专利名称：一种禾谷镰刀菌的分子检测方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于作物病害诊断及防治技术领域，具体涉及一种禾谷镰刀菌的分子检测方法及应用。
二.
背景技术：
由镰刀菌(Fusarium spp.) (Fusarium head blight,FHB)引起的小麦赤霉病是一种广泛流行的世界性病害，主要发生于温暖湿润地区，是影响小麦高产、稳产和优质的重要因素之一。20世纪90年代以来，北美、欧洲、亚洲等地大麦、小麦赤霉病灾情严重。我国南方长江中下游冬麦区发生严重，随着全球性气候变暖、耕作制度以及耕作方式的改变，小麦赤霉病正向黄淮麦区、北方麦区以及西南和西北麦区扩展(Ma等，2008)，几乎蔓延到所有小麦种植区。2003年，长江中下游地区60-80%的麦区感染赤霉病，减产超过20%。2005 年，江苏省赤霉病的发生面积为1800万亩左右，占全省总种植面积的72%。2011年，全国农业技术推广服务中心预报全国赤霉病流行面积为6500万亩。小麦赤霉病的发生与流行还带来巨大的食品安全性隐患。镰刀菌可以产生单端孢霉烯毒素(trichothecene)，人畜食用受赤霉病真菌毒素污染的面粉会发生呕吐、腹泻及食欲不振等急、慢性中毒症状，严重者可导致死亡(陆维忠等，2001)。据美国估计，因此类毒素污染所造成的直接经济损失仅1991 1996年间就高达三亿美元。我国、欧盟和美国、加拿大均要求面粉、面包、饼干等食品中DON毒素的限量标准为1000 μ g/kg(Ippm) (Buerstmayr等，2009 ;GB 163四_1996)。因此，明确我国小麦赤霉病致病菌的种类与产毒类型，对开展小麦赤霉病防治与抗病育种都有重要的实践意义。自20世纪40年代中国首次报道小麦赤霉病以来，国内外研究认为，禾谷镰刀菌 (Fusarium graminearum Schwabe)是小麦赤霉病的主要致病菌之一，也是中国小麦赤霉病的优势致病菌。近年来的研究表明，F. graminearum是一个含有许多特定种系的复合种(Fg Complex)，0’Donnell等(2004,2007)通过系统发生学分析，将Fg Complex划分成13个特定的正式命名的种。根据该项研究结果，目前中国小麦赤霉病的致病菌，主要为禾谷镰刀菌 (F. graminearum)和亚细亚镰刀菌(F. asiaticum)，其中北方麦区如西北麦区和东北麦区， 年平均温度低于15°C时，麦区赤霉病的优势致病菌为禾谷镰刀菌(Qu等，2008)。因此，快速、准确鉴定检测禾谷镰刀菌，有利于对北方麦区小麦赤霉病的防治。传统的镰刀菌鉴定方法主要通过形态学，如大分子生孢子、小分生孢子、原膜孢子等的形态来鉴定。但形态学鉴定方法繁琐，没有统一的规范标准，并且需要丰富的实践经验。随着遗传与分子生物学技术的迅速发展，分子标记也成为鉴定镰刀菌的主要技术手段。 与常规的形态鉴定法相比，分子标记能准确、快速地从混合群体中鉴定出不同病菌类型，为准确、快速分析病菌的群体分布、特点和鉴定诊断提供新方法。Nicholson等(1998)找到了一对鉴定禾谷镰刀菌的标记Fgl6F/R，但在扩增来自不同地区的禾谷镰刀菌株时得到6种PCR产物，不能有效地区分菌株的种类。011等Q008) 利用该对引物，并结合AFLP标记，鉴定出Fgl6F/R扩增产物为类型1和AFLP扩增产物为类型A的菌株为禾谷镰刀菌。由于AFLP标记操作繁琐，且涉及到酶切和两次PCR扩增等步骤， 难以在实际检测中推广应用。Yang等O008)利用氨连接酶基因的单核苷酸多态性(SNP) 设计了 4个引物试图来区分Fgcomplex中的七个种，其中鉴定禾谷镰刀菌需要扩增出536bp 和311bp等2条不同大小的条带，并且还需要通过条带的强弱进行辅助判断，并不能真正满足快速简易检测的要求。
三.
