专利名称：一种利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法
技术领域：
本发明属于生物催化领域，涉及一种利用游离或固定化假丝酵母脂肪酶(Candida lipase)催化合成α-熊果苷的制备方法。
背景技术：
熊果苷(Arbutin)属氢醌苷化合物，化学名为4_羟基苯基-D-吡喃葡萄糖苷，是源于绿色植物的天然活性皮肤脱色组分，存在于熊果、越橘等植物中，是一种新兴的无刺激、无过敏、配伍性强的天然美白活性物质。熊果苷是国际上正在极力推广的高功效医药、 化妆品添加剂，国际公认的高效祛斑美白剂，是美白化妆品理想的添加成份，国内外需求巨大，市场前景广阔。熊果苷有两种同分异构体，它们分别是α-熊果苷(α-arbutin)和β _熊果苷 (β-arbutin)，结构式如下α -arbutin β -arbutin为了比较了 α-熊果苷与其β-熊果苷的美白效果的差异，Masataka Fimayama等观察了它们对来自磨菇及小鼠黑素瘤酪氨酸酶活性的影响。结果表明，β-熊果苷抑制来自蘑菇及小鼠黑素瘤的酪氨酸酶，α-熊果苷反抑制小鼠黑素瘤的酪氨酸酶，但α-熊果苷强度为β-熊果苷的10倍。而且Kazuhisa Sugimotod等通过比较α -熊果苷和β -熊果苷在人体黑素瘤细胞的实验，发现α-熊果苷美白效果是熊果苷的10倍以上。研究还发现α -熊果苷的美白机理是直接抑制酪氨酸酶活性，从而达到减少黑色素的生成；而不是通过抑制细胞生长或酪氨酸酶基因表达的方式来达到减少黑色素的生成的目的，在这个实验中还发现，浓度为ImM的α-熊果苷未见抑制细胞的生长，而β-熊果苷在同样的浓度则出现有效地抑制，这进一步说明α -熊果苷不是通过杀死黑素细胞来实现人体皮肤的美白效果的，而是通过影响酪氨酸酶来抑制黑素的生成来达到美白效果的。此外，在α-熊果苷与人体黑素瘤细胞培养过程中未发现对苯二酚的存在。这不但说明了 α-熊果苷在使用过程中是稳定的，而且进一步说明α-熊果苷的美白作用是其本身的作用而不是其通过分解对苯二酚来实现。而熊果苷在使用过程中会抑制黑素细胞的生长，长期使用会导致黑素细胞衰退，黑素细胞是人体防御紫外线伤害的一道屏障，所以如果长期使用熊果苷会使人体降低人体自身对紫外线的防御。因此使用α-熊果苷作为化妆品添加剂比β-熊果苷更安全，且对人体没有任何副作用。国内外已经有多家大型化妆品公司使用α-熊果苷代替熊果苷作为美白剂添加剂。酶固定化(Enzyme immobilization)技术是20世纪60年代发展起来的一门新兴生物技术，在化工、发酵生产、能源、医药等行业，实际应用效果显著。它是利用物理或化学的手段将游离酶定位于限定的空间区域，并使其保持活性反复利用的方法。酶固定化技术与传统的悬浮生物处理法相比，酶固定化有提高单位体积的酶密度，酶易回收，对环境的耐受力增强(如PH值、温度、有机溶剂、有毒物质等)等优点。α -熊果苷和β -熊果苷的来源完全不同。β -熊果苷可以通过化学合成、植物提取、植物细胞培养和酶法合成四种方法来制备。α-熊果苷一般只能通过糖苷酶或微生物发酵制得，但因α-糖苷酶价格昂贵，目前只局限于实验室研究，而微生物发酵工艺步骤繁多、生产过程产生大量高BOD的废水，生产成本高居不下，限制了 α -熊果苷的大规模工业
化生产。为了克服这些问题，本发明首次采用商业化假丝酵母脂肪酶直接催化对苯二酚和糖合成α-熊果苷，具有催化剂价格低廉、反应条件温和、脂肪酶可多次重复利用，生产过程不产生废水，产物提取工艺简单等优点，大大降低了生产成本。对α-熊果苷的酶法工业化生产具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用游离或固定化假丝酵母脂肪酶催化对苯二酚和糖合成α -熊果苷，该反应具有反应条件温和、脂肪酶可多次重复利用、生产过程不产生废水等优点，提高了 α-熊果苷的产率，降低α-熊果苷的生产成本，使大规模生产α-熊果苷成为了可能。