专利名称：L-半胱氨酸酶法转化制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及L-半胱氨酸的酶法转化制备方法。
背景技术：
L-半胱氨酸是自然界存在的氨基酸，也是人体的非必需氨基酸之一，其所带的巯基具有重要的生理功能。L-半胱氨酸及其衍生物可用于医药领域、化妆品工业、食品领域和饲料添加剂领域等，具有非常广泛的应用。根据目前文献报导L-半胱氨酸的制备方法主要有提取法、化学合成法、发酵法和酶转化法。1、提取法目前国内生产L-半胱氨酸主要以人或动物毛发为原料，先经酸水解提取L-胱氨酸，再经过电解还原制得L-半胱氨酸。该方法大规模工业化生产受到原料来源的限制，产物中易混入其它氨基酸，分离难度大，环保成本高。也有厂家在生产L-半胱氨酸的相关产品中回收L-胱氨酸，曾庆群等(CN 101104599A,2008)对N-乙酰-L-半胱氨酸生产过程中排放的废液进行氧化处理，分离回收了 L-胱氨酸，提高了原料利用率，降低了生产成本。但是，近年来随着人们环保意识的增强或宗教信仰等原因，一些西方国家禁用由动物毛发为原料制得的L-半胱氨酸，因此寻求新的制备L-半胱氨酸的方法势在必行。2、化学合成法化学合成法是利用氯代烷类化合物经过氧化反应、加成反应、还原反应、取代反应，最后得到DL-半胱氨酸。化学合成法不仅步骤较多，而且得到的产物通常为外消旋体， 需经拆分后才能得到具有生理活性的L-半胱氨酸。马云峰(CN 1876628A, 2006)以DL-半胱氨酸为原料，以无机酸为溶剂，以D- 二苯甲酰酒石酸或L- 二苯甲酰酒石酸为拆分剂，将外消旋半胱氨酸与拆分剂按一定摩尔比溶于稀的无机酸溶液中，保温搅拌、冷却结晶，分别制得L-半胱氨酸和D-半胱氨酸。3、发酵法目前发酵法生产L-半胱氨酸正处于实验室探索阶段，其主要问题是微生物体内的L-半胱氨酸合成过程复杂，且巯基来源难以解决。张建国(CN 101831397A，2010)利用基因改造的大肠杆菌BL21(DE3)，在含葡萄糖、玉米粉、牛肉膏、乳糖、氯化钠、硫代硫酸钠等成分的培养基中发酵产生了 L-半胱氨酸， 基因改造前的大肠杆菌BL21 (DE3)L-半胱氨酸产量几乎为0，而基因改造后的BL21 (DE3) L-半胱氨酸产量达到lg/L。托马斯·迈尔(CN 1262646C，2006)采用半胱氨酸代谢去调节、CysB活性增加的改造菌株，在含葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠等成分的培养基中补料分批发酵，流加葡萄糖及硫代硫酸盐，发酵4 后发酵液中L-半胱氨酸含量达到22. 6g/L。Takagi Hiroshi (EP1234874, 2002)以棒状杆菌为出发菌株，通过基因改造提高胞内丝氨酸乙酰转移酶活性，同时降低半胱氨酸脱巯基酶活性，在含葡萄糖、硫酸铵等成分的产半胱氨酸培养基中发酵，积累了 L-半胱氨酸和L-胱氨酸。4、酶转化法自 1979 年 Sano K.等(Applied and Environmental Microbiology, 34 (6) 806-810,1977)发现嗜硫氮杂环戊烯假单胞菌转化DL-2-氨基-Δ 2-噻唑啉-4-羧酸 (DL-ATC)为L-半胱氨酸以来，酶法生产L-半胱氨酸已成为近年来人们关注和研究的方向。 酶法转化因具有专一性强、反应条件温和、环境友好等优点而日益受到重视。日本具有用DL-ATC为原料酶法制备L-半胱氨酸较为成熟的生产工艺，国内学者也做了相关研究。王普(CN 100467587C,2009)以假单胞菌ζjwp_14湿菌体或粗酶液为酶源，以DL-ATC为底物，于20 52°C酶促转化1 9h，得到含L-半胱氨酸的反应液，经分离提取制得L-半胱氨酸。陈宁(CN 101348809A,2009)以恶臭假单胞菌(I^seudomonas putida) TS-1138为供试菌种，以全细胞为酶源酶法转化DL-ATC合成了 L-半胱氨酸。以DL-ATC为底物酶法合成L-半胱氨酸，需要化学合成DL-ATC，且酶转化过程中需要多步酶促反应，整体催化效率不高。焦庆才等(BioresourceTechnology, 102 :3554-3557,2011)以 L-丝氨酸和吲哚为底物，以色氨酸合成酶基因工程菌DM206(pETj8a-trpBA/BL21)酶法合成了 L-色氨酸。 但据文献报道色氨酸合成酶不仅能够催化L-丝氨酸和吲哚合成L-色氨酸，还能催化L-丝氨酸和硫氢化钠反应生成L-半胱氨酸。Ken-ichi Ishiwata等(Journal of Fermentation and Bioengineering, 67 (3) 169-172，1989)以L-丝氨酸和硫氢化钠为底物，色氨酸合成酶酶法合成了 L-半胱氨酸，在最佳条件下反应液中L-半胱氨酸达到114g/L，转化率是以L-丝氨酸和吲哚为底物酶法合成L-色氨酸的47%。日本专利(JP62215396-A，1987 ； JP63007790-A, 1988)报道了以 L-丝氨酸为底物， 以硫化氢或硫氢化物或硫化物为巯基供体，色氨酸合成酶酶法合成L-半胱氨酸。日本专利 (JP62019098-A, 1987)以DL-丝氨酸和硫化物为底物，用色氨酸合成酶将L-丝氨酸转化生成L-半胱氨酸或L-胱氨酸，同时分离制备了 D-丝氨酸。以上色氨酸合成酶酶法合成L-半胱氨酸的报道均以L-丝氨酸纯品为底物，目前 L-丝氨酸和L-半胱氨酸的生产成本大体相当，故以L-丝氨酸纯品酶法合成L-半胱氨酸无现实意义。
发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种高效、低成本的制备L-半胱氨酸的方法。本发明以氨基酸工业中富含L-丝氨酸的混合氨基酸料液代替L-丝氨酸纯品，以色氨酸合成酶酶法合成L-半胱氨酸。本发明可以通过以下技术方案来达到L-半胱氨酸的酶法转化制备方法，其步骤为(1)色氨酸合成酶基因工程菌DM206 (pET-28a-trpBA/BL21)，在含有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或乳糖的培养基中培养，诱导产生色氨酸合成酶；(2)将含有色氨酸合成酶的湿菌体或粗酶液与含L-丝氨酸的混合氨基酸料液混合，再加入适量磷酸吡哆醛、表面活性剂、硫氢化钠或硫化钠或硫氢化铵或硫化铵或硫化氢，在25 55°C，pH 6 11条件下进行酶促反应；将反应生成的L-半胱氨酸氧化后分离得到L-胱氨酸，再经过电解还原制得L-半胱氨酸。上述步骤(1)中的培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和/或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1 20g/L ；氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨和/或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1 30g/L ；加入IPTG或乳糖诱导，IPTG终浓度为0. 05
