质的水性缓冲液克服了这些缺点。因为这样的缓冲液是合成地生产的，扩增抑制物或核酸酶的不存在可以相对容易地控制。这些非期望的分子可能仅作为污染事件的结果进入所述缓冲液，但是本领域的技术人员熟知适合的手段来避免污染。因而，在优选的实施方式中，外部对照核酸甚至可以在被处理之前保存在所述水性缓冲液中，这在复杂的介质例如正常人血浆中是有问题的。如果流体样品是血液或血浆，特别是人类血液或血浆，这些和其他理由使得本发明是特别有益的。以下类型的对照核酸被包括在根据本发明的方法中 内部对照核酸
作为全过程(full process)对照物(即，核酸纯化、扩增和优选的检测) 作为对于与特定样品的组成相关的目标反应的损害影响的监视物 水性缓冲液中的外部对照核酸 监视分析特异性试剂的完整性监视系统检测目标特异性信号的能力不必作为全过程对照物，因而不需要在样品基质内制造。“水性缓冲液”是指溶于水中的任何化学缓冲物质。在本发明的情境中特别有用的水性缓冲液有例如Tris、Tricine, HEPES, MOPS、柠檬酸盐缓冲液例如柠檬酸钠，或熟练的技术人员已知的其他缓冲液。在优选的实施方式中，所述水性缓冲液是Tris。在另一个优选的实施方式中，所述水性缓冲液是Tricine。优选的，所述水性缓冲液含有螯合剂，例如EDTA或EGTA，或其他的。通过复合-结合，这些试剂配位了充当可能破坏核酸的各种酶的辅助因子的阳离子，特别是主要取决于Mg2+的核酸酶。优选的，如上所述的水性缓冲液含有EDTA。此外，水性缓冲液优选地含有防腐剂。这些试剂是熟练的技术人员已知的。在优选的实施方式中，如上所述的水性缓冲液含有叠氮化钠。优选的是，所述水性缓冲液进一步含有稳定外部对照核酸的试剂，优选的大分子，例如，聚(rA)RNA或糖原，其中聚(rA)RNA 是特别优选的。进一步优选的，如上所述的水性缓冲液具有中性或碱性的PH值，优选的从 6,6. 5、7或7. 5的值到8. 5、9、9. 5、10、10. 5、11、11. 5或12的值。最优选的，所述水性缓冲液具有约8的pH值。在本发明的优选的实施方式中，上述的水性缓冲液包含以下成分
Tris 优选的浓度从 1、2、3、4、5、6、7、8 或 9 mM 的值到 12. 5、15、17· 5、20、30、40、50、 60、70、80、90或100 mM的值。最优选的，浓度是约10 mM。· EDTA 优选的浓度从 0· 01、0· 02、0· 03.、0· 04、0· 05、0· 06、0· 07、0· 08 或 0. 09 mM 的值到 0. 125,0. 5、0· 175,0. 2、0· 3、0· 4、0· 5、0· 6、0· 7、0· 8、0· 9 或 1 mM 的值。最优选的，浓
度是约0. 1 mM。·叠氮化钠优选的浓度从 0. 005,0. 01、0· 02、0· 03 或 0. 04% (w/v)的值到 0. 06、 0. 07,0. 08、0. 09、0. 1 或 0. 5% (w/v)的值。最优选的，浓度是约 0. 05% (w/v)。·聚(rA) RNA 优选的浓度从 1、2. 5、5、7. 5、10、12. 5、15 或 17. 5 mg/1 的值到 22. 5、25、27. 5、30、40、50、75、100、150、175 或 200 mg/1 的值。最优选的，浓度是约 20mg/l。其他相当大的优点是根据流体样品的类型选择所述水性缓冲液的独立性，由于除了水性缓冲液中所述外部对照核酸之外在所述样品(一种或复数种)内内部对照物的存在， 这是可能的。内部对照物存在于样品(一种或复数种)中的事实消除了对于外部对照选择流体基质的要求，其中所述流体基质尽可能紧密地模拟了样品(一种或复数种)的流体基质。 因而内部对照核酸能够对照样品中例如抑制性物质的可能的存在或不存在，例如，可能干扰分析方法的PCR抑制物。因而，外部对照核酸不必处于紧密地类似于要分析的流体样品的流体基质内，而所述流体基质可以是任何水性缓冲液，例如，化学的水性缓冲液。当制备和分析来自不同来源的核酸的组，例如，不同的体液如血浆、痰液或鼻部棉拭中的临床样品时，这种情况是特别有益的。在这样的情况下，外部对照核酸可以在相同的水性缓冲液中提供，而不是在流体基质血浆、痰液和鼻部棉拭的全部中提供。如果这些不同的样品在整合的容器布置中制备和分析，例如，多孔平板，甚至含有水性缓冲液中的一种外部对照核酸的一个反应孔就是足够的，例如，如果目标核酸在所有样品中是相同的，或者如果所述外部对照核酸是通用的，例如，适合于不同的核酸。除了上文提及的内部和外部对照核酸之外，还可能有益的是在方法中包括阴性对照。“阴性对照”也是外部对照，然而没有包括核酸。这种对照也称为“污染对照”，因为所述对照中的阳性结果是一种或更多种分析成分的污染的指示。在这样的情况下，相应的测试运行不被认为是有效的。因而，阴性对照充当了对系统的污染事件的测量，因而不需要在样品基质中制造。在优选的实施方式中，阴性对照经历根据本发明的方法在步骤a之后的所有步骤。在这样的实施方式中，阴性充当了污染的全过程对照，即，它也适合于监视在样品制备操作期间弓I入的可能的污染物。阴性对照优选地基本上仅由流体基质例如水性缓冲液组成。在本发明的优选的实施方式中，阴性对照是与用于外部对照核酸的水性缓冲液相同的水性缓冲液。再一次，不需要使用类似于或相同于样品基质的基质，因为在根据本发明的方法中包括了内部对照核酸。因而，在进一步优选的实施方式中，阴性对照是水，优选的蒸馏的或去离子的水。上述的内部对照核酸可以是竞争性、非竞争性或部分竞争性的。竞争性内部对照核酸带有与目标基本上相同的引物结合位点，因而与目标竞争相同的引物。虽然这种原理由于它们相似的结构容许相应的目标核酸的良好模仿，它可能降低对目标核酸(一种或复数种)的扩增效力，因而产生较不敏感的分析。非竞争性内部对照核酸具有与目标不同的引物结合位点，因而结合不同的引物。 这样的设置的优点包括，尤其是，反应混合物中不同的核酸的单独扩增事件可以没有任何竞争效果地相互独立地发生。因而，不产生对于分析的检测极限的副作用，这在竞争性设置中是存在的。最后，在利用部分竞争性设置的扩增中，相应的对照核酸和至少一种目标核酸竞争相同的引物，同时至少一种其他目标核酸结合不同的引物。在非竞争性设置中，内部对照核酸具有不同于任何目标序列的序列，以不竞争它们的引物和/或探针。优选的，内部对照核酸的序列不同于流体样品中的其他核酸序列。举例来说，如果流体样品来自于人类，内部对照核酸优选地不具有在人类中也内源地发生的序列。序列中的差异应当至少足够显著，以在严格条件下不容许引物和/或探针对相应的内源核酸(一种或复数种)的结合而使反应有竞争性。为了避免这样的干扰，本发明中使用的内部对照核酸的序列优选地来自不同于流体样品的来源的来源。优选的，它来源于天然存在的基因组，优选的植物基因组，进一步优选的来自葡萄基因组。在非常优选的实施方式中，来自天然存在的基因组的核酸是杂乱的。如本领域已知的，“杂乱的”是指在序列中引入碱基突变达到一定程度。优选的，本发明中使用的内部对照核酸的序列是相对于它所起源的天然存在的基因实质上改变的。本发明的另一个优选的方面涉及上文描述的方法，其中至少第一和第二目标核酸在同一反应容器中扩增，因而容许更高量的不同目标核酸的同时扩增，因为在不同的反应容器中的信号可以相互独立地检测。这种多路反应可以在多个反应容器中发生，从而使目标的量倍增，目标可以利用与外部对照核酸以及优选的相同的阴性对照的相同水性缓冲液同时地扩增。在其它情况下，优选的是在第一反应容器中扩增第一目标核酸，而不扩增第二目标核酸，例如，取决于所讨论的样品和/或目标核酸。因而，本发明的进一步优选的实施方式是如上所述的方法，其中在第一反应容器中没有第二目标核酸。特别是如果怀疑流体样品含有来自不同生物体的目标核酸，或甚至不同的生物体本身，或者如果不清楚所述样品中可能存在不同的核酸或生物体的哪一种，本发明的有益的以及因而优选的实施方式是如上所述的方法，其中至少第一和第二核酸可以在所述样品中存在，其中所述目标核酸优选地来自不同的生物体。如前文提及的，如上所述的方法对于定性或定量地对照一种或更多种目标核酸的扩增是有用的。生物样品中核酸的定性检测是关键的，例如，对于识别个体的感染。从而，对于例如微生物感染的检测的分析的一个重要的要求是避免假阴性或假阳性结果，因为这样的结果将几乎不可避免地导致对于相应患者的治疗的严重后果。因而，特别是在基于PCR的方法中，定性的外部或内部对照核酸大都被添加到分析中。所述对照对于确认测试结果的有效性是特别重要的至少在对于相应目标核酸的阴性结果的情况下，对照反应必需在给定的情境下表现反应性，即，必需检测对照核酸，不然测试本身被认为是不起作用的。然而，在定性的设置中，在阳性结果的情况下，所述对照不一定必需被检测。对于定性测试，特别重要的是确保反应的敏感性并因而严格地对照。作为结果，定性对照核酸的浓度必需是相对低的，从而甚至在例如轻微抑制作用的情况下定性对照核酸不被检出，从而测试是无效的。内部对照核酸的运用具有原位地对照反应进行的优点，S卩，例如，可能抑制可能与样品一起引入的试剂。因而，本发明的优选的方面是如上所述的方法，其中所述内部对照核酸的扩增产物的存在是在含有纯化的目标核酸和纯化的内部对照核酸的容器中发生扩增的指示，甚至在不存在所述目标核酸的扩增产物的情况下。另一方面，如果水性缓冲液中的外部对照核酸被用作定性对照，它监视了目标从样品中独立地扩增的首要能力，因而提供了对照进行孵育的物理条件的手段。例如，在PCR 中，在不适当的分布的情况下，即，在不适当的孵育温度和/或孵育时间下，外部对照核酸将不会扩增。缺少所述外部对照核酸的扩增还可能指出特异性扩增试剂(例如，特异性引物)或非特异性扩增试剂(例如，脱氧核苷三磷酸或相应的DNA聚合酶)方面的缺陷。因而，本发明的另一个优选的方面是如上所述方法，其中所述外部对照核酸的扩增产物的存在是在含有纯化的外部核酸的容器中发生扩增的指示，甚至在不存在所述目标核酸的扩增产物的情况下。另一方面和除了样品中核酸的存在或不存在的纯粹检测之外，经常重要的是检测所述核酸的量。举例来说，病毒疾病的阶段和严重度可以在病毒负载的基础上评估。进一步的，监视任何治疗需要关于个体中存在的病原体的量的信息，以评估治疗的成功。对于定量分析，必需引入定量标准核酸充当参考用于测定目标核酸的绝对量。定量可以通过参考外部校准或通过进行内部定量标准来实现。因而，本发明的优选的方面是如上所述的方法，进一步包括以下步骤 g.测定所述目标核酸的量。在外部校准的情况下，使用已知量的相同的或可比较的核酸，例如，上述的水性缓冲液中的至少一种外部对照核酸在独立的反应中产生标准曲线。目标核酸的绝对量随后通过所分析样品获得的结果与所述标准函数的比较来确定。然而，外部校准具有的缺点是，可能的提取操作、它的变化的效力以及抑制扩增和/或检测反应的试剂的可能和常常不可预测的存在不能在对照中反映。这种情况适用于任何样品相关的影响。因而，可能的情况是， 由于不成功的提取操作或其他基于样品的因素，样品被判定为阴性，而要检测和定量的目标核酸实际上存在于样品中。对于这些和其他理由，添加到测试反应的内部对照核酸是有利的。当充当定量标准物时，所述内部对照核酸在定量测试中具有至少以下两种功能
i)它监视反应的有效性。ii)它充当滴度计算中的参考，因而补偿了抑制作用的效应和对照制备和扩增方法以容许更精确的定量。因此，与定性测试中仅在目标阴性反应中必需为阳性的定性内部对照核酸相比，定量测试中的定量对照核酸具有两种功能反应对照和反应校准。因而在目标阴性的和目标阳性的反应中它必需是阳性的和有效的。它进一步必需适合于提供可靠的参考值用于高核酸浓度的计算。因而，内部定量对照核酸的浓度需要是相对高的。总之，在本发明中实现的内部对照核酸和水性缓冲液中外部对照核酸的组合是高度有益的。所述组合不仅组合了单独的外部对照核酸或单独的内部对照核酸的优点，还产生了几种协同作用
在失败实验的情况下便于错误查找例如，如果仅使用内部对照核酸或仅外部对照核酸，它们的扩增的失败仅得到运行无效的结论，而不是为什么会这样。相比之下，如果使用两种类型的对照物，例如，仅外部对照核酸被扩增，则可能的是样品中存在抑制物，因为扩增试剂对外部对照核酸起作用。这种协同作用在优选的实施方式中甚至增强了，其中包括了阴性对照物，由此可能的非期望的和因而污染的核酸可能通过所述阴性对照中的阳性结果来指示。·允许用于外部对照核酸的水性缓冲液的使用如上文进一步描述的，在要分析的流体样品内包含内部对照核酸消除了使用与用于外部对照核酸的流体样品的基质相似或相同的流体基质的需要。不必模拟流体样品基质，因为内部对照核酸作为全过程对照起作用，能够监视流体样品中可能的抑制物。·如上所述的，临床分子诊断中要求在复杂流体基质中提供外部对照核酸的规章要求，即使如在本发明的方法中使用水性缓冲液中的外部对照核酸时也可以遵循 (Guidance for Industry and FDA Staff-Assayed and Unassayed Quality Control Material, 2007 ；Section IV, B, 1. Matrix Effects)。进一步有益的是使水性缓冲液中的外部对照核酸经历样品制备的操作，S卩，核酸的分离。在这些实施方式中，所述外部对照中的阴性扩增结果可以是样品制备操作中的缺陷的指示，例如，针对核酸的损失。因而，本发明的优选的方面是如上所述的方法，其中所述在水性缓冲液中的至少一种外部对照核酸经历在步骤a之后的步骤。进一步可能的是包括经历所述其他步骤的外部对照核酸，以及仅经历步骤d之后即样品制备之后的步骤的其他的外部对照核酸。在这种实施方式中，可以组合上述两种优