本发明的整体技术构思是游离假丝酵母脂肪酶催化合成α -熊果苷的方法，该方法由下列工艺步骤组成a.游离脂肪酶催化合成α _熊果苷；b.游离脂肪酶的回收及多次重复使用；c.游离脂肪酶催化合成的α -熊果苷的分离纯化；固定化假丝酵母脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，该方法由下列工艺步骤组成Α.固定化脂肪酶催化合成α -熊果苷；B.固定化脂肪酶的回收及多次重复使用；C.固定化脂肪酶催化合成的α-熊果苷的分离纯化。本发明的具体工艺步骤及工艺条件是步骤a中反应条件为对苯二酚和糖按两者摩尔比在1 1-1 3的范围，加入到反应媒介中，反应以游离假丝酵母脂肪酶为催化剂，在温度20-60°C，摇床转速lOO-lSOr/min的条件下，反应 10-120小时，脂肪酶的用量是糖质量的0. 01-1倍；糖为葡萄糖、蔗糖或麦芽糖；反应媒介为水、有机溶剂、离子液体或混合溶剂；其中有机溶剂为正己烷、环己烷、石油醚、正庚烷、正辛烷、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、叔戊醇、二甲基亚砜、吡啶、四氢呋喃、 二氯甲烷或四氯甲烷；离子液体为[bmim]PF6、[nmim]PF6、[bmim]BF4、[nmim]BF4、[omim]BF4、 [4-mbp]BF4, [bmim]0Tf、[bmim]NTf2、[讓加]1116504或[emim]benzoate ；混合溶剂为有机溶剂之间的混合溶剂或有机溶剂与水之间的混合溶剂，如正己烷与环己烷的混合溶剂，正己烷与正辛烷的混合溶剂，正丁醇和叔丁醇的混合溶剂，叔丁醇和二甲基亚砜的混合溶剂，正己烷、正丁醇和吡啶的混合溶剂、正己烷和水的混合溶剂，叔丁醇和水的混合溶剂，叔丁醇、 二甲基亚砜和水的混合溶剂或正己烷、叔丁醇、二甲基雅芳和水的混合溶剂等。步骤A中反应条件为对苯二酚和糖按两者摩尔比在1 1-1 3的范围，加入到反应媒介中，反应以固定化假丝酵母脂肪酶为催化剂，在温度20-60°C，摇床转速100-180r/min的条件下，反应 10-120小时，脂肪酶的用量是糖质量的0. 01-5倍；糖为葡萄糖、蔗糖或麦芽糖；反应媒介为水、有机溶剂、离子液体或混合溶剂；其中有机溶剂为正己烷、环己烷、石油醚、正庚烷、正辛烷、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、叔戊醇、二甲基亚砜、吡啶、四氢呋喃、 二氯甲烷或四氯甲烷；离子液体为[bmim]PF6、[nmim]PF6、[bmim]BF4、[nmim]BF4、[omim]BF4、 [4-mbp]BF4, [bmim]0Tf、[bmim]NTf2、[讓加]1116504或[emim]benzoate ；混合溶剂为有机溶剂之间的混合溶剂或有机溶剂与水之间的混合溶剂，如正己烷与环己烷的混合溶剂，正己烷与正辛烷的混合溶剂，正丁醇和叔丁醇的混合溶剂，叔丁醇和二甲基亚砜的混合溶剂，正己烷、正丁醇和吡啶的混合溶剂、正己烷和水的混合溶剂，叔丁醇和水的混合溶剂，叔丁醇、 二甲基亚砜和水的混合溶剂或正己烷、叔丁醇、二甲基雅芳和水的混合溶剂等；脂肪酶固定化介质为固体颗粒、纤维织物或非织造布，如硅胶、硅藻土、树脂、棉布、聚酯、尼龙或丝绸。步骤b中游离脂肪酶的回收及多次使用为回收方法板框过滤、滤纸过滤、微滤、超滤、纳滤或离心；使用寿命5-10周期。步骤B中固定化脂肪酶的回收及多次使用为回收方法板框过滤、滤纸过滤、微滤、超滤、纳滤或离心；使用寿命10-30周期。步骤c和步骤C中的α -熊果苷的分离纯化包括以下四个步骤①将去除脂肪酶后的反应液真空浓缩回收反应媒介，真空浓缩真空度为0. IMpa, 温度为30-65度；②把经过①步骤的浓缩液通过弱极性大孔吸附树脂或极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化；③把经过②步骤大孔吸附树脂柱的流出液真空干燥，即可得到纯度为95%以上的α -熊果苷粗品，真空干燥真空度为0. IMpa，温度为40_65度，干燥后的成品为白色粉末状；④把经过③步骤的α -熊果苷粗品溶于水后进行结晶，即得到纯度为99. 