0.15g/L，乳糖终浓度为5 15g/L。上述步骤O)中含L-丝氨酸的混合氨基酸料液为角蛋白水解液或蚕丝水解液或酶法合成L-丝氨酸的反应液，混合氨基酸料液中总氨基酸含量(w/w)为10% 50%，其中 L-丝氨酸在总氨基酸中含量(w/w)为10% 95%。上述步骤( 的转化液中加入适量的表面活性剂吐温-80或十六烷三甲基溴化铵 (CTAB)或聚乙二醇辛基苯基醚(OP)，其浓度为0. 005g/L 5. Og/L。目前，我国L-半胱氨酸生产主要来源于毛发水解提取法，该方法工艺成熟，但大规模工业化生产受到原料来源的限制，短时间内难以扩大生产规模，环保压力大。而另一方面我国在氨基酸工业生产中，会产生大量不能直接用于食品和医药方面的富含L-丝氨酸的混合氨基酸料液，该混合氨基酸料液直接分离制备L-丝氨酸成本高、效率低。本发明以富含L-丝氨酸的混合氨基酸料液为原料，以色氨酸合成酶酶法合成了 L-半胱氨酸。本发明与现有技术相比具有如下优点(1)本发明采用的色氨酸合成酶基因工程菌DM206，在优选的培养基中培养可以高效表达色氨酸合成酶，使酶法合成L-半胱氨酸有较高的催化速率和转化率，其中L-丝氨酸摩尔转化率达到80 %以上。(2)本发明采用含L-丝氨酸的混合氨基酸料液为反应原料，充分利用了工业副产物，解决了混合氨基酸料液中L-丝氨酸高效分离的难题，同时也为大规模生产L-半胱氨酸提供了更为丰富的原料，具有良好的经济效益和社会效益。(3) L-半胱氨酸氧化后得到L-胱氨酸，L-胱氨酸和混合氨基酸料液中的其它氨基酸理化性质有较大差异，用等电点结晶法即可实现分离。(4)酶法合成L-半胱氨酸具有反应条件温和，酶立体选择性强，催化效率高，成本低，工艺流程简单等优点，适合工业化生产。
具体实施例方式实施例一1.将IOOOmL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体18g加入到500mL转化液中， 转化液中含38g/L L-丝氨酸的毛发酸水解液(氨基酸总含量15% )、13g NaHS,0. 2g/L磷酸吡哆醛和0. 005g/L 0P，pH 8. 5，37 °C酶促反应21h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为36g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为82.2%。2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH
1.0，加热去除H2S,活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/LNa0H调pH 5. 0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得16. 8g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色， 中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得15. 6gL-胱氨酸精品，比旋光[α^= -223° (c = 2，lmol/L 盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。
实施例二1.将IOOOmL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体19g加入到500mL转化液中， 转化液中含46g/L L-丝氨酸的毛发酸水解液(氨基酸总含量10% )、15g NaHS,0. 2g/L磷酸吡哆醛和5g/L吐温-80，pH 9. 0，35 °C酶促反应^h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为45g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为84. 9 %。2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 1. 0，加热去除H2S,活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/LNa0H调pH 5. 0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得21g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得19. 6g L-胱氨酸精品，比旋光[α^=-224° (c = 2, lmol/L 盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。实施例三1.将IOOOmL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体18g加入到500mL转化液中， 转化液中含25g/L L-丝氨酸的毛发酸水解液(氨基酸总含量25%)、8g NaHS,0. 2g/L磷酸吡哆醛和0. 5g/L吐温-80，pH 9. 0，25 °C酶促反应15h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为23. 8g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为82.6%。