点ο因而，本发明的优选的方面是上述的方法，其中水性缓冲液中的至少一种外部对照核酸经历步骤a之后的步骤，水性缓冲液中至少一种其他外部对照核酸仅经历步骤d之后的步骤。进一步有益的是一些实施方式，其中在步骤a中或在步骤d之后所述内部对照核酸也被加入到所述在水性缓冲液中的至少一种外部对照核酸中。与其他优点一起，这简化了工作流程，特别是在自动化装备中，因为内部对照核酸可以简单地添加到例如多孔平板的所有反应孔中，所述反应孔含有一种或更多种流体样品和水性缓冲液中一种或更多种外部对照核酸。因而，本发明的优选的方面是如上所述的方法，进一步包括在步骤a中将所述内部对照核酸添加到水性缓冲液中至少一种外部对照核酸中。在本发明的意义上，核酸的“纯化”、“分离”或“提取”涉及以下的在核酸可以在诊断分析中例如通过扩增来分析之前，它们一般必需从含有不同成分的复杂混合物的生物样品中纯化、分离或提取。通常，对于第一步骤，利用容许核酸富集的方法。为了释放细胞或病毒颗粒的内容物，它们可以用酶或用化学物质处理来溶解、降解或变性细胞壁或病毒颗粒。这个方法通常被称为裂解。含有这种裂解的材料的产生的溶液被称为溶胞产物。在裂解期间经常遇到的难题是，降解感兴趣的成分的其他酶，例如，降解核酸的脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶在裂解期间接触到感兴趣的成分。在裂解之前，这些降解酶也可能存在于细胞外部，或空间上分隔在不同的细胞区室中。随着裂解发生，感兴趣的成分变为暴露于所述降解酶。在这个方法期间释放的其他成分可以是，例如，属于脂多糖家族的内毒素，其对于细胞是有毒的，对于预期用于人类或动物治疗的产品可能产生问题。存在着多种方式来解决上述问题。当预期释放核酸时，通常使用离液剂，例如，硫氰酸胍或阴离子的、阳离子的、两性离子的或非离子型洗涤剂。还有好处的是使用蛋白酶， 其快速地降解早先描述的酶或不需要的蛋白质。然而，这可能产生另一个问题，因为所述物质或酶可能干扰随后步骤中的试剂或成分。可以有益地用于上述的这种裂解或样品制备方法的酶有这样的酶，其裂解蛋白质底物中的酰胺键，被分类为蛋白酶或(可互换地)肽酶(参见Walsh，1979，Enzymatic Reaction Mechanisms. W. H. Freeman and Company, San Francisco, Chapter 3)0 在现有技术中使用的蛋白酶包括碱性蛋白酶(WO 98/04730)或酸性蛋白酶(US 5, 386,024)o 在现有技术的核酸分离中广泛用于样品制备的蛋白酶是来自fTritirachium album的蛋白酶 K (参见，例如 Sambrook J. et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)，其在中性pH 值附近是活性的，属于本领域的技术人员已知的枯草蛋白酶的蛋白酶家族。对于在上述的裂解或样品制备方法中使用特别有益的是酶esperase，一种在高度碱性和高温度下保持了它的活性的高效的蛋白酶(EP 1201753)。在裂解步骤之后的样品制备步骤中，感兴趣的成分被进一步富集。如果感兴趣的非蛋白质成分是例如核酸，它们通常在被用于基于探针的分析中之前从复杂的裂解混合物中提取出。存在着用于核酸纯化的几种方法
-序列依赖性的或生物特异性的方法，例如 亲和层析 与固定的探针杂交
-不依赖序列的或物理-化学的方法，例如 使用例如苯酚-氯仿的液-液提取 用例如纯乙醇来沉淀 用滤纸提取
用成胶粒团试剂，如十六烷基-三甲基-铵-溴化物来提取 与固定的、嵌入性染料结合，例如吖啶衍生物 吸附于硅胶或硅藻土 在离液条件下吸附于磁性玻璃颗粒(MGP)或有机硅烷颗粒
对于纯化目的特别感兴趣的是核酸吸附到玻璃表面上，而其他表面也是可能的。近年来通过利用它们对玻璃表面的结合特性，已经提出了从自然环境分离核酸的许多操作。如果未修饰的核酸是目标，核酸和具有硅表面的材料的直接结合是优选的，同其他理由一起， 是因为核酸不必被修饰，甚至天然的核酸也可以结合。这些方法由各种文献详细地描述了。 例如，在 Vogelstein B. et al. , Proc. Natl. Acad. USA 76 (1979) 615-9 中，提出了在存在碘化钠的情况下将来自琼脂糖凝胶的核酸结合到研磨燧石玻璃的操作。在Marko M. A. et al. , Anal. Biochem. 121 (1982)382-387中描述了在存在高氯酸钠的情况下在玻璃粉上纯化来自细菌的质粒DNA。在DE-A 37 34 442中，描述了通过利用乙酸沉淀噬菌体颗粒和用高氯酸盐裂解噬菌体颗粒，在玻璃纤维过滤器上分离单链的M13噬菌体DNA。洗涤结合到玻璃纤维过滤器上的核酸，用含有甲醇的Tris/EDTA缓冲液洗脱。在Jakobi R. et al.，Anal. Biochem. 175(1988)196-201 中描述了从 lambda 噬菌体纯化 DNA 的相似的操作。所述操作需要核酸在离液盐溶液中与玻璃表面的选择性结合，以及从杂质例如琼脂糖、 蛋白质或细胞残余物中分离核酸。为了从杂质中分离玻璃颗粒，颗粒可以被离心，或者流体通过玻璃纤维过滤器被抽出。然而这是限制性的步骤，妨碍了操作用于处理大量样品。在通过添加盐和乙醇的沉淀之后利用磁性粒子来固定核酸是更有益的，例如在Alderton R. P. et al. , S. , Anal. Biochem. 201 (1992)166-169 和 PCT GB 91/00212 中描述了。在这个方法中，核酸与磁性颗粒一起凝集。通过施加磁场和进行洗涤步骤，从原始溶剂中分离凝集物。在一个洗涤步骤之后，核酸溶于Tris缓冲液中。然而，这个操作具有缺点，在于沉淀对于核酸不是选择性的。同时，许多固体和溶解的物质也被凝集。结果，这个操作不能用于除去可能存在的、特异性酶反应的显著量的任何抑制物。磁性的多孔玻璃也是商业上可获得的的，其在多孔的、特别的玻璃基质中含有磁性粒子，用含有链霉抗生物素蛋白的层来覆盖。这个产物被用于分离生物材料，例如，蛋白质或核酸，如果它们在复杂的制备步骤中被修饰从而它们共价结合于生物素。可磁化的特定吸附剂被证明是非常有效的，适合于自动化样品制备。铁氧体磁性的和铁磁性的以及超顺磁性的色素被用于这个目的。最优选的磁性玻璃颗粒和使用它们的方法有在WO 01/37291中描述的那些。对于本发明的情境中的核酸分离特别有用的是根据 R. Boom et al. (J Clin Microbiol. 28 (1990), 495-503) 的方法。术语“固相支持物材料”包括对于核酸的固定的上述任何固体材料，例如，磁性玻璃颗粒、玻璃纤维、玻璃纤维过滤器、滤纸，等等，而固相支持物材料不限于这些材料。因而，本发明的优选的方面是如上所述的方法，其中固相支持物材料包括选自硅土、金属、金属氧化物、塑料、聚合物和核酸的一种或更多种材料。在本发明的非常优选的实施方式中，固相支持物材料是磁性玻璃颗粒。在本发明的上下文中，“固定”是指以可以或不可逆的方式捕获物体，例如核酸。特别地，“固定在固相支持物材料上”是指物体(一种或复数种)与固相支持物材料缔合为了它们与任何周围介质分离，并且可以被回收，例如，通过在之后从所述固相支持物材料上分离。在这种情境下，“固定”例如可以包括核酸吸附到玻璃或上文描述的固体材料的其他适合的表面上。此外，核酸可以通过结合于捕获探针特异性地“固定”，其中核酸通过碱基配对结合到附着于固相支持物的基本上互补的核酸上。在后一情况下，这样的特异性固定引起目标核酸的优势结合。在包括目标核酸的核酸从它们的天然环境纯化或分离之后，可以进行分析，例如， 通过上文描述的扩增。“第一目标核酸”和“第二目标核酸”是不同的核酸。“流体样品”是任何流体材料，其可以经历靶向核酸的诊断分析，优选地来自生物学来源。在如上所述的方法的优选的实施方式中，流体样品是临床样品。还优选的，所述流体样品来源于人类，是体液。在本发明的优选的实施方式中，所述流体样品是人类血液、尿液、痰液、汗、棉拭、可吸液的大便或脊液。最优选的，所述流体样品是人类血液或人类血浆。术语“反应容器”或“容器”包括，但不限于，试管或平板的反应孔，例如，微反应孔、 深反应孔或其他类型的多孔平板，在其中发生用于流体样品分析的反应，例如逆转录或聚合酶链式反应。这样的容器的外界限或壁是化学惰性的，从而它们不影响其内发生的分析反应。优选的，如上所述的核酸分离也在多孔平板中进行，更优选的在深孔平板中进行。在这种情境下，分析系统中的多孔平板容许多个样品的并行分离和分析或保存。 多孔平板可以为最大液体摄取或为最大热量转导来优化。在本发明的情境中使用的优选的多孔平板为了自动化分析仪中被分析物的孵育或分离而优化。优选的，多孔平板被构建和安置以接触磁设备和/或加热设备。所述优选的多孔平板，在本发明的上下文中可互换地称为“处理平板”，包括
-包含多个容器的顶部表面，所述容器具有成排布置的处在顶部的开口。所述容器包括上部、中心部和底部。上部连接到多孔平板的顶部表面，包括两个较长的和两个较短的侧面。中心部具有基本上矩形的横截面，具有两个较长的和两个较短的侧面； -两个相对的较短的以及两个相对的较长的侧壁，和
-底座，其中所述底座包括构建和布置的开口，以使得所述多孔平板与所述磁设备和/ 或加热设备接触。在多孔平板的优选的实施方式中，在一行内邻近的容器在所述接近矩形的形状的较长的侧面上相连。优选的，所述多孔平板包括位于邻近的容器行之间的连续的间隙。所述连续的间隙被构建和布置以容纳板状的磁设备。在优选的实施方式中，容器的底部包括球形底部。在更优选的实施方式中，所述容器的底部包含位于所述中心部分和所述球形底部之间的圆锥形部分。在优选的实施方式中，所述顶部表面包括肋条，其中所述肋条围绕容器的开口。优选的，容器的所述上部的较短的侧面的包括凹处，所述凹处包含从所述肋条延伸到容器的内侧的弯曲表面。此外，在优选的实施方式中，所述容器包括圆形的内部形状。对于与加工或孵育站的固定，所述底座优选地包括包含凹处的轮缘。分析仪的站上的爪卡(latch clip)可以与所述凹处啮合以将平板固定在站上。在优选的实施方式中，所述容器包括基本上恒定的壁厚度。本发明的情境中的优选的处理平板(101)是1-成分平板。它的顶部表面(110)包含多个容器(103)(附图5，附图6)。每个容器具有处在顶部的开口(108)，在底部端(112) 封闭。顶部表面(110)包括肋条(104)，其优选地相对于顶部表面(110)是隆起的，围绕容器(103)的开口(108)。这防止了容器(103)的内容物被可能落到平板(101)的顶部表面 (110)的液体的液滴污染。优选的处理平板的视图在附图3到8中显示。
处理平板(101)的足迹优选地包含与ANSI SBS足迹格式相应的底座的长和宽。更优选的，长度是127. 76 mm士0. 25 mm，宽度是85. 48 mm士0. 25 mm。因而，平板(101)具有两个相对的较短的侧壁(109)和两个相对的较长的侧壁(118)。处理平板(101)包括用于与处理机(500，附