5%以上得α -熊果苷纯品，结晶温度为0-4度。本发明提供的利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其中脂肪酶酶活的定义为40°C条件下，ρΗ8.0的磷酸缓冲溶液中水解橄榄油，没分钟释放出Ιμπιο 脂肪酸的酶量为一个酶活单位。本发明所用的脂肪酶的酶活单位为250-10000U/g。本发明所取得的技术进步在于(1)本发明为国内外首次利用商品化假丝酵母脂肪酶催化对苯二酚和糖合成α-熊果苷；(2)相对于传统酶法和发酵法合成α -熊果苷，本发明具有反应条件温和、工艺步骤简单、不产生废水、环境友好、容易大规模工业化生产等优点；(3)相对于传统酶法合成α -熊果苷，本发明所用的假丝酵母脂肪酶为商业化脂肪酶，具有价格低廉、来源广泛、可大规模工业化生产等优点；(4)本发明使用固定化假丝酵母脂肪酶，具有脂肪酶与底物和产物容易分离的特点，而且脂肪酶的使用寿命长，可重复利用和连续化生产，大大降低了生茶成本。实施例以下结合实施例对本发明做进一步描述。实施例1(a)游离脂肪酶催化合成α _熊果苷将对0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 18g(Immol)葡萄糖加入到IOml正己烷中，反应以0. 02g游离假丝酵母脂肪酶为催化剂，在温度40°C，摇床转速150r/min的条件下，反应 24小时，转化率达60% ；(b)游离脂肪酶的回收及多次使用反应结束后，反应液在6000r/min离心15min即可把游离脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 18g(lmmol)葡萄糖的IOml正己烷反应体系中继续进行反应；如此重复循环，实现游离脂肪酶多次催化合成α -熊果苷，在此条件下，游离脂肪酶转化5周期，α -熊果苷的转化率分别为60. 0%,59.0%,57. 5%,54. 2%, 51. 6%，所以游离脂肪酶在使用5次后，酶活仍保持在50%以上。(c) α -熊果苷的分离纯化①将离心后的上清液真空浓缩回收正己烷，真空浓缩真空度为0. IMpa，温度为40 度；②把经过①步骤的浓缩液通过弱极性大孔吸附树脂或极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化；③把经过②步骤大孔吸附树脂柱的流出液真空干燥，即可得到纯度为95%的 α -熊果苷粗品，真空干燥真空度为0. IMpa，温度为45度，干燥后的成品为白色粉末状；④把经过③步骤的α -熊果苷粗品溶于水后进行结晶，即得到纯度为99. 5%以上得α -熊果苷纯品，结晶温度为4度。实施例2(a)游离脂肪酶催化合成α _熊果苷将对0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 36g(2mmol)葡萄糖加入到IOml含二甲基亚砜体积份数为10%的叔丁醇中，反应以0. 05g游离假丝酵母脂肪酶为催化剂，在温度40°C，摇床转速150r/min的条件下，反应72小时，转化率达86% ；(b)游离脂肪酶的回收及多次使用反应结束后，反应液在6000r/min离心15min即可把游离脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 36g(2mmol)葡萄糖的IOml含二甲基亚砜体积份数为10%的叔丁醇中继续进行反应；如此重复循环，实现游离脂肪酶多次催化合成α -熊果苷，在此条件下，游离脂肪酶转化8周期，α -熊果苷的转化率分别为86. 0%, 84. 5%、83. 