发明内容
本发明需要解决的问题是提供有效而容易获得的方法鉴定禾谷镰刀菌，使之可以直接从麦穗、种子、饲料中快速、灵敏、准确检测出赤霉病致病菌禾谷镰刀菌。本发明的技术方案为1.设计禾谷镰刀菌检测的特殊引物。2.禾谷镰刀菌检测体
系的建立。1.设计禾谷镰刀菌检测的特殊引物。根据禾谷镰刀菌DNA序列的特性，设计了对禾谷镰刀菌具有特异扩增作用的一对引物引物 15 ‘ -GAGTCCAAACCGGATACGTCACGCT-3 ‘和引物 25 ‘ -TGCGTACGAATTGCAGAAGATG TCC-3 ‘。2.禾谷镰刀菌检测体系的建立。a)提取病原菌基因组DNA ；b) PCR 反应体系 20 μ L，包括 DNA 10-20ng,2y L 10 X buffer, 1. 6μ L 2. 5mmol/ LdNTP, 1. 2μ L 25mmol/L MgCl2, 2. 5 μ mol/L 引物 1 禾口 2 各 2 μ L，1. OU Taq 酶，ddH20 补齐至 20 μ L ；PCR扩增条件为第一循环95°C预变性5min ；然后95°C变性45sec，6(TC退火30sec， 72°C延伸45sec，共35个循环；最后一个循环为72°C延伸lOmin，完成扩增，扩增产物4°C保存；c)PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中用IXTAE缓冲液中电泳分析，电压为4-5V/ cm,电泳分离30min，经溴化乙锭染色后用凝胶成像系统分析；d)311bp处出现特异条带，说明该病原菌为禾谷镰刀菌。本发明的效果是本发明利用一对特异性很高的PCR引物，通过基本的PCR操作，利用PCR扩增产物的有无，鉴定我国北方麦区小麦赤霉病的优势致病菌禾谷镰刀菌，提供了一种直接从麦穗、种子、饲料中快速、准确、操作简易的禾谷镰刀菌检测方法。与现有的禾谷镰刀菌检测方法相比，本发明的有益效果在于1.采用一对引物进行PCR扩增，操作步骤少，操作方法简单；2. PCR扩增产物为一个特异性产物，不需要通过几个产物或者多条条带来鉴定菌株，利用本方法，能扩增出产物的即为禾谷镰刀菌，扩增不出的即为其他菌株，测定结果简单明了 ；3.本方法所需的DNA量较少，10-20ng的DNA即可检测到结果，以确保从麦穗、种子、饲料中检测出禾谷镰刀菌。
四.
附图1 对已知种型的菌株的PCR扩增鉴定结果M 分子量标准 50bp ； 1-5 泳道，禾谷镰刀菌株:w316, w346, B156, B592, B755 ；6-10 泳道，禾谷镰刀菌株:Fg820, M101, M83，M129，G12附图2 对中国采集菌株的PCR扩增鉴定结果
M 分子量标准 IOObp ；1-12 泳道，亚细亚镰刀菌株:0901，0914，0919，0920，0922， 0923,0924,0925,0950,0968,0978, 2S11 ；13-24 泳道，禾谷镰刀菌株:0938,0943,0956, 0966,0822, Kll，2E22，2041，0825，2022，2R51，R82附图3 对不同小麦产区麦粒的PCR扩增鉴定结果M 分子量标准IOObp ； 1-20泳道，江苏泰州麦区(1_3)，安徽六安麦区，河南商城麦区(7-10)，湖北武汉麦区(11-13)，福建建阳麦区(14-16)，四川广汉麦区(17-20) 采集的病麦粒；21-40泳道，江苏淮安麦区01-23)，安徽合肥麦区0446)，河南桐柏麦区 07-30)，湖北襄樊麦区(31-33)，黑龙江哈尔滨麦区(34-36)，宁夏贺兰麦区(37-40)采集的病麦粒
五.
具体实施例方式实施例1 已知种型的菌株的PCR扩增鉴定结果1.菌株的DNA提取亚细亚镰刀菌株由湖北省农业科学院植保土肥研究所喻大昭研究员提供，禾谷镰刀菌由荷兰国际植物研究所Lee博士提供。分别挑取各菌株的菌丝在PDA培养基(去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml)上，培养3天，挑取新鲜菌丝用液氮冻干并研磨粉碎用CTAB法(Siang，2004)提取DNA。取10_20ngDNA加入到PCR反应体系中。2.特异性引物的合成上游引物5‘ -GAGTCCAAACCGGATACGTCACGCT-3 ‘下游引物5‘ -TGCGTACGAATTGCAGAAGATGTCC-3 ‘由上海生工公司合成3. PCR扩增反应及扩增程序反应体系20 μ L，包括 DNA 10-20ng, 2 μ LlO Xbuffer, 1. 6 μ L2. 5mmol/L dNTTP, 1. 2μ L 25mmol/L MgCl2, 2. 5 μ mol/L 上游及下游引物各 2 μ L，1. OU Taq 酶，ddH20 补齐至 20 μ L ；PCR扩增条件为第一循环95°C预变性5min ；然后95°C变性45sec，6(TC退火30sec， 72°C延伸45sec，共35个循环；最后一个循环为72°C延伸lOmin，完成扩增，扩增产物4°C保存。4. PCR扩增产物的鉴定取8μ L PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中用IXTAE缓冲液中电泳分析，电压为 4-5V/cm,电泳分离30min，经溴化乙锭染色后用凝胶成像系统分析扩增产物的大小判断结^ ο实施结果禾Ij用本发明的特异性引物，以已知种型的菌株为模板，PCR扩增结果如图1，1-5泳道扩增不出禾谷镰刀菌特异性条带，在6-10泳道扩增出禾谷镰刀菌特异性条带311bp，与已知结果相符合。实施例2 对中国采集菌株的PCR扩增鉴定结果1.菌株的DNA提取菌株采集自中国8个省、自治区(表1)。菌株的DNA提取、特异性引物的合成、PCR 扩增反应及扩增程序、PCR产物的鉴定同实施例1。