图12)相互作用的成锁元件(106)。处理平板(101)可以以高速度被快速和安全地握住、转运和放置，同时维持正确的取向和位置。优选的，用于抓握的成锁元件(106) 位于较上部的中心部分内，优选的处理平板(101)的中上三分之一处。这具有优点是，处理平板(101)的可能的变形对成锁元件(106)仅具有微小的影响，平板(101)的操作是更强健的。处理平板(101)优选地包含硬体标识符(102 )和(115 )。硬体标识符(102 )和(115 ) 是处理平板(101)独特的，不同于同一系统中使用的其他消耗品的硬体标识符。硬体标识符 (102，115)优选地包含位于消耗品的侧壁的脊(119)和/或凹处(125)，其中所述脊(119) 和/或凹处(125)的图案是对消耗品的具体类型，优选地对处理平板(101)是独特的。这种独特的图案在此也称为独特的“表面几何图形”。硬体标识符(102，115)确保了用户仅以合适的取向将处理平板(101)加载到分析仪器的合适的堆积器位置中。在处理平板(101)的侧面，包含了导向元件(116)和(117)(附图3，附图4)。它们防止处理平板(101)的倾斜。 导向元件(116，117)容许用户将带有导向元件(116，117)的处理平板(101)作为堆叠加载到分析仪器中，其然后在堆积器中在仪器内部垂直地转移而不倾斜平板。容器(103)的中心部分(120)具有接近矩形的横截面(附图6，附图7)。它们沿着接近矩形形状的较长的侧面(118)由共用壁(113)分隔(图3)。由此形成的容器(103)的行具有优点是，尽管可用的空间有限，它们具有大的体积，优选的4 mL。另一个优点是由于基本上固定的壁厚度，生产是非常经济的。进一步的优点是，容器(103)相互强化，因而，可以获得形状的高稳定性。在容器(103)的行之间，存在连续的间隙(121)(附图6，附图7)。间隙(121)可以容纳磁体(202，203 )或加热设备(128 )(附图11)。这些磁体(202，203 )和加热设备(128 )优选地是固体设备。因而，被约束在容器(103)内的液体(215)中包含的磁性颗粒(216)可以通过在磁体(202，203)接近容器(103)时对容器(103)产生磁场从液体(215)中分离。或者容器(103)的内容物可以在提高的受控的温度下孵育，此时处理平板(101)置于加热设备 (1 )上。因为磁体(202，203)或加热设备(1 )可以是固体，可以实现高能量密度。容器 (103)的中心部分(120)接近矩形的形状(附图10)还通过优化容器(103)与磁体(202)或加热设备(1 )之间的接触表面优化了容器壁(109)与扁平形磁体(202)或加热设备(1 ) 之间的接触，因而增强了向容器(103)的能量转移。在容器的锥形底部(111)的区域内，间隙(121)是更显著的，可以容纳进一步的磁体(203)。在上部区域的大的磁体(202)与容器的圆锥形区域中较小的磁体(203)的组合容许在较大体积或小体积的液体(215)中磁性颗粒(216)的分离。因而，小的磁体(203)使得在洗脱物吸移期间磁性颗粒(216)更易于隔离。通过降低磁性颗粒(216)丸粒的死体积， 这使得以最小的损失吸移洗脱物成为可能。此外，转移的洗脱物中磁性颗粒(216)的存在被最小化。在容器(103)的上端，容器(103)的一个较短的侧壁(109)包含试剂进入通道 (105)，其延伸到圆周形肋条(104)(附图3，4，7)。试剂被吸移到试剂进入通道(105)上，排出通道(105)进入容器(103)。因而，防止了吸移针头或尖端(3，4)与容器中含有的液体之间的接触。此外，防止了由液体直接分配到容器(103)中含有的另一种液体(215)中所产生的的飞溅，这可能导致吸移针头或尖端(3，4)或邻近容器(103)的污染。小体积试剂向试剂进入通道(105)上的连续的吸移，随后最大体积的另一种试剂，确保了仅以小量添加的试剂完全地导入到容器(103)中。因而，小体积试剂的吸移是可能的，而不损失要进行的试验的准确性。在内侧，在容器(111，112 )的底部，形状变为圆锥形(111)，以球形底部(112 )结束 (附图6，附图7)。容器(114)的内部形状，包括矩形的中心部分(120)是圆形的。球形底部 (112)、圆形内部形状(114)、圆锥形部分(111)以及容器(103)的细致表面的组合引起了有利的流体学，其便于处理平板(101)中被分析物的有效分离和纯化。球形底部(112)容许分离的洗脱物的基本上完全的利用，以及死体积的降低，其降低了试剂的滞留或样品交叉污染。处理平板(101)的底座(1 )上的轮缘包括凹处(107)用于与处理站(201)或加热设备(128)或分析仪器(126)上的爪卡(124)啮合(附图5，附图9)。爪卡(124)与凹处 (107 )的啮合容许处理平板(101)在处理站(201)上的定位和固定。凹处(107 )的存在容许爪力几乎垂直与底座(129)地作用于处理平板(101)。因而，可以仅产生小的侧向力作用。 这降低了应力的出现，因而，降低了处理平板(101)的变形。垂直的爪力还可以中和处理平板(101)的任何变形，产生在处理站(201)内球形底部(111)的更准确的定位。一般地，处理平板(101)与分析仪内处理站(201)或加热设备(1 )之间的精确的接触面降低了死体积，以及降低了样品交叉污染的风险。“分离站”是分析系统的设备或部件，容许固相支持物材料从流体样品中存在的其他材料中分离。这样的分离站可以，例如，包含但不限于离心机、带有滤管的支架、磁体或其他适合的部件。在本发明的优选的实施方式中，分离站包括一个或更多个磁体。优选的， 一个或更多个磁体被用于作为固相支持物的磁性颗粒、优选的磁性玻璃颗粒的分离。例如， 如果流体样品和固相支持物材料在多孔平板的反应孔中组合在一起，则分离站包含的一个或更多个磁体可以，例如，通过将磁体引入反应孔来与流体样品本身接触，或者所述一个或更多个磁体可以接近反应孔的外壁以吸引磁性颗粒，随后将它们从周围的液体中分离。在优选的实施方式中，分离站是包含多孔平板的设备，所述多孔平板包含具有在多孔平板的顶部表面处的开口和闭合的底部的容器。所述容器包含上部、中心部和底部部分，其中所述上部连接到多孔平板的顶部表面，优选地包含两个较长的和两个较短的侧面。 所述中心部具有基本上矩形的横截面，具有两个较长的侧面，其中所述容器是成排排列的。 连续的间隙位于两个邻近的行之间，用于在至少两个Z位置处使夹具上固定的至少一个磁体与侧壁选择性地接触。所述设备进一步包括磁性分离站，其包含至少一个夹具。所述夹具包含产生磁场的至少一个磁体。具有移动机制，其相对于多孔平板的容器至少在第一和第二位置之间垂直地移动所述包含至少一个磁体的至少一个夹具。优选的，容器的所述至少两个Z位置包括所述容器的侧壁和底部部分。当所述至少一个磁体处于所述第一位置时，所述至少一个磁体的磁场优选地将磁性颗粒吸引到容器的内表面邻近于所述至少一个磁体处。当所述至少一个磁体位于所述第二位置时，与所述至少一个磁体处于所述第一位置时相比，所述磁场的作用是更小的。优选的，包含所述至少一个磁体的夹具包含框架。所述容器具有在多孔平板/处理平板的上下文中如上所述的优选的特征。一种这样的优选的特征是，所述容器的至少一部分具有与所述容器的轴正交的基本上矩形的横截面。在所述第一位置中，所述至少一个磁体邻近所述容器的所述部分。邻近被理解为是指紧密接近，从而对容器的内容物施加磁场，或与容器物理接触。分离站包括框架来接受多孔平板，以及爪夹来联结多孔平板。优选的，分离站包括两种类型的磁体。这个优选的实施方式在下文进一步描述。第二优选的实施方式描述如下，其包括弹簧，弹簧对包含磁体的框架施加压力，从而磁体被压向多孔平板的容器。第一磁体优选地被构建和布置以与多孔平板的容器相互作用，用于对所述容器中约束的包含磁性颗粒的大体积液体施加磁场。所述第二磁体优选地被构建和布置以与多孔平板的容器相互作用，用于对所述容器中约束的包含磁性颗粒的小体积液体施加磁场。所述第一和第二磁体可以移动到不同的Z位置。在本发明的情境和所述分离站中有用的是进一步的分离和纯化核酸的方法。所述方法包括在多孔平板的容器中将核酸结合到磁性颗粒的步骤。所述容器包含上部的开口， 中心部分和底部部分。当液体的主要部分位于容器的圆锥形部分被矩形中心部分替代之处剖面的上方时，通过将磁体从第二位置移动到第一位置，以及在所述第一位置上，向中心部分施加磁场，任选地，另外向所述容器的底部部分施加磁场，结合的材料然后从液体中含有的未结合的材料中分离。磁性颗粒可以任选地用洗涤溶液洗涤。其中液体的主要部分位于容器的圆锥形部分被矩形的中心部分替代之处的剖面下方时，通过向所述容器的底部部分选择性地施加磁场，小体积的液体从所述磁性颗粒分离。在本发明的情境中有用的还有用于分离结合到磁性颗粒的核酸的磁性分离站，包含第一磁体和第二磁体的所述分离站，所述第一磁体被构建和布置以与多孔平板的容器相互作用来对所述容器中约束的包含磁性颗粒的大体积液体施加磁场，所述第二磁体被构建和布置以与多孔平板的容器相互作用来对所述容器中约束的包含磁性颗粒的小体积液体施加磁场，其中所述第一和第二磁体可以移动到不同的Z位置。在此描述磁性分离站的优选的实施方式。对于本发明有用的分离站(201)的第一优选的实施方式描述如下。所述分离站
(201)的第一优选的实施方式包括至少两种类型的磁体(202，203)。第一种，长型的磁体 (202 )被构建和布置以装入处理平板(101)的间隙(121)中。因而磁体(202 )对容器(103 ) 中的液体(215)施加磁场，来将磁性颗粒(216)隔离到容器壁的内侧。当存在大体积的液体(215)时，这容许磁性颗粒(216)以及结合于其上的任何材料以及容器(103)内部的液体(215)的分离。磁体(202)具有纵长结构，被构建和布置以与容器的基本上矩形的中心部分(120)相互作用。因而，当液体(215)的主要部分位于容器(103)的圆锥形部分(111) 被矩形的中心部分(120)替代之处的剖面上方时，使用磁体(202)。如附图10中所示，磁体
(202)的优选的结构包括夹具(204，204a),其包含磁体(202)，磁体被装入处理平板(101) 中容器(103)的行之间的间隙(121)。磁体(202)的另一个优选的实施方式包括布置在夹具(204，204a)上的磁体(202)。优选的分离站(201)的磁体(203)是较小的，可以与容器 (103)的圆锥形部分(111)相互作用。这在附图10中示出。磁体(203)优选地布置在底座 (205)上，其可以移动到处理平板(101)的间隙(121)中。每个磁体(202，203)优选地被构建以与两个相邻行中的两个容器(103)相互作用。在优选的实施方式中，处理平板(101)具有6行的8个容器(103)。可以与优选的处理平板(101)相互作用的分离站(201)具有包含磁体(202)的三个夹具(204，204a),和包含磁体(203)的四个底座(205)。还包括了一种实施方式，其中分离站具有四个包含磁体(202)的磁性夹具(204，204a)以及三个包含磁体 (203 )的磁性底座(205 )。磁体(202，203 )是可移动的。分离站(201)包括一种机制来移动夹具(204，204a)和底座(205)。所有夹具(204，204a)通过底座(217)互连，因而是协同地移动的。所有磁体(203 )连接到一个底座(218 )上，因而协同地移动。移动磁性平板(202 ) 和(203)的机制被构建和布置以将两种类型的磁性平板(202，203)移动到总共四个末端位置
在附图lOa-c中，磁体(203)位于处理平板(101)的容器(103)的圆锥形部分附近。这是磁体(203)的最高的位置，是分离位置。在这个附图中，磁体(202)位于最低的位置。当它们处于这个位置时它们不介入分离。在附图10显示的优选的实施方式中，磁体(202)的底座(217)连接到定位轮 (206)。底座(217)包括底部端(207)其通过移动元件(209)与连接元件(208)灵活地接触。所述移动元件被构建和布置以沿着轨道(212)从一侧到另一侧移动连接元件(208)。 所述移动元件(209)用销钉(220)固定在连接元件(208)上。所述连接元件(208)通过螺丝(210)固定在定位轮(206)上。连接元件(208)也连接到轴(211)。所述连接元件(208) 优选地是矩形板。随着定位轮(206)围绕轴(211)偏心移动，从而螺丝(210)从高于偏心轴的点移动到低于偏心轴的点，具有附着与其上的磁体(202)的底座(204)的移动元件(209) 和底部端(207)从最高位置移动到最低位置。底座(218)也安装在底部部分(219)上，在它的下端用销钉(213)连接到移动元件(214)，其优选地是轮，其与定位轮(206)相互作用。 当定位轮(206)围绕轴(211)旋转时，轮(214)沿着定位轮(206)移动。如果轮(214)位于到轴(211)的距离短的定位轮(206)的截面上，，磁体(203)处在它们最低的位置上。当轮 (214)位于距离轴(211)的距离处在最大的定位轮(206)的截面上时，磁体(203)处在它们最高的位置上。因而，在分离站的第一实施方式的优选的实施方式中，磁体(203)的位置由定位轮(206)的形状控制。当移动元件(209)沿着轨道(212)的中央的、圆形的上部或下部(212a)移动时，小型的磁体(203)被上下移动。当移动元件(209)位于底部端(207)的侧面(212b)并上下移动时，磁体(202)被上下移动。定位轮可以通过任何引擎(224)来旋转。在优选的实施方式中，弹簧(225)连接到分离站的底座(222)，磁体(203)的底座(218) 确保了当它们向下移动时磁体(203)移动到最低的位置。