专利名称：一种多种蛋白共表达载体的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种新的一种用于多种蛋白共表达的载体的构建方法，属生物和医药新技术领域。
背景技术：
为实现在同个细胞内表达多种蛋白，常用的手段是质粒共转染技术，但质粒的不相容性常会导致一种质粒的丢失，同时是否能够实现两个质粒在阳性转染率上一致也存在一定的困难。因此如果一个质粒能够表达多种蛋白将会有很大的优势。目前利用一种质粒表达多种蛋白的常用手段为加入IRES(核糖体内部进入位点)序列，对一种以上的蛋白进行表达。目前常用的是EMCV的IRES序列，但是IRES介导的翻译效率不可控，表达不太稳定。利用关于多启动子的报道多是基于串联多个启动子共同调控同一个蛋白的表达，目的是增强外源基因的表达率。本方法的思路在于在同一个质粒中插入多个同样的启动子序列及下游的PolyA序列，这样就能保证所需表达的基因在转录水平上处于完全一致的水平。而后续的翻译水平可以通过修饰AUG周围的序列进行更精确的不同基因蛋白表达水平的调控。因此，本方法能够使得同一个载体上实现多种基因共表达，也使得各基因表达产物按照规定的比例进行生成成为可能。通过本方法可以用于实现多种外源蛋白在真核细胞内的按定量的比例进行表达、也可以用于多种蛋白相互作用及示踪定位等研究，具有很大的应用前景。
发明内容
本发明的目 的在于提供一种多种蛋白共表达载体构建的方法，从而可以多种蛋白的共表达。本发明利用在同一载体中插入多个同一的启动子(如RSV、CMV、SV40、LIR、MMTV-LTR.ALV-LTA等)及下游的polyA序列，这样就能保证所需表达的基因在转录水平上处于完全一致的水平。而后续的翻译水平可以通过修饰AUG周围的序列进行更精确的不同基因蛋白表达水平的调控。以这样的质粒转染到哺乳动物细胞中，多种蛋白将能实现按固定比例的定量表达。本发明所述的载体构建的方法，主要为在同一载体中插入多个同一的启动子(如RSV、CMV、SV40、LIR、MMTV-LTR、ALV-LTA等)及下游的polyA序列，以保证各种基因在mRNA的水平一致性。本发明所述方法特征在于，以首先保证各种基因在mRNA的水平一致性，作为多种蛋白共同表达的基点。而后通过对AUG的优化来实现多种基因能够按固定比例进行表达。本发明的优点是用同一的启动子及下游polyA序列来保证各个基因在转录时处于几乎相同的环境，从而保证各种基因的转录产物mRNA能处于一致的水平。该方法使得多种蛋白的共表达更加精确和稳定，使得多种蛋白按设定比例进行表达成为可能。
图1双启动子双报告基因重组表达载体质粒结构简图。图 2 重组质粒 pC1-cmvDsRed-cmvEGFP 酶切鉴定。Ml:M =Lambda DNA/Hind III Marker ；1:pC1-cmvDsRed-cmvEGFP 经 XhoI, Sail 双酶切后的 EGFP 条带(720bp) ；2:pC1-cmvDsRed-cmvEGFP 经 Xbal，MluI 双酶切后的 DsRed 条带(680bp) ；3:pC1-cmvDsRed-cmvEGFP经Spel酶切,在201 Ibp出现特征性条带,鉴定为顺向连接双启动子M2: DNAMarkerD。图3、重组质粒PC1-cmvDsRed-cmvEGFP转染293T细胞48h后红绿荧光蛋白的表达情况。图4、Western blot检测红绿荧光蛋白表达情况。1:转染pCI_nEGFP的293T细胞中EGFP的相对表达量；2:转染pC1-nDsRed的293T细胞中DsRed的相对表达量；3:转染pC1-cmvDsRed-cmvEGFP 的 293T 细胞中 EGFP 的相对表达量；4:转染 pC1-cmvDsRed-cmvEGFP的293T细胞中DsRed的相对表达。实施例1pC1-cmvDsRed-cmvEGFP双启动子载体的构建a)pCI_EGFP 的构建以Clontech的EGFPNl为模板，带NheI酶切位点的正向引物EGFP-5 ^与带NotI酶切位点的反向引物EGFP-3'进行PCR扩增EGFP编码区片段。PCR产物经NheI及NotI双酶切回收之后，插回表达载体PCI的多克隆位点中，获得pC1-EGFP质粒。
