专利名称：黄酮类化合物的持久吸收的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于长久并持续释放黄酮类化合物(特别是含鼠李糖的黄酮类化合物)及在胃肠道中延长所述黄酮类化合物吸收的方法。还涉及包含所述黄酮类化合物和 α -鼠李糖苷酶的组合物。本发明也包括包含橙皮苷和橙皮素-7-葡糖苷的组合物。
背景技术：
黄酮类化合物，或生物类黄酮是大多数植物中存在的普遍的一组多酚物质，其浓缩于种子、水果皮或果皮、树皮及花中。许多植物药品含有黄酮类化合物，许多作者已经报道其具有抗细菌、抗氧化、抗炎、抗变应性、抗诱变、抗病毒、抗肿瘤、抗血栓和血管舒张作用。WO 2005/058255 Al中描述的近期发展也显示了含黄烷酮组合物用于改善人类或宠物皮肤、头发和皮毛健康的益处。自然界中，这些化合物主要作为糖苷存在。与糖的这种缀合显著影响了它们的吸收动力学。例如，黄酮类化合物葡糖苷具有快且早的吸收，而黄酮类化合物芸香苷(鼠李糖-葡糖苷)具有慢且晚的吸收。对于黄酮类化合物芸香苷(如橙皮苷)，因小肠中缺少可以将所述黄酮类化合物芸香苷的鼠李糖部分去除的α-鼠李糖苷酶，其在哺乳动物中生物利用率低并且晚。这导致胃肠道中黄酮类化合物芸香苷穿过进入盲肠的过程费时。JP 2003-073279中描述了含长效黄酮类化合物糖苷的健康食品和饮料，因此食品中包括不同程度糖基化的黄酮类化合物的混合物，使得在整个胃肠道中发生吸收。JP 2000-078955也描述了通过提供生理学活性的黄酮类化合物及其衍生物的混合物来改善食品或药品中黄酮类化合物的吸收的方法。此夕卜，Espin J. C.等在 Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52 00)，6136-6142页中描述了在果汁和绿茶中制备生物可用的葡糖苷黄酮类化合物。这通过用来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的鼠李糖苷酶处理果汁和绿茶来实现。发明目的因此仍然需要提供备选方法，通过所述方法黄酮类化合物组合物在哺乳动物中具有可控的效果。发明概述因此，通过独立权利要求的特征解决该需要。从属权利要求进一步形成了本发明的中心思想。因此，在本发明的第一方面中，组合物包含至少一种含鼠李糖的黄酮类化合物和 α-鼠李糖苷酶。
制备本发明的组合物用于化妆品、营养及药物用途。第二方面，本发明涉及具有α-鼠李糖苷酶活性的细菌，其选自卷曲乳杆菌 (Lactobacillus crispatus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plan tarum)、力口氏乳杆菌 (Lactobacillus gasseri)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)或肠膜明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)0在其它方面，本发明涉及α -鼠李糖苷酶在制备包含至少一种含鼠李糖黄酮类化合物的组合物中的用途，所述组合物用于改善所述黄酮类化合物的生物功效和/或生物利用率。在本发明另一方面，提供了 α -鼠李糖苷酶和至少一种含鼠李糖黄酮类化合物在制备用于改善皮肤健康的组合物中的用途。