2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 1. 0，加热去除&S，活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/L NaOH调pH 5. 0，将滤液中的L-半胱氨酸滴加双氧水氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得10. 5g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得9. SgL-胱氨酸精品，比旋光[^g= - 224° (c = 2， lmol/L盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。实施例四1.将IOOOmL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体19g加入到500mL转化液中， 转化液中含70g/L L-丝氨酸的蚕丝酸水解液(氨基酸总含量35% )、32g Na2S、0. 2g/L磷酸吡哆醛和0.05g/L CTAB，pH 9. 0，40°C酶促反应40h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为68. 8g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为85.3%。2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 0. 5，加热去除H2S,活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/LNa0H调pH 5. 0，将滤液中的L-半胱氨酸滴加双氧水氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得32. 5g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得31g L-胱氨酸精品，比旋光[ag=-221° (c = 2， lmol/L盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。实施例五1.将IOOOmL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体18g加入到500mL转化液中， 转化液中含84g/L L-丝氨酸的蚕丝酸水解液(氨基酸总含量30%)、^g NH4HS、0. 2g/L磷酸吡哆醛和0. 5g/L CTAB, pH 7. 0，37°C酶促反应40h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为81. 6g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为84. 3%。2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 0. 5，加热去除H2S,活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/LNa0H调pH 5. 0，将滤液中的L-半胱氨酸滴加双氧水氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得38. 2g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得37g L-胱氨酸精品，比旋光[α^=-220° (c = 2，lmol/L盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。实施例六1.将IOOOmL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体17g加入到500mL转化液中， 转化液中含44g/L L-丝氨酸的蚕丝酸水解液(氨基酸总含量20% )、20g (NH4) 2S、0. 2g/L磷酸吡哆醛和0. 5g/L吐温80，pH 6. 0，55 °C酶促反应30h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为41. 2g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为81. 3%。2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 0. 5，加热去除H2S,活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/L NaOH调pH 5. 0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得18. 8g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色， 中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得17g L-胱氨酸精品，比旋光[α^=-221° (c = 2, lmol/L 盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。实施例七1.将IOOOmL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体19g加入到500mL转化液中， 转化液中含105g/L酶法合成L-丝氨酸的反应液(氨基酸总含量11% )、47g Na2S、0. 2g/L 磷酸吡哆醛和0. 5g/L吐温-80，pH 11，37 °C酶促反应45h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为102g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为84. 3%。