0%、81. 2%、78. 6%、76. 3%、73. 8%、71. 5%，所以游离脂肪酶在使用 8 次后，酶活仍保持在70%以上。(c) α -熊果苷的分离纯化操作步骤同实施例1的步骤c。实施例3(a)游离脂肪酶催化合成α _熊果苷将对0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 54g(3mmol)葡萄糖加入到IOml含二甲基亚砜体积份数为10 %的叔戊醇中，反应以0. 2g游离假丝酵母脂肪酶为催化剂，在温度40°C，摇床转速150r/min的条件下，反应72小时，转化率达95% ；(b)游离脂肪酶的回收及多次使用反应结束后，反应液在6000r/min离心15min即可把游离脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 54g(3mmol)葡萄糖的IOm]含二甲基亚砜体积份数为10%的叔戊醇中继续进行反应；如此重复循环，实现游离脂肪酶多次催化合成α-熊果苷，在此条件下，游离脂肪酶转化10周期，α-熊果苷的转化率分别为95. 0%、 94. 5%,93. 0%,91. 8%,89. 5%,87. 5%,85. 0%,83. 5%,82. 2%,80. 5%，所以游离脂肪酶在使用10次后，酶活仍保持在80%以上。(c) α -熊果苷的分离纯化操作步骤同实施例1的步骤C。实施例4(a)游离脂肪酶催化合成α _熊果苷将对0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 34g(Immol)蔗糖加入到IOml混合溶剂(混合溶剂由体积份数为10%二甲基亚砜和体积份数85%叔丁醇及体积份数5%水组成)中，反应以0. 05g游离假丝酵母脂肪酶为催化剂，在温度45°C，摇床转速150r/min的条件下，反应 96小时，转化率达85. 5% ；(b)游离脂肪酶的回收及多次使用反应结束后，反应液在6000r/min离心15min即可把游离脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 34g(Immol)蔗糖的IOml混合溶剂(混合溶剂由体积份数为10%二甲基亚砜和体积份数85%叔丁醇及体积份数5%水组成)中继续进行反应；如此重复循环，实现游离脂肪酶多次催化合成α-熊果苷，在此条件下，游离脂肪酶转化6周期，α -熊果苷的转化率分别为85. 5%,83. 0%,81. 5%,77. 2%,73. 8%, 72. 0%，所以游离脂肪酶在使用6次后，酶活仍保持在70%以上。(c) α -熊果苷的分离纯化操作步骤同实施例1的步骤C。实施例5(a)游离脂肪酶催化合成α _熊果苷将对0. Ilg(Immol)对苯二酚和1. 082g(3mmol)蔗糖加入到IOml混合溶剂(混合溶剂由体积份数为10%二甲基亚砜和体积价数85%叔丁醇及体积份数5%吡啶组成)中， 反应以0. 25g游离假丝酵母脂肪酶为催化剂，在温度45°C，摇床转速150r/min的条件下，反应96小时，转化率达94.5%;(b)游离脂肪酶的回收及多次使用
反应结束后，反应液在6000r/min离心15min即可把游离脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)对苯二酚和1. 02g(3mmol)蔗糖的IOml混合溶剂(混合溶剂由体积份数为10%二甲基亚砜和体积份数85%叔丁醇及体积份数5%吡啶组成)中继续进行反应；如此重复循环，实现游离脂肪酶多次催化合成α -熊果苷，在此条件下，游离脂肪酶转化9周期，α -熊果苷的转化率分别为94. 5%、93. 0%、91. 5%、90. 2%、88. 8%、 86. 5%,85.0%,83.6%,82. 0%，所以游离脂肪酶在使用9次后，酶活仍保持在80%以上。(c) α -熊果苷的分离纯化操作步骤同实施例1的步骤c。