专利名称：用于肿瘤早期诊断的多基因联合检测的探针、引物及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物试剂，具体涉及用于肿瘤早期诊断的多基因联合检测试剂盒。
背景技术：
肿瘤是危害人类健康最严重的一类疾病，是导致人类死亡的最主要死因之一。世界卫生组织(WHO)的数据显示，2008年全球肿瘤新发病例约为1270万，肿瘤死亡例数为760万。目前全球每年新增肿瘤患者约为900万人，预计到2020年全世界肿瘤发病率将比现在增加50%，全球每年新增肿瘤患者人数将达到1500万人。我国肿瘤的发病率和死亡率居世界之首，每年死于肿瘤的人数超过160万，肿瘤发病率约为200/10万人，每年新发病例高达220万人，中国每4个死亡者中就有一个死于肿瘤，居死亡原因之首。肿瘤的早期诊断，早发现、早治疗是提高肿瘤患者生存率的最重要的途径，其中早期诊断是关键，是提高肿瘤患者的治愈率，延长生存期的首要环节。临床研究表明，肿瘤早期诊断并及时给予科学的治疗，其5年生存率能提高到80% -90%，其中有50%以上的肿瘤是可以治愈的，如，乳腺癌早期诊断并给予科学的治疗，其5年生存率可高达85%，而晚诊断者只有50%。肺癌早期诊断并给予科学的治疗，5年生存率可达90%，而晚期诊断的生存率仅占为45%。因此，肿瘤早筛查、早诊断是提高肿瘤治疗效果关键，是延长患者生存期，提高治疗效果的重要途径。肿瘤的发生和发展涉及到多基因的驱动性突变，是由驱动性突变基因所引起的多步骤、多阶段的一个恶性转变过程。目前研究发现与肿瘤发生密切相关的驱动性突变基因主要有 P53、KRAS, EGFR、BRAF, PIK3CA 和 MEKl 等基因。多项研究表明，P53、KRAS, EGFR、BRAF, PIK3CA和MEKl等基因在肿瘤中有较高突变率，其单个基因筛查敏感度约为20-60%。然而，大部分单个基因检测用于肿瘤早期筛查，其检测敏感度或特异度偏低，不能满足临床需要。采用多基因联合检测可以有效解决敏感度低的问题，提高肿瘤早期筛查和诊断的准确度，研究显示，运用多基因联合检测的敏感度可以到达 60 -93 。Ye 等人(Ye et al. , Genetics and Molecular Research2009. 8 ；1509-1518)同时检测p53，pl6、Rb、EGFR基因，结果表明联合检测四个基因用于肺癌早期诊断的敏感度为68%，准确率达72. 3%。Wu等人(Wu et al.，Medical Journalof Wuhan University 2009. 22 ;47_49)联合 p53、KRAS、pl5、pl6 四基因作为肺癌早期诊断的指标，研究发现其敏感度为78%,特异度为93%。Ahlquist等人(Ahlquist et al.,Gastroenterology 2000. 119 ; 1219-1227)的联合检测了 APC、KRAS、P53、BAT26 和 L-DNA 基因，发现联合检测上述6个基因诊断结肠癌的敏感度可以高达91 %。因此，通过联合检测肿瘤相关基因的驱动性突变，对于肿瘤的早期筛查或诊断，提高肿瘤患者的治愈率，改善预后 有重大意义。血液检测是临床肿瘤早期筛查和诊断的重要手段之一，具有操作相对简单、小创伤、便于在同一患者多次重复进行，易于被患者接受，临床应用范围广等特点。通过检测血液中肿瘤标志物或肿瘤相关基因驱动突变已成为临床肿瘤检测主要检测靶标，肿瘤标记物的检测通常是基于蛋白水平检测，通过检测血液中肿瘤特异特异表达蛋白达到肿瘤的早筛查、早诊断。目前，临床检测肿瘤标记物的方法主要有酶联免疫技术和荧光免疫技术，通过检测肿瘤标记物实现进行早期肿瘤诊断，但这种方法操作复杂，检测灵敏度低、费用高、不能满足临床筛查，诊断和检测的实际需求，从而使肿瘤患者错失了最佳的治疗时期。因此，酶联免疫等检测技术不能达到临床应用的实际需求。临床迫切需要开发一种高灵敏度、高特异度的检测技术，以实现采用高灵敏度检测方法实现肿瘤早期筛查或诊断，从而为肿瘤的早期筛查或诊断提供科学参考依据。针对上述问题，本发明开发一种高灵敏的多基因联合检测的试剂盒，通过联合检 测 p53、KRAS、EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor)、BRAF、PIK3CA (Phosphoinositide-3-kinase)和MEKl 6个基因实现肿瘤的早期筛查或诊断。本发明设计运用一种新型环形引物，大幅度提高检测的灵敏度。该检测方法的灵敏度可达到0. 1%，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于肿瘤早期筛查或诊断多基因联合突变检测试剂盒的引物及探针，包括有P53、KRAS, EGFR、BRAF, PIK3CA和MEKl驱动性基因突变的检测探针和引物，通过对驱动性突变的联合检测实现肿瘤的早期诊断，其特异引物与探针包括如下序列表1P53驱动突变特异性引物和探针核苷酸序列