并且，本发明组合物的化妆品用途代表了本发明的另一方面。本发明还涉及的是用于维持和/或提高含鼠李糖黄酮类化合物的生物利用率的方法，所述方法包括步骤提供包含至少一种含鼠李糖黄酮类化合物和α -鼠李糖苷酶的组合物，所述α-鼠李糖苷酶处于基本不能剪切所述黄酮类化合物的鼠李糖部分的状态。用于在摄入所述黄酮类化合物后延长含鼠李糖黄酮类化合物的代谢物的血浆水平的方法是本发明的另一方面，所述方法包括步骤经口提供包含至少一种含鼠李糖黄酮类化合物和α-鼠李糖苷酶的组合物，所述α-鼠李糖苷酶处于基本不能剪切所述黄酮类化合物的鼠李糖部分的状态。用于改善皮肤健康的方法也属于本发明的一个方面，所述方法包括步骤经口施用包含至少一种含鼠李糖黄酮类化合物和α -鼠李糖苷酶的组合物，或经口分别和同时施用包含至少一种含鼠李糖黄酮类化合物和α-鼠李糖苷酶的组合物，所述α-鼠李糖苷酶处于基本不能剪切所述黄酮类化合物的鼠李糖部分的状态。最后，本发明包含组合物，所述组合物包含橙皮苷和橙皮素-7-葡糖苷(优选比例为70/30至50/50)的混合物。附图
参考附图中显示的一些实施方案，于下文进一步描述了本发明，其中图Ia描述了橙皮苷的分子结构，图Ib描述了橙皮素-7-葡糖苷的分子结构，图Ic描述了橙皮素的分子结构，并且图2是根据单独摄取橙皮素-7-葡糖苷，还是单独摄取橙皮苷或消费本发明组合物来比较血浆橙皮素水平的曲线图。图3显示在接近于存在纯的α -鼠李糖苷酶(CTRL+)、加氏乳杆菌CNCM 1-3795 (907EC)的完整细胞、加氏乳杆菌CNCM 1-3795 (907CE)的破碎细胞，或不存在任何细菌/酶(CTRL-)的小肠(pH 6)环境中，橙皮苷在体外的消失。图4显示橙皮素-7-葡糖苷在pH 6处的形成(从橙皮苷的起始量(100% )开始计算)，其中CTRL+、CTRL-、907CE和907EC具有与图3中相同的含义。图5显示当用加氏乳杆菌(CNCM 1_37%)的完整细胞或破碎细胞处理橙皮苷时， 橙皮素在PH 6处形成。图6显示存在纯的α -鼠李糖苷酶(CTRL+)、加氏乳杆菌CNCM 1-3795 (907EC)的
4完整细胞、加氏乳杆菌CNCM 1-3795 (907CE)的破碎细胞，或不存在任何细菌/酶(CTRL-) 时，在接近于膳食消化后的胃环境(PH 4)中，橙皮苷在体外的消失。图7显示橙皮素-7-葡糖苷在pH 4处的形成(从橙皮苷的起始量(100% )开始计算)，其中CTRL+、CTRL-、907CE和907EC具有与图6中相同的含义。图8图解TIMl实验的结果。当使用加氏乳杆菌(CNCM 1-3795)的菌株时，监测胃及小肠中橙皮苷水解成橙皮素-7-葡糖苷高达3小时。该图显示细菌酶在胃中活性低，仅在小肠中水解的橙皮苷的量随化合物移向胃肠道而减少。图9图解当使用纯的α -鼠李糖苷酶时，橙皮苷水解成橙皮素-7-葡糖苷的程度。 该图显示纯酶在胃中具有活性，但在胃肠道中活性较低。发明详述本发明涉及控制哺乳动物中含鼠李糖黄酮类化合物吸收的方法，使得摄取所述黄酮类化合物后，在上胃肠道和下胃肠道中或在整个胃肠道中发生等量吸收。因此，为了实现持久和可调节的效果，本发明的基本原则是以可调方式提供黄酮类化合物的方法，所述黄酮类化合物在哺乳动物胃肠道的整个通道中是至少部分可吸收的形式。通常，黄酮类化合物在上胃肠道及结肠中是至少部分水解的。