如在此使用的术语“销钉”是指任何固定元件，包括螺丝或插脚。在第二优选的实施方式中，分离站(230)包括至少一个夹具(231)其包含至少一个磁体(232)，优选地磁体数目等于处于行(123)中的容器(103)的数目。优选的，分离站 (230)包括等于上文描述的多孔平板(101)的行(123)的数目的夹具(231)数目。更优选的，六个夹具(231)安装在分离站(230)上。至少一个磁体(232)安装在一个夹具(231)上。 优选的，磁体(232)的数目等于一个行(123)中容器(103)的数目。最优选的，八个磁体 (232)安装在一个夹具(231)上。优选的，一种类型的磁体(232)被包含在所述夹具(231) 上。更优选的，磁体(232)被安装在朝向容器的一个侧面上，磁体与所述侧面相互作用。夹具(231)安装在底座(233 )上。优选的，所述安装是柔性的。底座(233 )包括安装与其上的弹簧(234)。弹簧(234)的数目为所述底座(233)上安装的每个夹具(231)至少一个弹簧。所述底座进一步包括倒角(236)，其限制了弹簧的移动，从而，所述夹具(231) 包含磁体(232)。优选的，任一个所述弹簧(234)被构建和布置以与夹具(231)相互作用。 更优选的，所述弹簧(234)是杆簧。所述相互作用控制夹具(231)的水平移动。此外，分离站(230)包括框架(235)。具有夹具(231)的底座(233)通过上文对第一实施方式的磁体 (232)描述的移动机制连接到框架(235)。优选的，所述底座(233)和夹具(231)被构建和布置以垂直地移动(在Z方向上)。 以上描述的多孔平板(101)被插入分离站(230)中。包含磁体(232)的夹具(231)垂直地移动。因而，任何一个夹具(232)移动到容器(103)的两个行(123)之间的间隙中。垂直移动引起固定在夹具(231)上的磁体(232)与容器(103)接触。取决于容器(103)内液体 (215)的体积选择Z位置。对于大体积，磁体(232)在中间位置(120)接触容器(103)，其中容器(103)为接近矩形形状。对于小体积的液体(215)，其中液体(215)的主要部分位于容器(103)的中心部分(120)下方，磁体(232)优选地接触容器(103)的圆锥形部分(111)。弹簧连接到任何一个框架(231)的底座(233)(附图9a)，b))。弹簧将磁体(232) 压向容器(103)。这确保了磁体(232)和容器(103)在磁性分离期间的接触。优选的，磁体 (232)在位于进口(105)的下方的侧壁(109)上接触容器(103)。这具有优点是，通过吸移管添加的液体溢过隔离的磁性颗粒，确保了颗粒被重悬浮，以及所有容器中的所有样品被同样地处理。这个实施方式特别适合于在所述多孔平板(101)的容器(103)中含有不同水平的液体(215)时分离包含在上述多孔平板(101)中的液体(215)和磁性颗粒(216)。“洗涤缓冲液”是一种流体，其被设计以除去非期望的成分，特别是在纯化操作中。 这样的缓冲液是本领域公知的。在核酸的纯化的情境中，洗涤缓冲液适合于洗涤固相支持物材料以从任何不需要的成分中分离固定的核酸。例如，洗涤缓冲液可以含有处于缓冲溶液(一种或复数种)中的乙醇和/或离液剂，所述缓冲溶液(一种或复数种)为酸性PH值且没有上述的乙醇和/或离液剂。通常，洗涤溶液或其他溶液作为贮备溶液提供，贮备溶液在使用前必需稀释。根据本发明的方法中的洗涤需要固相支持物材料以及固定与其上的核酸与洗涤缓冲液的或多或少密集的接触。不同的方法可能实现这一点，例如，摇晃洗涤缓冲液和相应的容器(一种或复数种)中的、或与相应的容器(一种或复数种)一起的固相支持物材料。另一个有益的方法是吸出和分配包含洗涤缓冲液和固相支持物材料的悬浮液一次或更多次。 这种方法优选地使用吸移管进行，其中所述吸移管优选地包括一次性的吸移管尖端，所述悬浮液从所述尖端中吸出，或从中再次分配。这样的吸移管尖端可以在丢弃和置换之前使用数次。对本发明有用的一次性的吸移管尖端优选地具有至少10 μ 1的体积，更优选的至少15 μ 1，更优选的至少100 μ 1，更优选的至少500 μ 1，更优选的至少1 mL，再更优选的约lmL。本发明的情境中使用的吸移管也可以是吸移针头。因而，本发明的优选的方面是如上所述的方法，其中步骤d中的所述洗涤包括吸出和分配包含固相支持物材料的洗涤缓冲液。对于分离的核酸的下游加工，有益的是在使它们进行扩增之前从固相支持物材料上分离它们。因此，本发明的优选的方面是如上所述方法，其中所述方法进一步包括，在步骤d中，在洗涤所述固相支持物材料之后用洗脱缓冲液从固相支持物材料上洗脱纯化的核酸的步骤。本发明的情境中的“洗脱缓冲液”是用于从固相支持物分离核酸的适合的液体。这样的液体可以是，例如，蒸馏水或水性盐溶液，例如，Tris缓冲液，如Tris HC1，或HEPES，或熟练的技术人员已知的其他适合的缓冲液。这样的洗脱缓冲液的PH值优选地是碱性或中性的。所述洗脱缓冲液可以进一步含有成分，例如，螯合剂，如EDTA，其通过降解酶的灭活来稳定所述分离的核酸。所述洗脱优选地在提高的温度下进行，从而本发明的优选的实施方式是如上所述的方法，其中步骤d在70°C到90°C之间，更优选地在80°C的温度下进行。在本发明的情境中“扩增试剂”是容许核酸的扩增的化学的或生物化学的成分。这样的试剂包括，但不限于， 核酸聚合酶，缓冲液，单核苷酸，例如核苷三磷酸，寡核苷酸，例如，寡核苷酸引物，盐和它们的相应溶液，检测探针，染料，等等。如本领域已知的，“核苷”是碱基-糖组合。核苷的碱基部分通常是杂环的碱基。 这样的杂环碱基的两种最常见的种类是嘌呤和嘧啶。“核苷酸”是进一步包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包括五呋喃基糖的那些核苷，磷酸基团可以连接到糖的2’ _、3’ -或5’ -羟基部分。核苷酸是“寡核苷酸”的单体单位，其更一般地被称为“寡聚化合物”或“多核苷酸”，一般地称作“聚合混合物”。前述的另一种通用表述是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。根据本发明，“寡聚化合物”是由“单体单位”组成的化合物，所述单体单位可以是单独的核苷酸或非天然的化合物(见下文)，更具体地是修饰的核苷酸(或核苷酸类似物)或非核苷酸化合物，单独或其组合地。“寡核苷酸”和“修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)是寡聚化合物的亚群。 在本发明的情境中，术语“寡核苷酸”是指由作为它们的单体单位的多个核苷酸形成的成分。磷酸基团通常被称为形成寡核苷酸的核苷内主干。RNA和DNA的正常的连键或主干是 3’到5 ‘磷酸二酯键。对本发明有用的寡核苷酸和修饰的寡核苷酸(见下文)可以如本领域中主要地描述的和本领域技术人员已知的来合成。制备特定序列的寡聚化合物的方法是本领域已知的，包括，例如，合适的序列的克隆和限制性切割，以及直接化学合成。化学合成方法可以包括，例如，Narang S. A. et al. , Methods in Enzymology 68 (1979)90-98 所描述的磷酸三酯方法，Brown Ε. L.，et al. , Methods in Enzymology 68 (1979) 109-151 所公开的磷酸二酯方法,Beaucage et al. , Tetrahedron Letters 22 (1981 )1859 中公开的亚磷酰胺方法，Garegg et al.，Chem. Scr. 25 (1985)沘0_沘2中公开的H-膦酸酯方法，以及US 4，458，066中公开的固相支持物方法。在如上所述的方法中，寡核苷酸可以被化学地修饰，即，引物和/或探针包括修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。所述探针或引物则是修饰的寡核苷酸。“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)不同于天然核苷酸在于某些修饰，但是仍然由碱基、五呋喃基糖、磷酸部分、碱基样、五呋喃糖样以及磷酸盐样部分或其组合组成。例如，标记物可以连接到核苷酸的碱基部分，从而获得修饰的核苷酸。“核苷酸”中的天然碱基也可以被例如7-脱氮嘌呤替代，从而也获得修饰的核苷酸。“修饰寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)属于寡聚化合物的另一种特定亚群，具有一个或更多个核苷酸或一个或更多个修饰的核苷酸作为单体单位。因而，术语“修饰的寡核苷酸”或(“寡核苷酸类似物”)是指一些结构，其以基本上类似于寡核苷酸的方式起作用，可以在本发明的情境中可互换地使用。对于合成来说，修饰的寡核苷酸(或寡核苷酸类似物)例如可以通过磷酸主干、核糖单元或核苷酸碱基的合适的修饰，通过寡核苷酸的化 i^jf trp^ii^f (Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543 ；Verma S. , and Eckstein F.，Annu. Rev. Biochem. 67 (1998)99-134)0 代表性的修饰包括硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯、膦酸甲酯、磷酸三酯或氨基磷酸酯核苷间连键代替磷酸二酯核苷间连键；去氮或氮杂嘌呤和嘧啶代替天然的嘌呤和嘧啶碱基，在5或6位置处具有取代基团的嘧啶碱基；在2、6或8位置处具有改变的取代基团的嘌呤碱基，或7位置作为7-脱氮嘌呤；带有烷基-、烯基-、炔基-或芳基-部分的碱基，例如，低级烷基基团，例如，甲基、乙基、丙基、丁基、叔-丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基或芳基基团如苯基、苯甲基、萘基；在例如它们的2’位置具有取代基团的糖类；或碳环的或非环的糖类似物。与本发明的精神相符的其他修饰是本领域技术人员已知的。这样的修饰的寡核苷酸(或寡核苷酸类似物)最好被描述为与天然的寡核苷酸功能上可互换的，而又是结构上不同的。更详细地，示范性的修饰 ^t Verma S. , and Eckstein F. , Annu. Rev. Biochem. 67(1998)99-134 WO 02/12263 中公开了。此外，可以产生修饰，其中核苷单位经由基团连接，所述基团取代核苷间磷酸酯或糖磷酸酯键。这样的连键包括在Verma S.，and Eckstein F.，Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 99-134中公开的那些。当磷酸以外的连键被用于连接核苷单元时，这样的结构也被描述为“寡核苷”。“核酸”以及“目标核酸”是本领域技术人员已知的核苷酸的聚合物。“目标核酸”在此用于指代要被分析的样品中的核酸，即，应当测定其在样品中的存在、不存在和/或量。术语“引物”在此按照本领域专门技术人员所知的使用，是指寡聚化合物，主要指寡核苷酸，但还指修饰寡核苷酸，其能够通过模板依赖性DNA聚合酶弓I发DNA合成，S卩，例如引物的3’末端提供了游离的3’ -OH基团，其上可以通过模板依赖性DNA聚合酶附着上进一步的核苷酸，建立3’到5’磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸并由此释放焦磷酸。“探针，，还指天然的或修饰的寡核苷酸。如本领域已知的，探针用于检测被分析物或扩增物。在如上所述的方法的情况下，探针可以用于检测目标核酸的扩增物。为此，探针一般带有标记物。“标记物”通常也称为“报告基团” 一般是一些基团，其使得核酸，特别是寡核苷酸或修饰的寡核苷酸，以及与之结合的任何核酸与样品的其余部分区分开来(具有附着的标记物的核酸也可以称为标记的核酸结合化合物，标记的探针或仅称探针)。根据本发明的优选的标记物是荧光标记物，其是例如荧光染料，例如荧光素染料、罗丹明染料、花青染料和香豆素染料。根据本发明的优选的荧光染料有FAM、HEX、JA270、CAL635、Coumarin343、 Quasar705、Cyan500、CY5. 5、LC-Red 640、LC-Red 705。在本发明的情境中，任何引物和/或探针可以被化学地修饰，即，引物和/或探针包括修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。探针或引物则是修饰的寡核苷酸。核酸扩增的优选的方法是聚合酶链式反应(PCR)，其在美国专利Nos. 