专利名称：离子交换层析纯化制备人轮状病毒灭活疫苗的方法
技术领域：
本发明属于制备病毒灭活疫苗的方法，特别是制备人轮状病毒灭活疫苗的方法。
背景技术：
轮状病毒(Rotavirus，RV )是引起婴幼儿病毒性腹泻最主要的病原体。由于没有特异性的治疗方法，疫苗预防接种就成为最经济有效的方法，但目前使用的减毒活疫苗在预防轮状病毒感染中仍存在ー些问题。因此，实现医疗目的使用的注射用灭活轮状病毒疫苗有其特殊的意义。近期相关文献轮状病毒的纯化一般采用CsCl密度梯度离心或者蔗糖密度梯度离心的方法来获取高纯度的病毒颗粒，“氯化铯密度梯度离心纯化轮状病毒” (文喻玲，赵庆欢，于洋，陈元鼎.中华现代内科学杂志.2005年第3期.第195-197页)、
immunogenicity of a thermally inactivated rotavirus vaccine m mice" (Baommg Jiang, Yuhuan Wang, Jean-Francois Saluzzo, et al. Human Vaccines. 2008 March/ April ；4 (2):143-147.)但是，前者CsCl密度梯度离心对设备要求较高、成本昂贵；后者在蔗糖介质中离心会对病毒颗粒造成损伤，易导致病毒丧失感染性，且由于蔗糖的高度黏稠和高滲透性会对细胞产生毒性，在样品进行感染性滴度分析前还需要将其除去。除上述问题外，两种方法操作繁琐、费时，其纯化不易于放大，均处于用于实验室研究规模。
发明内容
本发明采用超滤浓缩结合液相色谱的技术路线纯化人轮状病毒，_在提供ー种操作简便，易于エ业化放大，且保证纯化产物的总蛋白去除率、抗原回收率、抗原性和免疫原性均具有较好的效果，适宜作为人轮状病毒灭活疫苗生产的ー种纯化工艺。本发明的目的是通过以下方式实现，包括以下步骤
(1)病毒液的制备和浓縮
在Vero細胞上进行病毒扩增，规模化培养45个转瓶，细胞为致密单层时种毒，细胞密度为1. 33 X IO5个细胞/cm2 X 850cm2/转瓶=1. 1 X IO8个细胞/转瓶；当病毒増殖72h时收获病毒，经反复冻融3次后，SOOOrpm离心20min取上清液收获得到9. 8L含有病毒颗粒的病毒原液，病毒原液蛋白含量介于600ug/mL 700ug/mL，病毒感染性滴度为4. 01gCCID50 /mL以上；用截留分子量为IOOKDa的切向流超滤系统将9. 8L病毒原液超滤浓缩36倍至 0. 27L,以备进入步骤(2);
(2)病毒的纯化
(a) Q Sepharose Fast Flow(简称QFF)离子交換层析纯化
取20 ml病毒浓缩液以2ml/min的流速加入预先用10mM、pH 7. 60之PBS平衡好的装有QFF填料的层析柱中，继续用10mM、pH 7. 60之PBS以2ml/min的流速过柱，直至在QFF 离子交換层析图谱OD^Onm处无吸收峰出现后开始洗脱，洗脱采用lmol /L NaCl洗脱大于 5倍柱体积时间，收集洗脱时OMSOnm处吸收峰的样品，其中，洗脱峰1为主要病毒抗原峰， 收集后-80°C保存备用；(b)纯化洗脱峰的透析脱盐
将步骤(a)的洗脱峰样品装入预先处理好的透析袋中，之后将透析袋置于装有10mM、 pH7. 20之PBS的玻璃容器内，磁力搅拌器搅拌，透析袋旋转速度为60 80次/min，4°C透折Mh，每他更换一次玻璃容器内的缓冲液，经透析后的样品为澄清溶液，pH 7. 0 7. 40 ； (3)除菌过滤和灭活
用0.22 ym滤器过滤纯化的病毒液，过滤后的病毒液按1:4000的比例加入福尔马林，先置于56°C灭活半小吋，之后置于37°C灭活72小吋，双抗体夹心ELISA检测灭活后的纯化轮状病毒抗原含量和免疫原性，灭活后抗原量应不低于20480EU/ml。
所述方法进ー步是检测纯化前后感染性滴度、抗原量及总蛋白去除率，包括 用荧光灶法測定病毒纯化前后感染性滴度和抗原量如表1 表1纯化前后病毒样品的感染性滴度和抗原量检测结果
权利要求