根据本发明，在消化早期(胃、小肠)，α-鼠李糖苷酶的存在一定程度上允许部分剪切含鼠李糖的黄酮类化合物(参考图3-9)。这导致黄酮类化合物更易吸收并处于消化过程的更早期。此外，结肠中天然存在的酶促进了剪切过程，使得随后发生黄酮类化合物在胃肠道中通过时发生持续吸收。因此，本发明提出包含至少一种含鼠李糖黄酮类化合物和α -鼠李糖苷酶的组合物，其中所述α -鼠李糖苷酶处于基本不能剪切含鼠李糖黄酮类化合物的状态。假如满足了合适条件(环境、pH、温度等)，α -鼠李糖苷酶通常具有剪切包含鼠李糖部分的底物的能力。然而在本发明的组合物中，该酶处于基本阻止执行其正常功能的状态。仅在摄入组合物后，酶的环境改变，才使得新环境(ΡΗ、温度等)允许所述酶变成有活性的，因而剪切所述黄酮类化合物的鼠李糖部分。因此，在本发明的组合物、用途或方法中，α -鼠李糖苷酶处于基本不能剪切含鼠李糖黄酮类化合物的状态。仅在摄入组合物后，α-鼠李糖苷酶才能够剪切含鼠李糖的黄酮类化合物。该“延迟的” α -鼠李糖苷酶活性保证仅在摄入之后才发生α _鼠李糖苷酶剪切黄酮类化合物。因此，仅在胃肠道环境中才发生α-鼠李糖苷酶活性。这可根据本发明的不同实施方案，通过若干方法来实现。例如，这可通过使组合物中的α -鼠李糖苷酶处于“失活”的条件下来实现，即它不能剪切黄酮类化合物的鼠李糖部分。失活的α-鼠李糖苷酶例如是已经用抑制剂处理过的α-鼠李糖苷酶，这样仅当遇到胃肠道环境时，所述α-鼠李糖苷酶才能够成为有活性的。或者，组合物中的环境例如可以通过具有高pH值使得酶“失活”。摄入之后，胃肠道的低PH将为α -鼠李糖苷酶变得有活性提供有利环境。根据另一实施方案，这可通过将组合物中的α -鼠李糖苷酶与黄酮类化合物分离来实现。分离是使得所述α-鼠李糖苷酶不直接接触所述黄酮类化合物。例如可通过本领域已知的方法将α-鼠李糖苷酶封装来进行分离。因此，可将酶封装，使得其仅在胃肠道环境下才释放。或者，通过将α -鼠李糖苷酶封装在能够释放α -鼠李糖苷酶的微生物中，所述 α_鼠李糖苷酶不直接接触组合物中的黄酮类化合物。该“生物封装”可通过微生物的产 α -鼠李糖苷酶菌株实现，所述微生物保存在使其呈现低或零代谢速率的环境(水活度等) 下。组合物中的环境(水活度等)因而使得微生物在这些环境下不释放酶。α-鼠李糖苷酶在微生物的细胞壁内或细胞壁上被“生物封装”。因此，在本发明中，“处于基本不能剪切含鼠李糖黄酮类化合物的鼠李糖部分的状态中的α-鼠李糖苷酶”是指上文描述的任何形式的酶。当产生α -鼠李糖苷酶的微生物用于本发明的组合物或方法时，其优选为细菌。 更优选地，所述微生物选自乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、 链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、芽抱杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属 (Pediococcus)、酒球菌属(Oenococcus)等。最优选地，所述微生物选自卷曲乳杆菌(ATCC 33820)、卷曲乳杆菌(CNCM 1-3654)、植物乳杆菌(ATCC 8014)、植物乳杆菌(CNCM 1-3653)、加氏乳杆菌(CNCM 1-3795) 或其混合物。