4, 683, 202,4, 683, 195,4, 800, 159 和 4，965，188 等等中公开了。PCR—般采用与选定的核酸模板(例如，DNA或RNA)结合的两种或更多种寡核苷酸引物。对核酸分析有用的引物包括能够作为目标核酸的核酸序列之内核酸合成的起始点的寡核苷酸。引物可以通过常规方法从限制消化物中纯化，或可以合成地产生。为了扩增中的最大效果，引物优选地是单链的， 但是引物可以是双链的。双链的引物首先被变性，即，处理来分离链。变性双链的核酸的一种方法是加热。“热稳定的聚合酶”是一种热稳定的聚合酶，即，它是在经历提高的温度持续必需的时间以引起双链模板核酸变性时，催化与模板互补的引物延伸产物的形成、并且不会不可逆地变性的酶。一般地，合成在每个引物的3’末端启动，沿着模板链按5’到3’ 方向进行。已经从例如黄栖热菌(Thermus flavus),红栖热菌(Τ. ruber),嗜热栖热菌 (T. thermophilus),水生栖热菌(T. aquaticus),乳栖热菌(Τ. lacteus)，红色栖热菌(T. rubens),嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烷嗜热菌 (Methanothermus fervidus)分离了热稳定的聚合酶。尽管如此，非热稳定的聚合酶也可以在PCR测定中采用，只要补充所述酶。如果核酸模板是双链的，必需在它在PCR中用作模板之前分离两条链。链分离可以伴随着任何适合的变性方法，包括物理、化学或酶学的方法。 分离核酸链的一种方法涉及加热核酸直到它大部分变性(例如，超过50%、60%、70%、80%、90% 或95%变性)。变性模板核酸所需的加热条件将取决于，例如，缓冲盐浓度和变性的核酸的长度和核苷酸组成，一般从约90°C到约105°C，取决于反应的性质例如温度和核酸长度持续一定时间。变性一般进行约5秒到9分钟。为了不使相应的聚合酶如Z05 DNA聚合酶暴露于这样的高温太长时间因而有损失功能性酶的风险，优选的是使用短的变性步骤。在本发明的优选的实施方式中，变性步骤是最高达到30秒，进一步优选地最高达到20秒，进一步优选的最高达到10秒，进一步优选的最高达到5秒，最优选的约5秒。如果双链模板核酸通过加热来变性，反应混合物容许冷却到促进每种引物与其在目标核酸上的目标序列退火的温度。退火的温度优选地从约35°C到约70°C，进一步优选地约45°C到约65°C;进一步优选地约50°C到约60°C，进一步优选地约55°C到约58°C。退火时间可以从约10秒到约1分钟(例如，约20秒到约50秒；约30秒到约40秒)。在这方面，有益的是使用不同的退火温度来提高相应的分析的包含性。简言之，这意味着在相对低的退火温度下，引物也可以结合具有单个错配的目标，从而也可以扩增某些序列的变体。例如，如果某些生物体具有也应当检测的已知的或未知的遗传性变型，这可能是期望的。另一方面，相对高的退火温度带有提供更高特异性的优点，因为趋向更高的温度，引物与不确切地匹配的目标序列结合的概率持续降低。为了受益于两种现象，在本发明的某些实施方式中，优选的是如上所述的方法包含在不同温度下退火，优选地首先在较低的温度，然后在较高的温度。如果，例如，第一孵育在55°C发生约5个循环，非确切匹配的目标序列可以被(预先)扩增。这可以跟随着，例如， 在58°C约45个循环，提供在整个实验的主要部分中的更高的特异性。这样，不会错过潜在重要的遗传变体，而特异性仍然相对高。然后反应混合物调节到一定温度，在所述温度下聚合酶的活性被促进或优化，即， 足以使从退火的引物发生延伸来产生与要分析的核酸互补的产物的温度。温度应当足以从与核酸模板退火的每个引物合成延伸产物，而不应当太高而将延伸产物从它的互补模板上变性(例如，用于延伸的温度一般从约40V到80V (例如，约50V到约70°C ；约60°C )。延伸时间可以从约10秒到约5分钟，优选的约15秒到2分钟，进一步优选的约20秒到约1 分钟，进一步优选的约25秒到约35秒。新合成的链形成双链分子，其可以在反应的后续步骤中使用。根据产生与目标核酸相应的扩增产物的期望量所需要的，链分离、退火和延伸的步骤可以重复。反应中的限制因素是反应中存在的引物、热稳定酶和核苷三磷酸的量。所述循环步骤(即、变性、退火和延伸)优选地被重复至少一次。为了在检测中使用，循环步骤的数目将取决于，例如，样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，需要更多的循环步骤来扩增足够用于检测的目标序列。一般地，循环步骤重复至少约20次，但是可以重复多最高达40,60或甚至100次。在本发明的范围内，可以进行PCR，其中退火和延伸的步骤在同一步骤中进行(单步骤PCR)或如上所述的，在独立的步骤中进行(两步骤PCR)。使用合适的酶，例如，Z05 DNA 聚合酶，同时并因而在相同的物理和化学条件下进行退火和延伸，带有节省每个循环中的额外步骤的时间的优点，还消除了在退火和延伸之间额外的温度调节的需要。因而，单步骤 PCR降低了相应的分析的总体复杂性。—般地，总体扩增的更短的时间是优选的，因为得到结果的时间被降低，产生可能更早的诊断。用于本发明的情境的其他优选的核酸扩增方法包括连接酶链式反应(LCR ；Wu D. Y. and Wallace R. B. , Genomics 4(1989)560-69 ；and Barany F. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 189-193)；聚合酶连接酶链式反应(Barany F.，PCR Methods and Applic. 1 (1991) 5-16) ；Gap-LCR (WO 90/01069)；修复链式反应(EP 0439182 A2)，3SR (Kwoh D. Y. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(1989)1173-1177 ；Guatelli J. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990)1874-1878 ；WO 92/08808)和 NASBA (US 5，130，238)。进一步的，有链交换扩增(SDA)，转录作用介导的扩增(TMA)，以及Qb-扩增 (综述参见，例如 Whelen A. C. and Persing D. H. , Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-373 ；Abramson R. D. and Myers Τ. W. , Curr Opin Biotechnol 4 (1993) 41—47)。本发明中使用的内部对照核酸优选地展现与它的序列相关的以下性质
-熔解温度从55°C到90°C，更优选的从65°C到85°C，更优选的从70°C到80°C，最优选的约75°C
-长度最高达到500碱基或碱基对，更优选的50到300碱基或碱基对，更优选的100 到200碱基或碱基对，最优选的约180碱基或碱基对
-GC含量30%到70%，更优选的40%到60%，最优选的约50%。在本发明的情境中，“序列”是核酸的一级结构，即，相应的核酸所组成的单个核碱基的特定排列。要理解的是，术语“序列，，不是指核酸的具体类型，例如RNA或DNA，而是应用于两者以及其他类型的核酸，例如，PNA等等。当核碱基相互符合时，特别是对于尿嘧啶 (在RNA存在)和胸腺嘧啶(在DNA中存在)，这些碱基可以被认为在RNA和DNA序列之间是等价的，这是相关领域中公知的。临床上相关的核酸通常是DNA，其可以衍生自例如DNA病毒，如B型肝炎病毒 (HBV)、巨细胞病毒(CMV)等等，或细菌，如沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟氏菌(NC)，等等。在这种情况下，有益的是使用由DNA组成的内部对照核酸和/或外部对照核酸，以反映目标核酸性质。因此，本发明的优选的方面是如上所述的方法，其中所述内部对照核酸和/或水性缓冲液中的所述外部对照核酸是DNA。另一方面，临床诊断学相关的许多核酸是核糖核酸，例如，来自RNA病毒的核酸，例如，人类免疫缺陷病毒(HIV)、C型肝炎病毒(HCV)、西尼罗河病毒(WNV)、人类乳头状瘤病毒(HPV)、日本脑炎病毒(JEV)、圣路易脑炎病毒(SLEV)等等。本发明可以容易地应用这样的核酸。在这种情况下，有益的是使用由RNA组成的内部对照核酸和/或外部对照核酸，以反映目标核酸性质。如果在上文描述的方法要分析RNA和DNA两者，优选的是内部和/或外部对照核酸是RNA，因为对照核酸优选地模拟了涉及多个目标的分析的最敏感的目标，RNA 目标通常必需更紧密地对照。因而，本发明的优选的方面是如上所述的方法，其中所述内部对照核酸和/或水性缓冲液中的所述外部对照核酸是RNA。相比DNA，由于影响例如碱性pH值、核糖核酸酶等等，RNA更倾向于降解，由RNA制成的内部对照核酸优选地作为防护的(armored)颗粒来提供。防护的颗粒例如特别是防护的RNA在例如EP910643中描述了。简言之，可以化学地生产的，优选地，异源地，例如通过细菌如E. coli生产的RNA，至少部分地密封在病毒包衣蛋白中。后者赋予了 RNA对外界影响，特别是核糖核酸酶的抗性。必需理解的是，内部对照物DNA也可以作为防护的颗粒来提供。一般地，防护的RNA和/或PNA通过使用噬菌体来获得。在DNA的情况下，Lambda噬菌体在这方面是有用的，这是技术人员已知的。在本发明的情境中防护的RNA和DNA作为内部和/或外部对照核酸都是有用的。因此，本发明的优选的方面是如上所述的方法，其中所述内部对照核酸和/或水性缓冲液中的所述外部对照核酸是防护的核酸。在本发明的其他实施方式中，优选的是质粒用作内部和/或外部对照核酸。质粒是主要由来自基因组外的细菌DNA的核酸。它们以未包被的形式作为对照核酸的用途是本领域的技术人员已知的。这样的实施方式在本发明中使用的水性缓冲液中的外部核酸的方面是特别有用的，因为在水性缓冲液中，外部对照核酸不必被小心地保护以对抗有害的影响例如核酸酶，这在NHP中将是事实，因为后者可能展现显著的核酸酶活性。因此，本发明的优选的方面是如上所述的方法，其中所述外部对照核酸是质粒。优选地，所述质粒是未包被的。进一步优选的，所述质粒是DNA。一般地，在基于扩增的核酸诊断中，在扩增和检测之前，RNA模板被转录成DNA。因此，本发明的优选的方面是如上所述的方法，其中所述扩增试剂包括具有逆转录酶活性的聚合酶，所述方法进一步包括在步骤e和步骤f之间在所述反应容器中、在适合于具有逆转录酶活性的所述聚合酶发生RNA转录作用的时间段和条件下，孵育所述纯化的核酸和所述一种或更多种扩增试剂的步骤。“具有逆转录酶活性的聚合酶”是能够根据RNA模板合成DNA的核酸聚合酶。一旦 RNA被逆转录成单链cDNA，它还能够形成双链DNA。在本发明的优选的实施方式中，具有逆转录酶活性的聚合酶是热稳定的。在优选的实施方式中，根据本发明的方法包括，在存在至少所有四种天然的或修饰的脱氧核糖核苷三磷酸的情况下，在包含金属离子缓冲剂的合适的缓冲液中，孵育含有 RNA模板的样品、与足够和所述RNA模板互补以与后者杂交的寡核苷酸引物以及优选的热稳定的DNA聚合酶，所述金属离子缓冲剂在优选的实施方式中，缓冲pH值和金属离子浓度两者。这种孵育在一定温度下进行，所述温度足以使所述引物与所述RNA模板杂交、以及使所述DNA聚合酶催化所述脱氧核糖核苷三磷酸的聚合化来形成与所述RNA模板序列互补的cDNA序列。如在此使用的，术语“cDNA”是指使用核糖核酸链(RNA)作为模板合成的互补 DNA分子。RNA可以是，例如，mRNA, tRNA, rRNA或其他形式的RNA，例如，病毒RNA。cDNA可以是单链的、双链的，或可以氢键键合到互补RNA分子，如在RNA/cDNA杂交物中的。适合于与RNA模板退火的引物也适合于通过PCR来扩增。对于PCR，与逆转录的 cDNA链互补的第二引物提供了用于延伸产物合成的起始位点。在通过DNA聚合酶的RNA分子扩增中，第一延伸反应是使用RNA模板的逆转录，产生DNA链。使用DNA模板的第二延伸反应产生双链DNA分子。因而，通过DNA聚合酶来自 RNA模板的互补DNA的合成提供了用于扩增的起始材料。热稳定的DNA聚合酶可以用于偶联的、单酶逆转录/扩增反应。在上下文中，术语 “同次的(homogeneous)”是指用于逆转录和扩增RNA目标的双步骤单个加成反应。对于同次的，它是指在逆转录(RT)步骤之后，在扩增步骤之前，不需要打开反应容器，或另外调整反应成分。在非同次的RT/PCR反应中，在逆转录之后和在扩增之前，一种或更多种反应成分例如扩增试剂，例如，被调整、添加或稀释，为此反应容器必需被打开，或至少它的内容物必需被操作。虽然同次的和非同次的实施方式被包括在本发明的范围中，RT/PCR的同次的形式是优选的。逆转录是RT/PCR中的重要步骤。例如，本领域已知的是，RNA模板显示了形成二级结构的倾向，这可能妨碍引物结合和/或通过相应的逆转录酶的cDNA链的延伸。因而，对于转录作用的效力，RT反应的相对高的温度是有益的。另一方面，提高孵育温度还意味着更高的特异性，即，RT引物将不会与展现了与预期序列(单种或复数种)的错配的序列退火。 特别是对于多个不同的目标RNA来说，可能希望的是也转录和随后扩增并检测具有单个错配的序列，例如，在流体样品中可能存在生物体的未知的或罕有的亚株或亚种的情况下。为了受益于如上所述的两种优点，S卩，二级结构的减少和有错配的模板的逆转录， 优选的是在超过一种不同的温度下进行RT孵育。因而，本发明的优选的方面是如上所述的方法，其中具有逆转录酶活性的聚合酶的所述孵育在30°C到75°C、优选的45°C到70°C、进一步优选的55°C到65°C的不同温度下进行。作为逆转录的进一步重要的方面，长RT步骤可能破坏流体样品中可能存在的DNA 模板。如果流体样品含有RNA和DNA种类，因而有利的是保持RT步骤的延续时间尽可能的短，但是同时确保足够量的cDNA的合成，用于随后的扩增和任选的扩增产物的检测。因而， 本发明的优选的方面是如上所述的方法，其中具有逆转录酶活性的聚合酶的孵育的时间段是最高达到30分钟、20分钟、15分钟、12. 5分钟、10分钟、5分钟或1分钟。本发明的进一步优选的方面是如上所述的方法，其中所述具有逆转录酶活性和包含突变的聚合酶选自以下构成的组