实施例6(a)游离脂肪酶催化合成α _熊果苷将对0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 72g(2mmol)麦芽糖加入到IOml混合溶剂(混合溶剂由体积份数为10%吡啶和体积份数85%正己烷及体积份数5%水组成)中，反应以 0. 20g游离假丝酵母脂肪酶为催化剂，在温度45°C，摇床转速150r/min的条件下，反应96 小时，转化率达94. 0% ；(b)游离脂肪酶的回收及多次使用反应结束后，反应液在6000r/min离心15min即可把游离脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 72g(2mmol)麦芽糖的IOml混合溶剂(混合溶剂由体积份数为10%吡啶和体积份数85%正己烷及体积份数5%水组成)中继续进行反应；如此重复循环，实现游离脂肪酶多次催化合成α -熊果苷，在此条件下，游离脂肪酶转化 10 周期，α -熊果苷的转化率分别为94. 0%、93. 5%、93. 5%、91. 8%、89. 0%、87. 3%、 85. 2%,84. 6%,82. 6%,80. 1%,所以游离脂肪酶在使用10次后，酶活仍保持在80 %以上。(C) α-熊果苷的分离纯化操作步骤同实施例1的步骤C。实施例7(a)固定化脂肪酶催化合成α _熊果苷将对0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 36g(2mmol)葡萄糖加入到IOml水中，反应以 0. 30g固定化假丝酵母脂肪酶为催化剂，在温度40°C，摇床转速180r/min的条件下，反应72 小时，转化率达75.0% ；(b)固定化脂肪酶的回收及多次使用反应结束后，反应液用滤纸过滤即可把固定化脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 36g(2mmol)葡萄糖的IOml水中继续进行反应；如此重复循环，实现固定化脂肪酶多次催化合成α -熊果苷，在此条件下，固定化脂肪酶转化 12 周期，α-熊果苷的转化率分别为75. 0%、73. 5%,71. 5%,70. 0%,68. 3%,66. 1%, 65. 5%,62. 2%,56. 5%,54. 2%,52. 1 %、51. 0%、，所以固定化脂肪酶在使用12次后，酶活仍保持在50%以上。(c) α -熊果苷的分离纯化①将过滤后的滤液真空浓缩，真空浓缩真空度为0. IMpa，温度为45度；②把经过①步骤的浓缩液通过弱极性大孔吸附树脂或极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化；
③把经过②步骤大孔吸附树脂柱的流出液真空干燥，即可得到纯度为95%的 α -熊果苷粗品，真空干燥真空度为0. IMpa，温度为45度，干燥后的成品为白色粉末状；④把经过③步骤的α -熊果苷粗品溶于水后进行结晶，即得到纯度为99. 5%以上得α -熊果苷纯品，结晶温度为4度。实施例8(a)固定化脂肪酶催化合成α _熊果苷将对0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 68g(2mmol)蔗糖加入到IOml含二甲基亚砜体积份数为10%的叔丁醇中，反应以1.5g固定化假丝酵母脂肪酶为催化剂，在温度40°C，摇床转速180r/min的条件下，反应72小时，转化率达92% ；(b)固定化脂肪酶的回收及多次使用反应结束后，反应液用滤纸过滤即可把固定化脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 68g(2mmol)蔗糖的IOml含二甲基亚砜体积份数为 10%的叔丁醇中继续进行反应；如此重复循环，实现固定化脂肪酶多次催化合成α-熊果苷，在此条件下，固定化脂肪酶转化25周期，α -熊果苷的转化率分别为92. 