因此，选自卷曲乳杆菌(ATCC 33820)、卷曲乳杆菌(CNCM I-36M)、植物乳杆菌 (ATCC 8014)、植物乳杆菌(CNCM 1-3653)、加氏乳杆菌(CNCMI-3795)的具有α -鼠李糖苷酶活性的微生物是本发明的一部分。所述微生物优选以106-101(lCfU/g的量存在于本发明的组合物中。更优选以 109cfu/g的量存在。可进一步将能够产生α -鼠李糖苷酶的微生物封装。微生物的封装是本领域技术人员熟知的方法。本发明中所用的黄酮类化合物可选自包含鼠李糖部分的任何黄酮类化合物。任何这种含鼠李糖黄酮类化合物可选自橙皮苷、芸香苷、eriotricin、柚皮苷、新橙皮苷、洋芫荽苷、蒙花苷、枸桔苷、樱桃苷等和来自该列表的任何可能组合，所述组合包含来自该列表的两种或更多种组分。优选地，所述黄酮类化合物是橙皮苷(图la)。橙皮苷(图la)包含芸香糖(鼠李糖-葡萄糖)部分。在活性α -鼠李糖苷酶的存在下，可在一定程度上将橙皮苷的鼠李糖部分切除以产生橙皮素-7-葡糖苷(图lb)。同样，可通过其它酶(例如存在于胃肠道中的葡糖苷酶)进一步剪切橙皮素-7-葡糖苷以产生橙皮素(图Ic)。参照图2，可以看出一方面，摄取橙皮素-7-葡萄糖(图lb)后，橙皮素(图lc)的血浆水平在摄取后很快显示尖峰。不希望受理论的束缚，认为这是由于存在能够将葡萄糖部分切除的酶，使得橙皮素容易吸收。另一方面，因摄取橙皮苷(图la)引起的橙皮素血浆水平仅在稍后并以更小程度出现。不希望受理论的束缚，认为这是由于仅在穿过胃肠道的较后阶段存在能够剪切橙皮苷的芸香糖部分的酶。
因此，本发明的组合物有利地提供维持更长时间的橙皮素血浆水平(参考图2)。此外，根据本发明的另一实施方案，通过包含橙皮苷(图la)和橙皮素-7-葡糖苷 (图lb)的混合物的组合物也提供了橙皮素的这种持久血浆水平。优选地，这些以橙皮苷比橙皮素-7-葡糖苷为70/30至50/50的比例存在于所述组合物中。本发明组合物中黄酮类化合物的量对应于范围为0. Olmg至Ig黄酮类化合物的糖苷配基当量的量。优选地，所述黄酮类化合物以范围为IOmg至SOOmg黄酮类化合物的糖苷配基当量的量存在。例如，当橙皮苷(图la)用于本发明的组合物中时，其以将提供0. Olmg至lg，优选 IOmg至SOOmg相应橙皮素(图Ic)的量存在。这通过本领域技术人员容易地计算得到。在本发明组合物中，α -鼠李糖苷酶以足以提供10-50%的黄酮类化合物糖苷配基或10-50%的糖基化黄酮类化合物形式(其在消化的早期是可吸收的)的量存在。例如，在黄酮类化合物是橙皮苷的情况下，所用α -鼠李糖苷酶的量是足以在上胃肠道(小肠)中提供10-50%的橙皮素-7-葡糖苷(图lb)或橙皮素(图Ic)的量。这可通过本领域已知的方法(如TNO的TIM-I进行的实验和体内验证)容易地评估(参考图 8 禾口 9) ο优选配制本发明组合物用作营养、药物或化妆品组合物。因此，本发明组合物可以是干燥组合物、湿组合物或半湿组合物。“干的”指组合物的水活度低于0. 6。“半湿的”指组合物的水活度在0. 6至0. 9之间，“湿的”指组合物的水活度高于0.9。它们可选自液体组合物、干燥组合物或半干燥组合物，如溶液剂、喷雾剂、粉剂、片剂、胶囊剂、酸乳酪、饼干、奶、饮料、巧克力、冰淇淋、早餐谷类薄片或早餐谷类条、奶粉、豆制品、非乳发酵产品、营养补充剂、食品补充剂、宠物食品、婴儿配方等。