a.CS5 DNA聚合酶
b.CS6 DNA聚合酶
c.海栖热袍菌(Hiermotogamaritima) DNA 聚合酶
d.7jC生栖热菌(Thermus aquaticus) DNA 聚合酶
e.嗜热栖热菌(Thermusthermophilus) DNA 聚合酶
f.黄栖热菌(Thermusflavus) DNA聚合酶g.丝状栖热菌(Thermusfiliformis) DNA聚合酶
h.栖热菌属物种(Thermussp. ) spsl7 DNA聚合酶
i.栖热菌属物种(Thermussp. ) Z05 DNA聚合酶
j.那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana) DNA聚合酶 k.非洲栖热腔菌(Termosipho africanus) DNA聚合酶 1. Thermus caldophilus DNA 聚合酶
特别地适合于这些要求的有在聚合酶结构域中带有突变的酶，其就更快的延伸速率而言增强了它们的逆转录效力。因此，本发明的优选的方面是如上所述的方法，其中所述具有逆转录酶活性的聚合酶是包含突变的聚合酶，所述突变赋予了相对于相应的野生型聚合酶的改善的核酸延伸速率和/或改善的逆转录酶活性。在更优选的实施方式中，在如上所述的方法中，具有逆转录酶活性的聚合酶是包含突变的聚合酶，所述突变赋予了相对于相应的野生型聚合酶的改善的逆转录酶活性。带有点突变使得它们在本发明的情境中特别有用的聚合酶在WO 2008/046612中公开了。特别地，在本发明的情境中使用的优选的聚合酶是突变的DNA聚合酶，其在聚合酶结构域中包含至少以下的基序
T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N ；其中)(b7是选自S或T的氨基酸，其中)(b8是选自G、 T、R、K或L的氨基酸，其中所述聚合酶包含3’ -5’核酸外切酶活性，并具有相对于野生型 DNA聚合酶的改善的核酸延伸速率和/或改善的逆转录效力，其中在所述野生型DNA聚合酶中胁8是选自D、E或N的氨基酸。一个特别优选的实例是来自栖热菌属物种Z05的热稳定的DNA聚合酶的突变体 (例如，在US 5，455，170中描述的)，与相应的野生型酶Z05相比，所述变化包含处于聚合酶结构域中的突变。对于根据本发明的方法特别优选的是突变体Z05 DNA聚合酶，其中在位置580处的氨基酸选自由G、T、R、K和L构成的组。对于使用热稳定的聚合酶的逆转录，Mn2+作为二阶阳离子是优选的，一般作为盐来包括，例如，氯化锰(MnC12)、乙酸锰(Mn (OAc) 2)或硫酸锰(MnS04)。如果MnC12被包括在含有50 mM Tricine缓冲剂的反应中，例如，MnC12 —般以0. 5-7. O mM的浓度存在；当使用 200 mM 的每种 dGTP、dATP、dUTP 和 dCTP 时，0. 8-1. 4 mM 是优选的；2. 5-3. 5 mM MnCl2 是最优选的。进一步的，使用Mg2+作为逆转录的二阶阳离子在本发明的情境中也是优选的。由于在本发明的范围内的是将RNA目标核酸逆转录成cDNA同时保留DNA目标核酸，从而cDNA和DNA两者可以用于随后的扩增，如上所述的内部和外部的对照方法对于来自具有RNA的生物体和具有DNA基因组的生物体的目标核酸的同时扩增是特别有用的。这种优点显著地提高了可以在相同的物理条件下分析的不同的生物体的谱系，特别是病原体。因而，本发明的优选的方面是如上所述的方法，其中至少两种目标核酸包含RNA 禾口 DNA0“同时地”或“同时”在本发明的意义上是指同时和在相同的物理条件下进行两种活动，例如，扩增第一和第二或更多核酸。在一个实施方式中，至少第一和第二目标核酸的同时扩增在一个容器中进行。在另一个实施方式中，同时和在相同的物理条件下，特别是对于温度和孵育时间，用一个容器中的至少一种核酸和第二容器中的至少第二核酸进行同时扩增，其中所述的内部对照核酸存在于每个所述容器中，而外部对照核酸(一种或复数种) 仅存在于不同的容器(一种或复数种)中。如在此使用的，“生物体”是指任何活的单细胞或多细胞生命形式。在本发明的情境中，病毒是生物体。特别是由于合适的最佳温度，酶如Tth聚合酶，或优选的上述的突变体Z05 DNA聚合酶适合于进行目标核酸的扩增的随后步骤。对逆转录和扩增采用相同的酶有助于进行方法的便利化和简化它的自动化，因为流体样品不必在RT和扩增步骤之间被操作。因此，在优选的实施方式中，在如上所述的方法中，相同的具有逆转录酶活性的聚合酶被用于逆转录和用于步骤f中的扩增。优选地，所述酶是上文描述的突变体Z05 DNA 聚合酶。在本发明的情境中为了不暴露聚合酶或反应混合物中的其他成分，在优选的实施方式中，超过90°C的步骤是最高达到20秒、优选的最高达到15秒、更优选的最高达到10 秒、更优选的最高达到5秒、最优选的5秒长度。这降低了获得结果的时间，减少了分析的总体要求时间。在这样的同次设置中，具有相当大的优点的是在启动RT和扩增之前密封反应容器，从而降低污染的风险。例如，封闭可以通过施加优选地透明的箔、帽，或通过添加到反应容器并在流体的顶部形成亲脂性相作为封闭层的油来实现。因而，本发明的优选的方面是如上所述的方法，进一步包括在步骤e之后封闭至少两个反应容器的步骤。为了便于操作和简化自动化，优选的是在整合的装置中组合至少两个反应容器， 从而它们可以一起被操作。因此，本发明的优选的方面是如上所述的方法，其中至少两个反应容器被组合在同一整合的装置中。整合的装置可以是，例如，小瓶或试管，其可逆地或不可逆地相互附着或排列在支架上。优选地，整合的装置是多孔平板。扩增步骤的目标可以是RNA/DNA杂交分子。所述目标可以是单链的或双链的核酸。虽然最广泛使用的PCR操作利用了双链目标，这不是必需的。在单链DNA目标的第一次扩增循环之后，反应混合物含有双链DNA分子，其由单链的目标和新合成的互补链组成。 类似地，在RNA/cDNA目标的第一次扩增循环之后，反应混合物含有双链cDNA分子。此时， 如上所述继续进行连续的扩增循环。由于特别是在但不仅是在PCR的情况下，如果作为循环反应来进行，核酸扩增是非常高效的，本发明的优选的方面是如上所述的方法，其中所述步骤f中的扩增反应由多个循环步骤组成。适合的核酸检测方法是本领域技术人员已知的，在标准教科书中描述了，如 Sambrook J. et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 and Ausubel F. et al. Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY。
步骤之前还可进行进一步的纯化步骤，例如，沉淀步骤。检测方法可以包括但不限于特定染料如溴化乙锭的结合或嵌入，其嵌入到双链DNA中并在此后改变它的荧光。纯化的核酸还可以通过电泳方法，任选地在限制性消化之后来分离，并在此后显现。存在着基于探针的分析，其利用了与特异性序列的寡核苷酸杂交和随后杂交物的检测。优选的是在扩增反应期间或之后检测扩增的目标核酸，以评估分析的结果。特别是对于实时检测，有益的是使用核酸探针。因而，本发明的优选的方面是如上所述的方法，其中循环步骤包括扩增步骤和杂交步骤，所述杂交步骤包括将扩增的核酸与探针杂交。有利的的是实时监视扩增反应，即，在扩增本身期间检测目标核酸和/或它们的扩增物。因此，本发明的优选的方面是如上所述的方法，其中探针用供体荧光部分和相应的接受体荧光部分标记。上文阐述的方法优选地基于供体荧光部分和接受体荧光部分之间的荧光共振能量传递(FRET)。代表性的供体荧光部分是荧光素，代表性的相应的接受体荧光部分包括 LC-Red 640、LC-Red 705、Cy5和Cy5. 5。一般地，检测包括在供体荧光部分吸收的波长下激发样品，并显现和/或测量由相应的接受体荧光部分发射的波长。在根据本发明的方法中，检测优选地跟随着定量FRET。优选地，在每个循环步骤之后进行检测。最优选的，实时地进行检测。通过使用商业上可获得的实时PCR装置(例如，LightCycler "<或TaqMan )，扩增产物的PCR扩增和检测可以组合在单个闭合的比色杯中，显著地降低循环时间。由于检测与扩增同时地发生，实时PCR方法避免了操作扩增产物的需要，降低了扩增产物之间交叉污染的风险。实时PCR大大地减低了周转时间，是临床实验室中常规PCR技术的吸引人可选项。以下专利申请描述了 LightCycler 技术中使用的实时PCR :W0 97/46707, WO 97/46714和WO 97/46712。LightCycler 仪器是利用高质量光学器件与微体积荧光计组合的快速热循环仪。这种快速热循环技术利用了薄的玻璃比色杯作为反应容器。反应室的加热和冷却通过改变加热的和环境空气来控制。由于空气的低质量和比色杯的高的表面积比体积比值，在热室内可以实现非常快速的温度交换速率。TaqMan 技术利用了用两个荧光部分标记的单链的杂交探针。当第一荧光部分被适合波长的光线激发时，根据FRET的原理，吸收的能量被转移到第二荧光部分。第二荧光部分一般是猝灭剂分子。这种形式中使用的典型的荧光染料例如，FAM、HEX、CY5、JA270、 Cyan和CY5. 5等。在PCR反应的退火步骤期间，标记的杂交探针结合目标核酸(即，扩增产物)，在随后的延伸阶段期间，被Taq或熟练的技术人员已知的其他适合的聚合酶例如优选的突变体Z05聚合酶的5’到3’核酸外切酶活性降解。结果，激发的荧光部分和猝灭剂部分变得空间上相互分离。结果，不存在猝灭剂的情况下第一荧光部分的激发时，从第一荧光部分发射的荧光可以被检测。在如上所述的两种检测形式中，发射的信号的强度可以与原始的目标核酸分子的
量相关联。作为对FRET的替代，扩增产物可以使用双链DNA结合染料，例如荧光DNA结合染料(例如，STORGREEN I 或STORGOLD (Molecular Probes))来检测。在与双链核酸相互作用时，在用适合波长的光线激发之后，这样的荧光DNA结合染料发射荧光信号。也可以使用双链DNA结合染料例如核酸嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时，通常进行熔解曲线分析用于扩增产物的存在的确认。