0%,91. 5%, 91. 7%,91. 2%,89. 5%,89. 0%,87. 2%,87. 5%,86. 6%,86. 0%,84. 8%,84. 5%,83. 0%, 83. 3%,81. 2%,79. 5%,79. 5%,77. 8%,77. 5%,76. 5%,75. 0%,73. 2%,72. 5%,71. 2%, 82.0%,所以同定化脂肪酶在使用25次后，酶活仍保持在70%以上。(C) α-熊果苷的分离纯化操作步骤同实施例7的步骤C。实施例9(a)固定化脂肪酶催化合成α _熊果苷将对0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 72g(2mmol)麦芽糖加入到IOml混合溶剂(混合溶剂由体积份数为10%二甲基亚砜和体积份数85%叔丁醇及体积份数5%水组成)中， 反应以3. Og固定化假丝酵母脂肪酶为催化剂，在温度45°C，摇床转速180r/min的条件下， 反应120小时，转化率达96. 5% ；(b)固定化脂肪酶的回收及多次使用反应结束后，反应液用滤纸过滤即可把固定化脂肪酶回收，回收的脂肪酶再次投入到含有0. Ilg(Immol)对苯二酚和0. 72g(2mmol)麦芽糖的IOml混合溶剂(混合溶剂由体积份数为10%二甲基亚砜和体积份数85%叔丁醇及体积份数5%水组成)中继续进行反应；如此重复循环，实现固定化脂肪酶多次催化合成α-熊果苷，在此条件下，固定化脂肪酶转化30周期，α-熊果苷的转化率分别为96. 5%、95. 5%、96. 0%、95. 0%、94. 5%、 93. 8%,93. 2%,92. 5%,91. 6%,92. 0%,91. 2%,90. 5%,89. 0%,88. 3%,87. 5%,86. 8%, 85. 5%,83. 8%,81. 5%,80. 5%,79. 0%,77. 1%,77. 5%,76. 8%,75. 6%,74. 8%,74. 5%, 73. 2 %、71. 9 %、70. 2 %，所以固定化脂肪酶在使用30次后，酶活仍保持在70 %以上。(C) α-熊果苷的分离纯化操作步骤同实施例7的步骤C。
权利要求
1.一种利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于用游离或固定化假丝酵母脂肪酶(Candida lipase)催化对苯二酚与糖合成α-熊果苷，其中游离假丝酵母肪酶催化合成α-熊果苷的方法，该方法由下列工艺步骤组成a.游离脂肪酶催化合成α-熊果苷；b.游离脂肪酶的回收及多次重复使用；c.游离脂肪酶催化合成的α-熊果苷的分离纯化；固定化假丝酵母脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，该方法由下列工艺步骤组成Α.固定化脂肪酶催化合成α -熊果苷；B.固定化脂肪酶的回收及多次重复使用；C.固定化脂肪酶催化合成的α-熊果苷的分离纯化。
2.根据权利要求1所述的一种利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于 所述的a步骤中反应条件为对苯二酚和糖按两者摩尔比在1 1-1 3的范围，加入到反应媒介中，反应以游离假丝酵母脂肪酶为催化剂，在温度20-60°C，摇床转速100-180r/min 的条件下，反应10-120小时，脂肪酶的用量是糖质量的0. 01-1倍。
3.根据权利要求1所述的一种利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于 所述的A步骤中反应条件为对苯二酚和糖按两者摩尔比在1 1-1 3的范围，加入到反映媒介中，反应以固定化假丝酵母脂肪酶为催化剂，在温度20-60°C，摇床转速IOO-ISOr/ min的条件下，反应10-240小时，脂肪酶的用量是糖质量的0. 01-5倍。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于所述的a和A步骤中的糖为葡萄糖、蔗糖或麦芽糖。