实施结果利用本发明的特异性引物，以中国采集的菌株为模板，PCR扩增结果如图2，在 1-12泳道扩增不出禾谷镰刀菌特异性条带，13-M泳道扩增出禾谷镰刀菌特异性条带 311bp，与用其他鉴定方法获得的结果相符合。表1本发明所采用的中国采集的镰刀菌菌株
菌株编号种型来源寄主菌株编号种型来源寄主0901Kasiciticum建阳福建小麦0938F. gr amine arum桐柏河南小麦0914Kasiciticum六安安徽小麦0943Kgraminearum固始河南小麦0919Easiciticum东台江苏小麦0956Kgraminearum襄樊湖北小麦0920Kasiciticum盐城江苏小麦0966F.gramiriearum合肥安徽小麦0922Fasiaticum扬州江苏小麦0822F. gr amine arum克山黑龙江小麦0923Kasiciticum泰州江苏小麦KllF.gramiriearum淮安,江苏小麦0924Easiciticum通州江苏小麦2E22F.gramiriearum阜阳,安徽小麦0925Kasiciticum信阳河南小麦2041F.gramiriearum银川,宁夏小麦0950Easiciticum襄樊湖北小麦0825F.gramiriearum哈尔滨，黑龙江小麦0968Kasiciticum泌阳河南小麦2022F.gramiriearum贺兰,宁夏小麦0978Kasiaticum潢川河南小麦2R51F.gramiriearum哈尔滨，黑龙江小麦2S11Easiciticum广汉四川小麦R82F.gramiriearum确山,河南小麦实施例3 对不同小麦产区麦粒的PCR扩增鉴定结果1.麦粒的DNA提取小麦麦粒分别采集自中国的江苏省泰州和淮安麦区，安徽省六安和合肥麦区，河南省商城和桐柏麦区，湖北省襄樊和武汉麦区，福建建阳麦区，四川广汉麦区，黑龙江哈尔滨麦区和宁夏贺兰麦区。取病麦粒，用液氮冻干并研磨粉碎，用CTAB法GhangJO(M)提取 DNA。取40-50ngDNA加入到PCR反应体系中。特异性引物的合成、PCR扩增反应及扩增程序、PCR产物的鉴定同实施例1。实施结果利用本发明的特异性引物，以中国麦区采集的麦粒为模板，PCR扩增结果如图3， 在1-20泳道扩增不出禾谷镰刀菌特异性条带，21-40泳道扩增出禾谷镰刀菌特异性条带 311bp，与用其他鉴定方法获得的结果相符合。
权利要求
1.一种禾谷镰刀菌的分子检测方法，其特征在于由以下步骤构成(1)禾谷镰刀菌检测的特殊引物设计，根据禾谷镰刀菌DNA序列的特性，设计了对禾谷镰刀菌具有特异扩增作用的一对引物上游引物5' -GAGTCCAAACCGGATACGTCACGCT-3‘和下游引物 5 ‘ -TGCGTACGAATTGCAGAAGATGTCC-3 ‘；(2)禾谷镰刀菌检测体系的建立，提取病原菌基因组DNA;PCR反应体系20 μ L，包括 DNA 10-20ng, 2μ L 10Xbuffer, 1. 6μ L 2. 5mmol/L dNTP, 1. 2μ L 25mmol/L MgCl2， 2. 5μπι01/1上游及下游引物各2yL，1.0 U Taq酶，(MH2O补齐至20 μ L ;PCR扩增条件为第一循环95°C预变性5min ；然后95°C变性45sec，60°C退火30sec，72°C延伸45sec，共 35个循环；最后一个循环为72°C延伸10 min，完成扩增，扩增产物4°C保存；PCR扩增产物在洲琼脂糖凝胶中用Γ TAE缓冲液中电泳30min，电压为4-5V/cm，电泳结束后用凝胶成像系统分析；311bp处出现特异条带，说明该病原菌为禾谷镰刀菌。
2.2.权利要求1所述禾谷镰刀菌的分子检测方法在禾谷镰刀菌的鉴别或禾谷镰刀菌在农作物或饲料污染监控中的应用。
全文摘要
本发明属于作物病害诊断与防治技术领域，具体涉及一种禾谷镰刀菌的分子检测方法及应用。该方法利用自行设计的一对PCR特异扩增引物，可从中国和国外采集到的镰刀菌中检测分离得到禾谷镰刀菌的特异片段，该片段全长为311bp。本发明可直接从麦穗、种子、饲料中快速、灵敏、准确检测出赤霉病致病菌禾谷镰刀菌。
文档编号C12R1/77GK102382899SQ201110428400
公开日2012年3月21日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者余桂红, 周永进, 孙晓波, 张旭, 王磊, 陈健华, 马鸿翔 申请人:江苏省农业科学院