分子信标与FRET —起也可以用于利用本发明的实时PCR方法检测扩增产物的存在。分子信标技术利用了用第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分一般是猝灭剂，荧光标记物一般位于探针的各个末端。分子信标技术利用了探针寡核苷酸， 其具有允许二级结构形成(例如，发夹)的序列。作为探针内二级结构形成的结果，当探针处于溶液中时，两个荧光部分在空间上接近。在与扩增产物杂交之后，探针的二级结构被破坏，荧光部分变得相互分离，从而在用适合波长的光线激发之后，可以检测第一荧光部分的发射。因而，在根据本发明的优选的方法中的是利用FRET的如上所述的方法，其中所述探针包含允许二级结构形成的核酸序列，其中所述二级结构形成引起所述第一和第二荧光部分之间空间上的接近。高效的FRET仅当荧光部分直接局部接近时和当供体荧光部分的发射光谱与接受体荧光部分的吸收光谱重叠时发生。因而，在优选的实施方式中，所述供体和接受体荧光部分处在所述探针上相互间不超过5个核苷酸之内。在进一步优选的实施方式中，所述接受体荧光部分是猝灭剂。 如上所述，在TaqMan形式中，在PCR反应的退火步骤期间，标记的杂交探针结合目标核酸(即，扩增产物)，在随后的延伸阶段期间，被Taq或熟练的技术人员已知的其他适合的聚合酶例如优选的突变体Z05聚合酶的5’到3’核酸外切酶活性降解。因而，在优选的实施方式中，在如上所述的方法中，扩增采用了具有5’_到3’_核酸外切酶活性的聚合酶。进一步有益的是小心地选择作为如上所述的方法的结果产生的扩增子的长度。一般地，相对短的扩增子提高扩增反应的效力。因而，本发明的优选的方面是如上所述的方法，其中扩增的片段包括最高达到450个碱基、优选的最高达到300个碱基、进一步优选的最高达到200个碱基以及进一步优选的最高达到150个碱基。本发明中使用的内部对照核酸和/或外部对照核酸可以充当“定量标准核酸”，其倾向于是和被用作定量的参考，即，测定目标核酸的量。为此，一种或更多种定量标准核酸与目标核酸一起经历所有可能的样品制备步骤。此外，定量标准核酸在整个方法中在同一反应混合物中被处理。它必需在存在或缺少目标核酸的情况下都直接或间接地生成可检测信号。“生成”意味着直接或间接地产生。在“可检测信号”的上下文中，“生成”因而可以指“直接地产生”，例如，在发射荧光信号的荧光染料的情况下，或者在“引起”或“诱导”的意义上“间接地产生”，例如，“微生物核酸”通过“标记物”或通过带有“标记物”的核酸探针 “生成” “可检测信号”，标记物例如“荧光染料”。定量标准核酸的浓度必需在每个测试中小心地优化，以免干扰敏感性，但也为了产生例如非常高的目标浓度下的可检测信号。对相应的分析的检测极限(L0D，见下文)而言，“定量标准核酸”的浓度范围优选的是20-5000X L0D，更优选的20-1000X L0D，最优选的20-5000XL0D。反应混合物中的定量标准核酸的终浓度取决于所实现的定量测定范围。“检测极限”或“L0D”是指样品中核酸的最低的可检测量或浓度。低“L0D”相应于高敏感性，反之亦然。“L0D”通常以单位“cp/ml”，特别是如果核酸是病毒核酸，或以IU/ml来表示。“cp/ml”是指“每毫升的拷贝数”，其中“拷贝”是相应的核酸的拷贝。IU/ml代表“国际单位/ml”，是指WHO标准。计算LOD的广泛使用的方法是“概率单位(Probit)分析”，这是分析刺激(剂量)和可数性(全部或全无)反应之间的关系的方法。在典型的可数性反应实验中，动物的组被给予不同剂量的药物。在每个剂量水平下的死亡百分比被记录。这些数据然后可以使用概率单位分析来分析。概率单位模型假定反应百分比与累积正态分布的 log剂量相关。也就是说，log剂量可以用作变量来从累积正态读取死亡百分比。使用正态分布，而不是其他概率分布，影响了可能的剂量的高端和低端处预测的响应率，但是对接近中间处具有很小的影响。概率单位分析可以以独特的“命中率”来应用。如本领域已知的，“命中率”通常以百分比[%]表示，表示在特定被分析物浓度下阳性结果的百分比。因而例如，LOD可以在 95%命中率下测定，这意味着对于其中95%的有效结果为阳性的情况计算L0D。在优选的实施方式中，如上所述的方法提供了 1到100 cp/ml或0. 5到50 IU/ml 的LOD，更优选的1到75 cp/ml或0. 5到30 IU/ml，更优选的1到25 cp/ml或1到20 IU/ ml ο对于来自某些病毒的可能的目标核酸的某些实例，如上所述的方法优选地提供以下的LOD
HIV:最高达到60 cp/ml、更优选的最高达到50 cp/ml、更优选的最高达到40 cp/ml、 更优选的最高达到30 cp/ml、更优选的最高达到20 cp/ml、更优选的最高达到15 cp/ml
HBV:最高达到10 IU/ml、更优选的最高达到7. 5 IU/ml、更优选的最高达到5 IU/ml
HCV:最高达到10 IU/ml、更优选的最高达到7. 5 IU/ml、更优选的最高达到5 IU/ml
WNV I:最高达到20 cp/ml、更优选的最高达到15 cp/ml、更优选的最高达到10 cp/
ml
WNV II 最高达到20 cp/ml、更优选的最高达到15 cp/ml、更优选的最高达到10 cp/ ml、更优选的最高达到5 cp/ml
JEV:最高达到100 cp/ml、更优选的最高达到75 cp/ml、更优选的最高达到50 cp/ ml、更优选的最高达到30 cp/ml
SLEV 最高达到100 cp/ml、更优选的最高达到75 cp/ml、更优选的最高达到50 cp/ ml、更优选的最高达到25 cp/ml、更优选的最高达到10 cp/ml
在下文中描述了如何根据充当定量标准核酸的内部对照核酸在TaqMan形式中进行定量结果的计算的实例滴度根据来自整个PCR运行的仪器校正的荧光值的输入数据来计算。含有目标核酸和充当定量标准核酸的内部对照核酸的一组样品在热循环仪上使用指定的温度分布经历PCR。在PCR分布期间在选定温度和时间，样品由滤光的灯照亮，对每个样品对目标核酸和内部对照核酸采集过滤的荧光数据。在PCR运行完成之后，处理荧光读数来产生内部对照核酸的一组染料浓度数据以及目标核酸的一组染料浓度数据。每组染料浓度数据按相同的方式处理。在几次似真性核对之后，对内部对照核酸和目标核酸计算elbow 值(CT)。elbow值被定义为目标核酸或内部对照核酸的荧光与预定阈值(荧光浓度)交叉的点。滴度测定基于以下假定，目标核酸和内部和/或外部对照核酸以相同的效力被扩增，并且在计算的elbow值下，目标核酸和内部对照核酸的等量的扩增子拷贝被扩增和检测。因此，(CTQS-CT目标)对log (目标浓度/QS浓度)是线性的。在这方面，QS代表定量标准核酸。滴度T然后可以例如使用如下述方程的多项式校准公式的情况来计算 T' = 10 (a (CTQS - CT 目标)2 + b (CTQS - CT 目标)+ c)多项式常量和定量标准核酸的浓度是已知的，因而方程中的仅有的变量是差值 (CTQS-CT 目标)。进一步的，在本发明的意义上，内部对照核酸或外部对照核酸可以充当“定性对照核酸”。“定性对照核酸”对于确认定性检测分析的测试结果的有效性是特别有用的。即使在阴性结果的情况下，必须检测定性对照，不然测试本身被认为是不起作用的。然而，在定性设置中，在阳性结果的情况下不一定要检测它。结果，它的浓度必须是相对低的。这必需小心地适用于相应的分析和它的敏感性。优选地，定性对照核酸的浓度范围包括每个反应1拷贝到每个反应1000个拷贝。相对于相应的分析的检测极限(L0D)，它的浓度优选地处在分析的LOD与LOD的25倍值之间，更优选的在LOD和10XL0D之间。更优选的，它处于2X到IOX LOD之间。再更优选的，它处于5X和10XL0D之间。最优选的，它是5X或 10XLOD。在被来自流体样品以外的来源的核酸交叉污染的情况下，如上所述的结果可能是掺假的，例如，包括假阳性。特别地，前者的实验的扩增物可能促进这样的非期望的作用。最小化核酸扩增的交叉污染作用的一种特定的方法在美国专利No. 5，035，996中描述了。所述方法涉及非常规的核苷酸碱基，例如，dUTP引入到扩增的产物中，将携带的产物暴露于酶和/或物理化学处理来使得产物DNA不能够充当随后的扩增的模板。用于这样的处理的酶是本领域已知的。例如，尿嘧啶-DNA糖基化酶，也称为尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG，将从含有所述碱基的PCR产物中除去尿嘧啶残基。酶处理引起污染的携带PCR产物的降解，用来 “消毒”扩增反应。因而，本发明的优选的方面是如上所述的方法，进一步包括在步骤d.和步骤e之间的步骤
在来自其他样品的交叉污染核酸的扩增产物被酶降解的条件下，用酶处理流体样
P
m ；
灭活所述酶。优选地，所述酶是尿嘧啶-N-糖基化酶。在根据本发明的方法中，优选的是所有步骤是自动化的。“自动化的”是指方法的步骤适合于用设备或机器来进行，所述设备或机器能够很少或没有外部控制或人为影响地运行。仅仅方法的准备步骤需要手动进行，例如，贮藏容器必需装填并放置就位，样品的选择必需由人进行，以及本领域技术人员已知的进一步的步骤，例如控制计算机的操作。设备或机器可以例如，自动地增加液体、混合样品或在特定温度进行孵育步骤。一般地，这种机器或设备是由运行程序的计算机控制的机器人，所述程序中指定了单个的步骤和指令。本发明的进一步的方面是用于扩增可能存在于至少一种流体样品中的目标核酸的分析系统(440)，所述系统包括
包含反应容器的扩增站(405)，所述反应容器包含扩增试剂、纯化的目标核酸和纯化的内部对照核酸，以及水性缓冲液中的至少一种外部对照核酸，
其中所述在水性缓冲液中的至少一种外部对照核酸被包含在与所述纯化的目标核酸不同的容器内。“分析系统”是一种组件例如仪器的布置，所述组件相互作用，最终目的是分析给定的样品。
所述分析系统的优点与上文对于根据本发明的方法描述的相同。本发明的分析系统(440，附图11)是包括用于分离和/或纯化被分析物的模块 (401)的系统(440)。进一步的，系统(440)另外包括用于分析所述被分析物来获得可检测信号的模块(403)。可检测信号可以在相同的模块(401、402、403)中检测，或做为选择，在独立的模块中检测。如在此使用的术语“模块”涉及在分析仪(400)内任何空间上限定的位置。两个模块(401，403)可以由壁分离，或可以是开放地相关的。任何一个模块(401，402， 403)可以自主地控制，或模块(401，402，403)的控制可以与其他模块共享。优选地，所有模块被中央地控制。模块(401，402，403)之间的转移可以是人工的，但优选的是自动化的。因而，自动化分析仪(400)的许多不同的实施方式被本发明涵盖。本发明的优选的方面是如上所述的分析系统，进一步包括
包含固相支持物材料的分离站，所述分离站被构建和布置以分离和纯化所述至少一种流体样品中包含的核酸。“分离站”是上文描述的。“扩增站”包括用于孵育至少两个反应容器的内容物的温度控制的孵化器。它进一步包括各种反应容器，如试管或平板，在其中发生用于样品分析的反应，例如PCR。这样的容器的外界限或壁是化学惰性的，从而它们不影响其内发生的扩增反应。为了便于操作和简化自动化，优选的是在整合的装置中组合至少两个反应容器，从而它们可以一起被操作。因此，本发明的优选的方面是如上所述的分析系统，其中至少两个反应容器被组合在整合的装置中。整合的装置可以是，例如，小瓶或试管，其可逆地或不可逆地相互附着或排列在支架上。优选地，整合的装置是多孔平板。因此，本发明的优选的方面是如上所述的分析系统，其中所述整合的装置是多孔平板，所述在水性缓冲液中的至少一种外部对照核酸被包含在与所述纯化的目标核酸不同的反应孔中。如在根据本发明的方法的上下文中描述的，在某些实施方式中，优选的是包括如上文定义的阴性对照。因此，本发明的优选的方面是如上所述的分析系统，其中所述扩增站进一步包括处在与所述纯化的目标核酸不同的容器中的阴性对照以及所述水性缓冲液中的外部对照核酸。在本发明的进一步优选的方面中，所述阴性对照是充当所述外部对照核酸的流体基质的相同的缓冲液。在另一个优选的实施方式中，所述阴性对照是水。优选地，所述多孔平板被约束在保持站中。在更优选的实施方式中，一个处理机将多孔容器从保持站转移到气锁(460)，第二个处理机将所述多孔平板从所述气锁转移到所述扩增站，其中两个处理机都与所述多孔平板通过成锁相互作用来作用。在优选的实施方式中，所述分析系统是完全自动化的。在一个实施方式中，组合在整合的装置中的至少两个反应容器在系统的站之间转运。在第二实施方式中，纯化的目标核酸从所述分离站转移到所述扩增站。优选地，包含具有附着的吸移管尖端的吸移管的移液器将包含纯化的核酸的液体转移。