1.离子交換层析纯化制备人轮状病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤(1)病毒液的制备和浓縮在Vero細胞上进行病毒扩增，规模化培养45个转瓶，细胞为致密单层时种毒，细胞密度为1. 33 X IO5个细胞/cm2 X 850cm2/转瓶=1. 1 X IO8个细胞/转瓶；当病毒増殖72h时收获病毒，经反复冻融3次后，SOOOrpm离心20min取上清液收获得到9. 8L含有病毒颗粒的病毒原液，病毒原液蛋白含量介于600ug/mL 700ug/mL，病毒感染性滴度为4. 01gCCID50 /mL以上；用截留分子量为IOOKDa的切向流超滤系统将9. 8L病毒原液超滤浓缩36倍至 0. 27L,以备进入步骤(2);(2)病毒的纯化(a)Q Sepharose Fast Flow(简称QFF)离子交換层析纯化取20 ml病毒浓缩液以2ml/min的流速加入预先用10mM、pH 7. 60之PBS平衡好的装有QFF填料的层析柱中，继续用10mM、pH 7. 60之PBS以aiil/min的流速过柱，直至在QFF 离子交換层析图谱OD^Onm处无吸收峰出现后开始洗脱，洗脱采用lmol /L NaCl洗脱大于 5倍柱体积时间，收集洗脱时OMSOnm处吸收峰的样品，其中，洗脱峰1为主要病毒抗原峰， 收集后-80°C保存备用；(b)纯化洗脱峰的透析脱盐将步骤(a)的洗脱峰样品装入预先处理好的透析袋中，之后将透析袋置于装有10mM、 pH7. 20之PBS的玻璃容器内，磁力搅拌器搅拌，透析袋旋转速度为60 80次/min，4°C透折Mh，每他更换一次玻璃容器内的缓冲液，经透析后的样品为澄清溶液，pH 7. 0 7. 40 ；(3)除菌过滤和灭活用0.22 ym滤器过滤纯化的病毒液，过滤后的病毒液按1:4000的比例加入福尔马林，先置于56°C灭活半小吋，之后置于37°C灭活72小吋，双抗体夹心ELISA检测灭活后的纯化轮状病毒抗原含量和免疫原性，灭活后抗原量应不低于20480EU/ml。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是检测纯化前后感染性滴度、抗原量及总蛋白去除率，包括用荧光灶法測定病毒纯化前后感染性滴度和抗原量如表1 表1纯化前后病毒样品的感染性滴度和抗原量检测结果
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是检测纯化过程中病毒液的SDS-PAGE和 Western-blot =SDS-PAGE结果显示，与超滤浓缩液相比，QFF纯化目的峰样品蛋白条带数明显减少，未见明显杂蛋白条带；相对应的Western-blot结果显示，蛋白条带为轮状病毒特异性蛋白条带。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是检测病毒在纯化过程中的基因组带型电泳，结果显示病毒在纯化过程中，基因组带型未发生变异，带型稳定。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征是检测病毒在纯化过程中的基因组带型电泳， 结果显示病毒在纯化过程中，基因组带型未发生变异，带型稳定。
全文摘要
离子交换层析纯化制备人轮状病毒灭活疫苗的方法，涉及病毒制备灭活疫苗的方法。本发明包括浓缩病毒收获液，经QsepharoseFastFlow离子交换柱层析纯化，纯化产物透析脱盐，过滤除菌灭活等得到人轮状病毒灭活疫苗；进一步进行纯度、总蛋白去除率和感染性滴度检测，并进行抗原性、免疫原性检测及基因组带型稳定性检测。本发明纯化后病毒收获液总蛋白去除率为99.69%，病毒纯化前后感染性滴度分别为4.25lgCCID50/ml和7.0lgCCID50/ml，纯化的病毒灭活后病毒基因组带型未发生变异，保持了良好的抗原性和免疫原性。
文档编号C12N7/02GK102552898SQ20111043113
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者吴晋元, 孙茂盛, 张光明, 易山, 李鸿钧, 杨星 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所