对于摄食，口服组合物，并且特别是食品补充剂的许多实施方案是可能的。通过制备糖包衣片剂、明胶胶囊剂、凝胶剂、乳剂、片剂、胶囊剂或溶液剂的常用方法制备它们。 具体而言，含鼠李糖黄酮类化合物和α -鼠李糖苷酶，或在不同实施方案中，橙皮苷和橙皮素-7-葡糖苷可掺合到任何其它形式的食品补充剂或浓缩食品中，例如食物条，或压缩或非压缩的粉剂中。粉剂可用水、汽水、乳制品或豆制品稀释，或可掺合到食物条中。组合物可包含常用的赋形剂和成分，例如食品领域中常用的脂肪和/或水性成分、湿润剂、增稠剂、防腐剂、质地剂(texturing agent)、调味剂和/或涂层剂、抗氧化剂、 染料。根据本发明的其它方面，α -鼠李糖苷酶可用于制备包含至少一种含鼠李糖黄酮类化合物的组合物，其中所述α -鼠李糖苷酶处于基本不能剪切所述黄酮类化合物的鼠李糖部分的状态，用于改善所述黄酮类化合物的生物功效和/或生物利用率。“组合物”涵盖如上描述的本发明的任何组合物。将生物功效定义为摄取的营养物转化成具有显著生物效应的营养物活性形式的比例。它与生物利用率紧密联系，将生物利用率定义为物质被吸收进系统循环中的程度。通过提高黄酮类化合物的生物功效和/或生物利用率，本发明提供具有更持久和持续效应的更有效组合物的益处。因此，本发明也提供用于维持和/或提高含鼠李糖黄酮类化合物的生物利用率的方法，所述方法包括步骤提供包含至少一种含鼠李糖黄酮类化合物和α -鼠李糖苷酶的组合物，所述α -鼠李糖苷酶处于基本不能剪切所述黄酮类化合物的鼠李糖部分的状态。摄取橙皮苷(图la)或摄取橙皮素-7-葡糖苷(图Ic)后与摄取本发明的组合物后血浆水平的比较显示出显著差异。实际上，摄取本发明组合物后，橙皮素血浆水平维持了更长时间(图2)。因此，本发明还包括用于在摄取所述黄酮类化合物后提高含鼠李糖黄酮类化合物的代谢物的血浆水平的方法，所述方法包括步骤经口提供包含至少一种含鼠李糖黄酮类化合物和α -鼠李糖苷酶的组合物，所述α -鼠李糖苷酶处于基本不能剪切所述黄酮类化合物的鼠李糖部分的状态。在本发明方法中，α -鼠李糖苷酶可与包含含鼠李糖黄酮类化合物的组合物分开提供。例如，所述α-鼠李糖苷酶可提供为片剂、胶囊等以与包含所述黄酮类化合物的组合物被同时摄取。或者，它可提供为例如粉剂以喷洒在含黄酮类化合物的组合物上。技术人员可容易地设想此处提及的特定实施方案的多种不同备选方案。另一方面，本发明组合物可用于化妆品。“化妆品用途”指非治疗用途，其可改善人类或宠物皮肤、皮毛和/或头发的美观方面或舒适度。在该上下文中，化妆品用途可包括防止对人类或宠物的皮肤、皮毛和/或毛发的损伤和/或改善人类或宠物的皮肤、皮毛和/或毛发。这种损伤特别包括皮肤的光化损伤和老化损伤，如干燥、无规则色素沉着(特别是雀斑、痣、滴状色素减少症和持久的色素沉着过度)、皱纹(显著的是细微的表面纹和深皱纹)、星状假瘢痕、弹性组织变性、无弹性、毛细血管扩张、静脉湖、粉刺、皮脂腺增生、软垂疣和脂溢性角化病。化妆品用途还对头发和皮毛具有特殊益处，如改善的头发或皮毛密度、纤维直径、 色泽、油性、光泽度、皮脂产生，并且可帮助预防头发或皮毛脱落。本发明还包括治疗用途，如皮肤病学用途。实际上，α -鼠李糖苷酶和至少一种含鼠李糖黄酮类化合物(其中所述α-鼠李糖苷酶处于基本不能剪切所述黄酮类化合物的状态)在制备用于改善皮肤健康的组合物中的用途属于本发明的另一方面。