在第三实施方式中，纯化的核酸从所述分离站转移到保持站中约束的整合的装置的反应容器中。优选地，整合的装置中的所述反应容器然后从所述保持站转移到所述扩增站。根据本发明的分析系统优选地进一步包含吸移单元。所述吸移单元包括至少一个吸移管，优选地多个吸移管。在优选的实施方式中，所述多个吸移管组合到一个或更多个整合的装置中，在其中吸移管优选地可以独立地操作。本发明的情境中使用的吸移管优选地是包含上文描述的吸移管尖端的吸移管。在另一个优选的实施方式中，所述吸移管是吸移针头。做为选择，用于分离站中样品制备的、以及含有包含纯化的目标核酸的流体的反应容器或反应容器装置可以从分离站转移到扩增站。为此，根据本发明的分析系统优选地进一步包括转移单元，所述转移单位优选地包含机器人设备，所述设备优选地包含处理机。由于根据本发明的方法的情境中的上述原因，以下的是本发明的进一步优选的方面。·如上所述的分析系统(440)，其中至少一个反应容器包含RNA目标核酸和DNA目标核酸。·如上所述的分析系统(440)，其中至少一个反应容器包含RNA目标核酸，至少一个其他反应容器包含DNA目标核酸。优选地，如上所述的分析系统(440)进一步包含选自以下构成的组的一个或更多个元件
用于检测被分析物引起的信号的检测模块(403) 封闭器(410)
用于试剂和/或用完可弃物的存储模块(1008)。·用于控制系统部件的控制单元(1006)。“检测模块”(403)可以是例如用于检测扩增操作的结果或效果的光学检测单元。 光学检测单元可以包括光源，例如，氙灯、光学器件例如反光镜、透镜，光学滤波器，用于导引和过滤光线的光纤，一个或更多个参考通道，或CCD照相机或不同的照相机。“密封器”(410)被构建和布置以封闭与根据本发明的分析系统有关的任何容器。 例如，这样的封闭器可以封闭具有合适的盖子的试管，或具有箔的多孔平板，或其他适合的封闭材料。“储存模块”(1008)保存必需的试剂来实现对流体样品的分析重要的化学或生物反应。它还可以包括对本发明的方法有用的进一步的部件，例如，用完可弃物，例如吸移管尖端或用作分离站和/或扩增站内的反应容器的容器。优选地，根据本发明的分析系统进一步包含用于控制系统部件的控制单元。这样的“控制单元”(1006)可以包括软件，所述软件用于确保所述分析系统的不同部件正确地和以正确的时机工作和相互作用，例如，以协调的方式移动和操纵部件如吸移管。控制单元还可以包括运行实时操作系统(RTOS)的处理器，其是用于实时应用的多任务处理操作系统。换句话说，系统处理器能够控制实时约束，即，从事件到系统反应的运行的最后期限而不考虑系统负载。它实时地控制系统内的不同的单元运作和根据给定的指令正确地响应。在优选的实施方式中，本发明涉及用于处理被分析物的分析系统(440)，包括
a.第一位置，其包含，以直线排列的包含液体样品(1010)的第一接受器(1001)，包含以nXm排列用于保持液体样品(1011)的接受器(103)的处理平板(101)，包含以直线排列的至少两个吸移单元(702)的第一吸移设备(700)，其中所述吸移单元(702)与吸移管尖端 (3，4)和尖端支架(70)偶联，所述尖端支架包含以轴线(nXm)排列的吸移管尖端(3，4)；
b.第二位置，其包含，用于所述处理平板(101)的夹持器(201,1 )，用于多孔平板的夹持器(330)，用于所述尖端支架(70)的夹持器(470)以及第二吸移设备(35)，所述第二吸移设备(35)包含以nXm排列的吸移单元(702)，用于偶联吸移管尖端(3，4)(附图12)。如在此使用的术语“夹持器”涉及能够接受支架或处理平板的任何装置。本发明的分析系统(440)的优点是对本发明的方法如上所述的。优选地，第一吸移设备(700)的所述吸移单元(702)的位置是可变的。所述第一吸移设备(700)的优选的实施方式在下文中描述。在一个实施方式中，尖端支架(70)包含处于轴线(nXm)装置的吸移管尖端(3， 4)。优选地，第一类型(4)和第二类型(3)的吸移管尖端被包括在尖端支架(70)中。在这种实施方式中，第一类型的吸移管尖端(4)布置在nXm排列中，第二类型的吸移管尖端(3) 布置在ηXm排列中。在这方面，“η”代表行的数目，“m”代表列的数目，其中η优选地是6， m优选地是8。更优选的，第一类型的吸移管尖端(4)具有与第二类型的吸移管尖端(3)不同的体积，最优选的，第一类型的吸移管尖端(4)的体积是大于500 μ 1，第二类型的吸移管尖端(3)的体积是小于500 μ 。在这个实施方式中，a=2.然而，使用超过两种类型的吸移管尖端的本发明的实施方式，因而a>2也被包括在本发明中。在一个方面，本发明的分析系统(440)包括用于将样品类型和单个的测试分配到所述处理平板(101)的各个位置上的控制单元(1006)。优选地，所述位置是独立的格子 (401，402)。在本发明的一个方面中，所述系统另外包含转移系统(480)，用于在第一(402)和第二(401)位置之间转移所述处理平板(101)和所述支架(70)。所述转移系统(480)的优选的实施方式是传送带，或更优选的，一个或更多个处理机。此外，优选地，所述第二吸移设备(35)的所述吸移单元啮合到在第一位置(402) 中使用的吸移管尖端(3，4)。本发明的系统(440)的优选的实施方式另外包括第三站(403)，其包含用于孵育所述被分析物和获得可检测信号必需的试剂的温度控制的孵化器。这个系统的进一步优选的实施方式在下文中描述。样品和测试物到nXm排列的分配的更优的控制使用第一处理器(1004)和第二处理器(1005)实现，第一处理器被包括在所述第一位置(402)中，所述控制单元(1006)向其发送指令用于将样品类型和各个的测试物分配到处理平板(101)的容器(103) WnXm 排列中的特定位置上，第二处理器(1005)被包括在所述第二位置(401)中，所述控制单元(I006)向其发送指令用于将样品类型和各个的测试物分配到处理平板的容器(103)的 ηXm排列中的特定位置上。优选地，所述系统另外包含位于所述第一位置中的第一处理器和位于所述第二位置中的第二处理器。更优选的，所述第一处理器(1004)控制所述第一吸移设备(700)，所述第二处理器(1005)控制所述第二吸移设备(35)。本发明的进一步优选的方面是包含超过一种外部对照核酸的如上所述的方法或分析系统。在这样的实施方式中，单个流体样品或多个不同的流体样品中可能含有的多种不同的目标核酸可以有益地被分析。例如，所述外部对照核酸可以被设计为具有与相应的目标核酸相似或相同序列的目标特异性对照核酸。设计目标特异性外部对照核酸的方法是本领域的技术人员已知的。根据本发明的分析系统的所有其他优选的实施方式和实施方式的具体描述是对于根据本发明的方法所提及的那些。附图的简要说明附图1
本发明的实施方式中使用的样品制备工作流程的示意性的描述。指向下的箭头表示成分或试剂向上述深孔平板的每个相应反应孔添加，向上的箭头表示它们的相应的移除。这些动作在步骤2、3、4、21和22中人工地进行，在步骤10、14、 16,18和M中通过装置的处理头，以及在步骤5、6、7、11、15和19中通过装置的试剂头进行。要理解的是，使用的体积可以在本发明的精神内灵活地调整，优选地至少约最高达到所公开值的30%。特别地，对于步骤2来说，样品体积优选地是可变的，以考虑不同类型的流体样品，其可能需要或多或少的起始材料来获得适当的结果，这是技术人员已知的。 优选地，范围是约100 μ 1到约850 μ L·更优选的，它是约100 μ 1，约500 μ 1或约850 μ 。优选地，相应的容器中的体积在步骤3中用稀释剂调节到相同的总体积。优选地，如附图1中显示的方案中的，总体积添加最高达到约850 μ 1。附图2a
在NHP中HIV的PCR生长曲线。附图2b
在水性缓冲液中HIV的PCR生长曲线。附图2c
在NHP中HCV的PCR生长曲线。附图2d
在水性缓冲液中HCV的PCR生长曲线。附图Ie
在NHP中HBV的PCR生长曲线。附图2f
在水性缓冲液中HBV的PCR生长曲线。附图3 处理平板的透视图。附图4 从对角的处理平板的透视图。附图5 处理平板的上视图。附图6
沿着处理平板的较长的侧面的剖视图。附图7
剖视图的局部视图。附图8
沿着处理平板的较长的侧面的透视图。附图9
a)到d)显示了磁性分离站的第二实施方式的不同视角。附图10
(a)到(c)显示了保持处理平板的磁性分离站的第一实施方式的视图，第一类型的磁体处于最高的Z位置，第二类型的磁体处于最低的Z位置。附图11
包含不同的站、模块或格子的分析仪的示意图。附图12
显示了本发明的分析系统。
实施例以下实施例描述了本发明工作的实施方式。本领域的技术人员清楚的是，这些实施例不是限制性的，可以被修改而不脱离本发明的精神。实施例1
这个实施例描述了分离、扩增和检测目标核酸的方法，所述方法涉及水性缓冲液中的外部对照核酸。简言之，在描绘的实施方式中，对三种不同的病毒目标核酸HIV、HBV和HCV在相同的条件下进行实时PCR。对于所有目标，使用标准的材料。适合的标准物或其他类型的目标是熟练的技术人员可获得的。根据相应厂家的说明书使用以下表中列出的仪器
权利要求
1.一种分离、扩增和检测至少一种流体样品中可能存在的至少一种目标核酸的方法， 所述方法包括自动化步骤a.向所述流体样品添加内部对照核酸；b.在足以允许包含所述目标核酸的核酸以及所述内部对照核酸固定在固相支持物材料上的时间段和条件下，将固相支持物材料和所述流体样品在容器中组合在一起；c.在分离站中从所述流体样品中存在的其他材料中分离出所述固相支持物材料；d.在所述分离站中纯化所述核酸以及用洗涤缓冲液洗涤所述固相支持物材料一次或更多次；e.使至少第一容器中的纯化的目标核酸和纯化的内部对照核酸，以及至少第二容器中水性缓冲液中的至少一种外部对照核酸与一种或更多种扩增试剂接触；f.在足以发生指示所述目标核酸和所述对照核酸的存在或不存在的扩增反应的时间段和条件下，在所述反应容器中孵育所述纯化的目标核酸、所述纯化的内部对照核酸和所述在水性缓冲液中的至少一种外部对照核酸与所述一种或更多种扩增试剂，其中步 骤e到f中扩增的条件对于所述纯化的目标核酸、所述内部对照核酸和所述在水性缓冲液中的至少一种外部对照核酸是相同的。
2.前述权利要求的任一项的方法，其中所述水性缓冲液具有6-12的pH值并包含 Tris 1-100 mM EDTA 0. 01-1 mM 叠氮化钠0. 005-0. 5% (w/v) Poly (rA) RNA 1-200 mg/1。
3.权利要求2的方法，其中所述水性缓冲液具有约8的pH值并包含 Tris 10 mM EDTA 0. 1 mM 叠氮化钠0. 05% (w/v) Poly (rA) RNA 20 mg/1。
4.权利要求1的方法，其中阴性对照经历步骤a之后的所有步骤。
5.前述权利要求的任一项的方法，其中所述在水性缓冲液中的至少一种外部对照核酸经历步骤a之后的步骤。
6.前述权利要求的任一项的方法，其中至少一种流体样品是临床样品。
7.前述权利要求的任一项的方法，进一步包括以下步骤g.测定所述目标核酸的量。
8.一种用于扩增可能存在于至少一种流体样品中的目标核酸的分析系统(440)，所述系统包括 包含反应容器的扩增站，所述反应容器包含扩增试剂、纯化的目标核酸和纯化的内部对照核酸，以及水性缓冲液中的至少一种外部对照核酸，其中所述在水性缓冲液中的至少一种外部对照核酸被包含在与所述纯化的目标核酸不同的容器内。
9.权利要求8的分析系统，进一步包括 包含固相支持物材料的分离站，所述分离站被构建和布置以分离和纯化所述至少一种流体样品中包含的核酸。
10.权利要求8或9的任一项的分析系统，其中所述扩增站包含的所述反应容器被布置为整合的装置。
11.权利要求10的分析系统，其中所述整合的装置是多孔平板，所述在水性缓冲液中的至少一种外部对照核酸被包含在与所述纯化的目标核酸不同的反应孔中。
12.权利要求8到11的任一项的分析系统，其中所述扩增站进一步包括处在与所述纯化的目标核酸不同的容器中的阴性对照以及所述水性缓冲液中的外部对照核酸。
13.权利要求12的分析系统，其中所述阴性对照是充当所述外部对照核酸的流体基质的相同的缓冲液。
14.权利要求8到13的任一项的分析系统，进一步包括选自以下构成的组的一个或更多个元件 用于检测被分析物引起的信号的检测模块 封闭器 用于试剂和/或用完可弃物的存储模块 用于控制系统部件的控制单元。
15.权利要求1到7的任一项的方法，或权利要求8到14的任一项的分析系统，包含超过一种外部对照核酸。
全文摘要
本发明属于体外诊断的领域。在这个领域内，特别地涉及利用水性缓冲液中用于定性和/或定量目的的内部对照核酸以及至少一种外部对照核酸，对可能存在于至少一个流体样品中的至少第一目标核酸的扩增。它进一步提供了分析系统，其包含用于定性和/或定量目的的内部对照核酸以及水性缓冲液中的至少一种外部对照核酸。
文档编号C12M1/36GK102559875SQ20111042296
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月16日 优先权日2010年12月17日
发明者A.韦尔费尔施奈德, D.齐默曼, E.鲁斯曼, M.艾克霍夫 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司