权利要求
1.用于肿瘤早期诊断的探针和引物，其特征在于，包括以下的探针和引物中的至少ー组 (1)P53驱动突变特异性引物和探针SEQID NO =I-SEQ ID NO 15 ； (2)KRAS驱动突变特异性引物和探针SEQID NO :16_SEQ ID NO :35 ; (3)EGFR驱动突变特异性引物和探针SEQ ID NO :36_SEQ ID NO :59 ; (4)BRAF驱动突变特异性引物和探针SEQ ID NO :60_SEQ ID NO :62 ; (5)PIK3CA驱动突变检测探针和引物SEQID NO :63_SEQ ID NO :80 ;或 (6)MEK1驱动突变检测探针和引物SEQID NO 81-SEQ ID NO :91。
2.用于肿瘤早期诊断的多基因联合检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括如下的探针和引物 p53驱动突变特异性引物和探针SEQ ID NO : I-SEQ ID NO 15 ； KRAS驱动突变特异性引物和探针SEQ ID NO :16_SEQ ID NO :35 ； EGFR驱动突变特异性引物和探针SEQ ID NO :36_SEQ ID NO :59 ; BRAF驱动突变特异性引物和探针SEQ ID NO :60_SEQ ID NO :62 ; PIK3CA驱动突变检测探针和引物SEQ ID NO :63_SEQ ID NO :80 ;和 MEKl驱动突变检测探针和引物SEQ ID NO 81-SEQ ID NO :91。
3.用于肿瘤早期诊断的多基因联合检测试剂盒的设计方法，包括 (1)根据Cosmic数据公布的人类p53、KRAS、EGFR、BRAF,PIK3CA和MEKl为野生型基因序列，针对有P53、KRAS、EGFR、BRAF,PIK3CA和MEKl的突变位点为基础，来设计引物和探针； (2)针对有p53、KRAS、EGFR、BRAF,PIK3CA和MEKl驱动性突变选定的突变位点设计简并整套的特异性引物和探针； (3)提取检测样本中基因组DNA，包括全血、血液、血浆中的DNA； (4)配制各反应荧光PCR扩增突变基因反应体系； (5)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果检测反应体系的FAM和HEX荧光強度，以HEX信号达到设定阈值Ct > 18表明检测DNA在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为O或31 :阴性；Ct值小于28 :阳性。
4.如权利要求3所述配制用于p53、KRAS、EGFR、BRAF、PIK3CA和MEKl荧光PCR扩增体系，其特征在于，所述荧光PCR体系组成包括 DNA 模板1-7 mL 各引物0.1-1.0 μπιο 各探针O. 1-1. O pmol Taq 酶O. 5-5. O U 甲酰胺1-5%。
dNTPO. 2-5. O mmol MgCL2I. 0-10. O mmol 总体积10-40 mL
5.一种用于肿瘤治疗预后的基因突变检测，其特征在于，包括以下的探针和引物中的至少ー组 SEQ ID NO I-SEQ ID NO 91。
全文摘要
本发明公开了用于肿瘤早期诊断的多基因联合检测的探针、引物及试剂盒，本发明的探针和引物包括SEQ ID NO1-SEQ ID NO91，可以对p53、KRAS、EGFR、BRAF、PIK3CA和MEK1基因进行联合检测；可在一个PCR反应管中同时检测多种驱动性突变；灵敏度高，5-10拷贝的突变可以检出；特异性强，10ng的野生型基因组DNA不会产生非特异性信号；检测速度快，操作简单，费用低廉。
文档编号C12N15/11GK102628077SQ20111043959
公开日2012年8月8日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者张海龙, 江风阁, 肖桃英, 郑立谋, 阮力 申请人:厦门艾德生物医药科技有限公司