所述组合物也可用于预防炎症或用于改善骨和/或心血管健康。“组合物”涵盖如上描述的本发明的任何组合物。在该实施方案中，本发明组合物可用于治疗和/或预防皮肤损伤，所述损伤例如由压力环境产生，例如通过化学、生物或物理压力，例如通过暴露于氧化剂或致癌物，暴露于细菌、病毒、真菌、来自周围细胞和/或微生物的脂类，或暴露于紫外线照射产生。这些损伤还包含光化性角化病、紫癜、樱桃样血管性水肿(cherry angiodema)、基底细胞癌和鳞状上皮细胞癌、皮肤烧伤和/或起泡、表皮增生、炎症、免疫抑制和癌症，例如非黑素瘤和黑素瘤皮肤癌。本发明组合物对人类或宠物的皮肤的效果可通过使用常规方法来测量，所述方法包括最小红斑量(MED)、比色法、经皮失水、DNA修复、测定白细胞介素和蛋白聚糖的产生、 或胶原酶活性、屏障功能或细胞更新。因此，用于改善皮肤健康的方法也属于本发明的一个方面，所述方法包括步骤经口施用包含至少一种含鼠李糖黄酮类化合物和α -鼠李糖苷酶的组合物，或经口分别和同时施用包含至少一种含鼠李糖黄酮类化合物和α-鼠李糖苷酶的组合物，所述α -鼠李糖
8苷酶处于基本不能剪切所述黄酮类化合物的鼠李糖部分的状态。该方法也用于改善心血管和骨健康。将理解本发明的概念同样可用作辅助目前所用的药疗法的辅助疗法。因为本发明组合物可容易地与食物材料一起经口施用，所以可施用含高含量目的物质的特殊临床食物。此外，本发明的概念同样可扩展到包含含鼠李糖黄酮类化合物和α -鼠李糖苷酶的组合物的局部应用。通过下文描述的非限制性实施例进一步阐明本发明。 实施例实施例1材料橙皮苷酶“Amano ” Cone. (A. MANO PHARMACEUTICAL CO.，LTD.)。在体外通过细菌粗提物剪切橙皮苷为了测试细菌α -鼠李糖苷酶是否能识别并剪切作为底物的橙皮苷，在鼠李糖存在下生长的细胞的粗提物与橙皮苷在PH 4和ρΗ 6温育4小时和8小时，并通过HPLC完成分析。在下表中将结果表示为橙皮苷或其衍生物基于反应起始时总的橙皮苷量(0.08mg/ mL)的百分比。用0.08mg橙皮苷/mL(其为旨在获得终产物的橙皮苷的近似浓度)和3xl09 细菌/mL的粗提物进行测试。结果显示两种菌株均具有α -鼠李糖苷酶和β -葡糖苷酶活性，并因此根据反应条件，将橙皮苷剪切成为不同程度的橙皮素-7-葡糖苷和糖苷配基。该结果提示细菌可用于在原位将橙皮苷部分转化成为橙皮素-7-葡糖苷和糖苷配基。
权利要求
1.具有α-鼠李糖苷酶活性的细菌，其是加氏乳杆菌。
2.根据权利要求1的细菌，其是加氏乳杆菌CNCM1-3795。
3.细菌用于产生α-鼠李糖苷酶的用途，其中所述细菌是加氏乳杆菌。
4.根据权利要求3的用途，其中所述细菌是加氏乳杆菌CNCMI-3795。
全文摘要
本发明涉及用于长期并持续释放黄酮类化合物，特别是含鼠李糖黄酮类化合物，和延长所述黄酮类化合物在胃肠道中的吸收的方法。还涉及包含所述黄酮类化合物和α-鼠李糖苷酶的组合物。也包括包含橙皮苷和橙皮素-7-葡糖苷的组合物。
文档编号C12N9/24GK102433286SQ20111044042
公开日2012年5月2日 申请日期2007年8月22日 优先权日2006年8月24日
发明者G·威廉森, I·扬科维奇, M·里查尔, M·雷恩 申请人:雀巢产品技术援助有限公司