b)pCI_DsRed 的构建以Clontech的DsRedNl为模板，带NheI酶切位点的正向引物DsRed-5'与带NotI酶切位点的反向引物DsRed-3丨进行PCR扩增DsRed编码区片段。PCR产物经NheI及NotI双酶切回收之后，插回表达载体PCI的多克隆位点中，获得pC1-DsRed质粒。c)双启动子重组表达载体的构建限制性内切酶BglII及BamH I双酶切pC1-DsRed，割胶回收含有CMV启动子区的DsRed片段；限制性内切酶BglII单酶切pCI_EGFP，与含有CMV启动子区的DsRed片段在T4连接酶的作用连接(BamHI与BglII为同尾酶)。转化，挑选阳性转化子，酶切鉴定(图2)，获得含2个CMV启动子区的重组双启动子双报告基因的质粒，命名为pC1-cmvDsRed-cmvEGFP，见图1。实施例2pC1-cmvDsRed-cmvEGFP双启动子载体表达分析细胞转染及观察将293T 细胞按 2.0 X 105 个 / 孔铺 6 孔板，24h 后按照 TurboFect in vitroTransfection Reagent说明书，每孔4 μ g质粒,加入6 μ g的TurboFect 阳离子复合物及无血清培养基共400 μ I室温孵育二十分钟，转染293Τ细胞，48h后于倒置荧光显微镜下进行观察。每种载体设3个重复，同时设未转染的细胞作为阴性对照。荧光显微镜观察结果显不，重组质粒pC1-cmvDsRed-cmvEGFP转染后48h的293T细胞在倒置突光显微镜下均可观察到不同强度的红色及绿色荧光，见图3。表明重组表达载体pC1-cmvDsRed-cmvEGFP在293T细胞中能够同时且正确表达两种信号蛋白。
Western Blot 分析收集转染48h 后的 293T 细胞，用 M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent抽提细胞全蛋白，采用Ant1-EGFP和Ant1-DsRed,按常规Western印迹方法进行抗体杂交，检测红绿突光蛋白的表达。通过WesternBlot检测红绿突光蛋白的表达情况,如图4所示，重组质粒pC1-cmvDsRed-cmvEGFP中红绿荧光蛋白的表达情况与荧光显微镜下观察到的结果相一致。图 4-A 显示转染了 pC1-nEGFP、pC1-nDsRed 及 pC1-cmvDsRed-cmvEGFP 的 293T细胞中红绿突光蛋白的Western Blot检测的表达情况；通过图像分析软件“Image J”分析,结果如图4-B所示,可见重组质粒pC1-cmvDsRed-cmvEGFP能正确表达红绿突光蛋白，且表达量与对照组pC1-nEGF P及pC1-nDsRed单独转染时相一致。
权利要求
1.一种新的多种蛋白共表达载体的构建的方法，该方法为在同一载体中插入多个同一的启动子(如RSV、CMV、SV40、LIR、MMTV-LTR、ALV-LTA等)及下游的polyA序列，以保证各种基因以保证各种基因在转录水平上一致性。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，在同一载体中插入多个同一的启动子及下游的po IyA序列 。
全文摘要
本发明涉及一种多种蛋白共表达载体的构建方法。本方法利用主要为在同一载体中插入多个同一的启动子(如RSV、CMV、SV40、LIR、MMTV-LTR、ALV-LTA等)及下游的polyA序列，以保证各种基因在转录水平上一致性。后续的翻译水平可以通过修饰AUG周围的序列进行更精确的不同基因蛋白表达水平的调控。以这样的质粒转染到哺乳动物细胞中，多种蛋白将能实现按固定比例的定量表达。
文档编号C12N15/63GK103184233SQ20111045517
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者朱瑞宇, 金坚, 高明珠 申请人:无锡瑞融生物医药有限公司