专利名称：O-磷酸丝氨酸巯解酶突变体以及利用其生产半胱氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种具有源自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的对应于SEQ ID NO: I氨基酸序列的O-磷酸丝氨酸巯解酶(又称“0PSS”)突变体，其缺失三至七个C-末端氨基酸残基。本发明还涉及编码该OPSS突变体的核酸分子、含有该核酸分子的表达载体以及利用该表达载体转化得到的转化体。此外，本发明涉及一种在OPSS突变体存在下，通过O-磷酰-L-丝氨酸(OPS)与硫化物发生反应生产半胱氨酸的方法。
背景技术：
半胱氨酸是一种在所有生物体中的硫代谢过程中起重要作用的氨基酸。它用于蛋白，如发角蛋白、谷胱甘肽、生物素、蛋氨酸和其它含硫代谢产物的生物合成，以及作为辅酶A的前体。此外，已知半胱氨酸的生物合成与其它氨基酸，包括L-丝氨酸、L-甘氨酸和L-蛋 氨酸的生物合成密切相关。工业上，L-半胱氨酸及其衍生物被应用于多种领域包括制药业(用于治疗支气管疾病)、化妆品行业(洗发水、烫发用组合物等)，以及食品行业(抗氧化齐U、调味剂、面团助剂(dough aids)等)。传统上，L-半胱氨酸在工业上是通过酸水解人类头发或动物羽毛而获得(KoAida 编，氨基酸生产的生物技术(Biotechnology of the Amino Acids Production)，p217-223，1986)。然而，不仅由头发或羽毛生产的半胱氨酸确实产量低至7_8%，而且使用盐酸或硫酸产生了大量的环境污染物。此外，消费者可能对从头发或羽毛提取具有强烈的反感。这些问题对于开发环保的L-半胱氨酸生产方法形成推动，导致了利用微生物发酵生产L-半胱氨酸。微生物生产L-半胱氨酸中的代表是利用微生物进行生物转化D，L-ATC (Ryu 0H,Ju JYJPShin CS，生物化学方法(Process Biochem.), 32 =201-209,1997) 然而，由于 D，L-ATC前体的低溶解度，该转换方法难以适用于工业。另一种L-半胱氨酸的生产方法是用大肠杆菌直接发酵(专利号 EP 0885962B ；ffada M和 Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem.,73 :48-54, 2006)。微生物中L-半胱氨酸的过度积累产生胞内毒性，导致高浓度L-半胱氨酸的生产受限。为了克服这一缺陷，使用了 L-半胱氨酸转运蛋白，然而产量没有出现显著改善。关于L-半胱氨酸在细菌和植物中的生物合成途径，O-乙酰丝氨酸(OAS)作为中间体前体提供L-半胱氨酸的碳骨架(Kredich NM和Tomkins GM, J. Biol. Chem. ,241 4955-4965，1966)。酶O-乙酰丝氨酸巯解酶(OASS)，用硫化氢作为硫供体，催化O-乙酰丝氨酸向硫胱氨酸的转化，最后生成半胱氨酸，释放乙酸。或者，SO4可被还原成硫代硫酸盐用作半胱氨酸生产中的硫供体(Nakamura Τ,Κοη Y, Iwahashi H,和Eguchi Y, J. Bacteriol.,156 =656-662,1983)。经由OAS的半胱氨酸生物合成途径使用两种酶，催化丝氨酸向OAS转化的丝氨酸乙酰转移酶(CysE),催化OAS向半胱氨酸转化的半胱氨酸合酶(CysK)。值得注意的是，其中丝氨酸乙酰转移酶(CysE)对终产物半胱氨酸的反馈抑制高度敏感(Wada M和Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem. ,73 :48-54, 2006)。因此,需要对反馈抑制不敏感的改变的酶，但是其很难开发。
发明内容