2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 0. 5，加热去除H2S,活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/L NaOH调pH 5. 0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得49. 6g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色， 中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得48g L-胱氨酸精品，比旋光[α^=-222° (c = 2, lmol/L 盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。实施例八1.将IOOOmL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体19g加入到500mL转化液中， 转化液中含120g/L酶法合成L-丝氨酸的反应液(氨基酸总含量50% )、39g NaHS,0. 2g/ L磷酸吡哆醛和0. 5g/L吐温-80，pH 8，37 °C酶促反应45h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为118g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为85.3%。2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 0. 5，加热去除H2S,活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/L NaOH调pH 5. 0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得57. 6g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色， 中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得56g L-胱氨酸精品，比旋光[α^=-224° (c = 2, lmol/L 盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。实施例九1.将IOOOmL发酵液离心得到的19g色氨酸合成酶湿菌体超声波破碎制成20ml粗酶液，加入到500mL转化液中，转化液中含200g/L酶法合成L-丝氨酸的反应液(氨基酸总含量30%)和0. 2g/L磷酸吡哆醛，通入H2S气体并用氨水调pH 9. 0，37°C酶促反应50h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为193g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为83. 7%。2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 0. 5，加热去除&S，活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/L NaOH调pH 5. 0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得95gL-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得93. 4g L-胱氨酸精品，比旋光[α^=-222° (c = 2, lmol/ L盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。
权利要求
1.一种L-半胱氨酸的酶法转化制备方法，其特征是由以下步骤构成(1)具有色氨酸合成酶活性的基因工程菌DM206，在含有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或乳糖的培养基中培养，产生色氨酸合成酶；(2)将含有色氨酸合成酶的湿菌体或粗酶液与含L-丝氨酸的混合氨基酸料液混合，再加入适量的磷酸吡哆醛、表面活性剂、硫氢化钠或硫化钠或硫氢化铵或硫化铵或硫化氢，在 25 55°C，pH 6 11条件下进行酶促反应，将反应生成的L-半胱氨酸通空气或滴加双氧水氧化后分离得到L-胱氨酸，再经过电解还原制得L-半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的L-半胱氨酸酶法转化制备方法，其特征在于步骤(2)所述的含L-丝氨酸的混合氨基酸料液来源于角蛋白水解液或蚕丝水解液或酶法合成L-丝氨酸的反应液，混合氨基酸料液中总氨基酸含量(w/w)为10% 50%，其中L-丝氨酸在总氨基酸中含量(w/w)为10% 95%。
3.根据权利要求1所述的L-半胱氨酸酶法转化制备方法，其特征在于步骤(2)所述的表面活性剂为吐温-80或十六烷基三甲基溴化铵或聚乙二醇辛基苯基醚，其浓度为0. 005 g/L 5. 0 g/L。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及L-半胱氨酸的酶法转化制备方法。该制备方法采用含有L-丝氨酸的混合氨基酸料液为原料，将具有L-色氨酸合成酶活性的湿菌体或粗酶液与含有L-丝氨酸的混合氨基酸料液混合，添加适量硫氢化物或硫化物，25～55℃，pH6～11条件下进行酶促反应，将反应生成的L-半胱氨酸通空气或滴加双氧水氧化，等电点结晶法分离得到L-胱氨酸，再经过电解还原制得L-半胱氨酸。该方法解决了混合氨基酸料液中L-丝氨酸的分离及综合利用难题，得到了附加值较高的L-半胱氨酸产品，具有原料来源广、价格低廉，操作简便，酶促转化时间短、生产成本低等优点。
文档编号C12P13/12GK102517352SQ201110446250
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者刘均忠, 刘茜, 曾庆群, 焦庆才, 王先兵, 肖国安 申请人:南京大学, 湖北新生源生物工程股份有限公司