5.根据权利要求1或2或3所述的一种利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于所述的a和A步骤中的反应媒介为水、有机溶剂、离子液体或混合溶剂；其中有机溶剂为正己烷、环己烷、石油醚、正庚烷、正丁醇、叔丁醇、叔戊醇、二甲基亚砜、吡啶、四氢呋喃或四氯甲烷；离子液体为[bmim]PF6、[nmim]PF6、[bmim]BF4、[nmim]BF4、[omim]BF4、[4-mbp] BF4, [bmim]0Tf、[bmim]NTf2、[讓加]1^504或[emim]benzoate ；混合溶剂为有机溶剂之间的混合溶剂或有机溶剂与水之间的混合溶剂，如正己烷与环己烷的混合溶剂，正己烷与石油醚的混合溶剂，正丁醇和叔丁醇的混合溶剂，叔丁醇和二甲基亚砜的混合溶剂，正己烷、正丁醇和吡啶的混合溶剂，正己烷和水的混合溶剂，叔丁醇和水的混合溶剂，叔丁醇、二甲基亚砜和水的混合溶剂或正己烷、叔丁醇、二甲基亚砜和水的混合溶剂等。
6.根据权利要求1或3所述的一种利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于所述的A步骤中的固定化脂肪酶固定化介质为固体颗粒、纤维织物或非织造布，如硅胶、硅藻土、树脂、棉布、聚酯、尼龙或丝绸。
7.根据权利要求1所述的一种利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于 所述的b步骤中游离脂肪酶的回收方法为离心、微滤、超滤、纳滤或板框过滤。
8.根据权利要求1所述的一种利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于 所述的b步骤中游离脂肪酶的使用寿命为5-10周期。
9.根据权利要求1所述的一种利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于 所述的B步骤中固定化脂肪酶的使用寿命为10-50周期。
10.根据权利要求1所述的一种利用脂肪酶催化合成α-熊果苷的方法，其特征在于所述的c和C步骤中的α-熊果苷的分离纯化包括以下四个步骤①将去除脂肪酶后的反应液真空浓缩回收反应媒介，真空浓缩真空度为0.IMpa，温度为30-65度；②把经过①步骤的浓缩液通过弱极性大孔吸附树脂或极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化；③把经过②步骤大孔吸附树脂柱的流出液真空干燥，即可得到纯度为95%以上的 α -熊果苷粗品，真空干燥真空度为0. IMpa，温度为40_65度，干燥后的成品为白色粉末状；④把经过③步骤的α-熊果苷粗品溶于水后进行结晶，即得到纯度为99. 5%以上得 α -熊果苷纯品，结晶温度为0-4度。
全文摘要
本发明涉及一种利用游离或固定化假丝酵母脂肪酶(candida lipase)催化合成α-熊果苷的制备方法，它包括反应体系的选择，固定化脂肪酶的制备，反应条件的优化和产物的提取等工艺步骤；将对苯二酚和糖按两者摩尔比在1∶1～1∶5的范围，加入到反应媒介中，反应以脂肪酶为催化剂。在20～60℃的条件下，反应10-120小时，α-熊果苷的转化率最高可达95％以上。脂肪酶的用量是糖质量的0.01-5倍。本发明首次通过游离脂肪酶或固定化脂肪酶催化合成α-熊果苷，具有反应条件温和、脂肪酶可多次重复利用，生产周期短，产物提取工艺简单等优点，大大降低了生产成本。
文档编号C12R1/72GK102517362SQ20111043195
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者刘春巧, 曹熙, 王芳, 聂开立, 谭天伟, 邓利 申请人:北京化工大学