技术问题为了克服现有技术中遇到的问题，本发明人对高产L-半胱氨酸进行了深入和彻底的研究，结果发现在超嗜热古菌(Aeropyrum pernix)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)中存在着米用O-憐酸_L_丝氨酸(OPS)特异性途径而非OAS-特异性途径来合成L-半胱氨酸的O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS)(Mino K 和 Ishikawa K, FEBS letters,551 :133-138,2003 ；Burns KE,Baumgart S,Dorrestein PC,Zhai H,McLafferty FW,和 Begley TP,J. Am. Chem. Soc. ,127 11602-11603,2005 ；ffestrop GD，Goodall G, Mottram JC，和 Coombs GH, J. Biol. Chem.,281 :25062-25075,2006)，结核分枝杆菌的OPSS与额外的酶mec+和cysO 一起催化OPS 向半胱氨酸的转化，当其被去除五个C-末端氨基酸残基时，即使额外的酶不存在时也可利用Na2S作为硫供体使OPS转化成半胱氨酸(Agren D，Schnell R和Schneider G，FEBSletters, 583 =330-336, 2009)，从而实现本发明。技术方案因此，本发明的目的是提供一种具有源自耻垢分枝杆菌的对应于SEQ ID NO 1的氨基酸序列的O-磷酸丝氨酸巯解酶(又称“0PSS”)突变，其缺失三至七个C-末端氨基酸残基。本发明另一个目的是提供编码该OPSS突变体的核酸分子。本发明又一个目的是提供含有该核酸分子的表达载体。本发明还一个目的是提供用该表达载体转化得到的转化体。本发明又一个目的是提供一种在OPSS突变体存在下，用硫化物使O-磷酰-L-丝氨酸转化成半胱氨酸的方法。有益效果如上所述，酶活性提高的OPSS突变体对于由O-磷酸丝氨酸向L-半胱氨酸的酶转化是必不可少的，其可用于以简单的方式大规模由OPS高产L-半胱氨酸。
图I所示为根据温度的OPSS活性。图2所示为OPSS对pH的敏感性的组图。图3所示为通过SDS PAGE分析的pET系统和pCL_Pcjl系统中酶的表达水平的照片。图4所示为将纯化的OPS发酵培养液转化成半胱氨酸的OPSS的酶活性。图5所示为将OPS发酵培养液转化成半胱氨酸的OPSS的酶活性。图6所示为IL发酵罐中以OPS作为底物，通过OPSS转化的OPS和半胱氨酸的生产。图7为含有编码OPSS突变体的基因的pCL-Pcjl表达载体的示意图。
最佳实施方式按照其中一个方面，本发明提供一种源自耻垢分枝杆菌的具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的OPSS突变体，其较野生型O-磷酸丝氨酸巯解酶氨基酸序列缺少3 7个C-末
端氣基酸残基。在本发明的一个实施方案中，本发明的OPSS突变体可具有SEQ ID N0S:2、3和4中的一个氨基酸序列。具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的OPSS突变体可被进一步修饰成77位脯氨酸残基(Pro)被丝氨酸残基(Ser)取代。此外，具有SEQ ID NO : 2氨基酸序列的OPSS突变体可被进一步修饰成131位苏氨酸残基(Thr)被丙氨酸残基(Ala)取代，137位赖氨酸残基(Lys)被天冬酰胺残基(Asp)取代，以及238位苏氨酸残基(Thr)被丝氨酸残基(Ser)取代。此外，与上述突变体的氨基酸序列同源性至少为50 %，优选60 %、70 %、75 %和80 %，更优选85%、90%和95%，最优选97%至99%的氨基酸序列落入本发明的范围内。 术语“耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatics) ”是指放线菌门中的杆状菌株，其为扁平的、直的或稍弯的，有不规则的分支，可被碱性染料苯胺染色。在本发明中，发现当其氨基酸序列被修饰时，来自该菌株的O-磷酸丝氨酸巯解酶能够催化L-半胱氨酸以提高的产量生物合成。如本文所使用，术语“O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS) ”是指催化OPS转换成半胱氨酸的酶。该酶首次发现于超嗜热古菌(Aeropyrum pernix)中并被命名(Mino K和IshikawaK, FEBS letters,551 :133-138,2003, SEQ ID NO :6)。可使用各种众所周知的方法获得0PSS。这些方法的示例包括但不限于，基于密码子优化的基因合成技术，通过该技术能获得高产的目的酶，以及根据微生物遗传信息的大量储存，利用生物信息学方法筛选有用的酶资源。在本发明的一个实施方案中，利用OPS作为底物合成半胱氨酸的OPSS酶是从各种微生物中筛选到的。为此，使用合适的培养基及本领域已知的培养条件获得细胞沉淀(经裂解)，然后通过对含酶上清液的纯化来提供OPSS酶。如本文所使用，术语“突变体”是指显示出遗传或非遗传表型的稳定改变的培养物或个体。当与OPSS (O-磷酸丝氨酸巯解酶)结合使用时，术语“突变体”是指发生遗传改变，从而与野生型相比，活性得到有效提高的OPSS酶。基于甚至在额外的酶不存在的情况下，缺失五个C-末端氨基酸残基的源自结核分枝杆菌H37RV的OPSS突变体对含S2_基团的硫源显示出增加的亲和力的报道，OPSS突变体可通过缺失耻垢分枝杆菌OPSS的五个C-末端氨基酸残基来制备。本发明的OPSS突变体可具有源自耻垢分枝杆菌的对应于SEQ ID NO: I的氨基酸序列，其缺失三至七个，优选五个C-末端氨基酸残基。在本发明的一个实施方案中，观察到具有SEQ ID NO 2氨基酸序列突变被用于转化OPS为半胱氨酸后，显示出一小时内100%的转化率(表5)。氨基酸替换可进一步提高本发明OPSS突变体酶的活性。只要是本领域已知的，任何方法均可可用于改进酶。优选地，在本发明中，采用随机突变提高OPSS突变体酶的活性。具体地，OPSS进行随机突变后，本发明人利用基于HTS (高通量筛选)开发出的筛选系统筛选出酶活性提高的突变体。结果是，通过对Msm-T基因进行HTS筛选获得具有酶活性提高的OPSS突变体、Msm-T HA2和Msm-T-EP3。Msm_THA2是具有与SEQ ID NO :2相同的氨基酸序列的OPSS突变体，除了 77位的脯氨酸残基(Pro)被丝氨酸残基(Ser)取代。Msm-T-EP3是具有与SEQ ID NO :2相同的氨基酸序列的OPSS突变体，除了以下位置发生突变131位苏氨酸被丙氨酸残基(Ala)取代，137位天冬酰胺残基(Asp)被赖氨酸残基(Lys)取代，以及238位苏氨酸残基(Thr)被丝氨酸残基(Ser)取代。优选地，OPSS突变体Msm-T HA2和Msm-TEP3分别具有SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4表示的氨基酸序列。在本发明的一个实施方案中，发现Msm-T HA2和Msm-T EP3比具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的Msm-T显示出更高的酶活性(表5和6)。具体地，测出OPSS突变体Msm-THA2和Msm-T EP3相比对照Msm_T，在转化反应早期显示出提高5倍和I. 2倍的转化率。此夕卜，甚至当Msm-T HA2突变体的半胱氨酸合成活性比Msm-T酶高4倍，且其用量是Msm-T的40%时，半胱氨酸的终转化率是相似的。如本文所使用，术语“同源性”是指两个多肽之间的相似百分数。一条序列另一条 序列之间的相关性可采用本领域已知的技术确定。例如，同源性的确定可通过序列信息的比对和使用现成的计算机程序，直接比较两条多肽分子之间的序列信息。或者，同源性的确定可通过在使同源区之间形成稳定双链的条件下进行多核苷酸杂交，然后用特异性单链核酸酶消化并测定酶切片段的大小。如本文所使用，所有语法形式和拼写变化形式的术语“同源的”，是指具有共同进化起源”的蛋白之间关系，包括超家族蛋白(如免疫球蛋白超家族)和来自不同物种的同源蛋白(例如，肌球蛋白轻链等)。这些蛋白(及它们的编码基因)具有如由它们的序列相似性反映出的序列同源性。然而，在常见的用法和本发明的应用中，术语“同源的”在被副词如“高度地”修改时，可以指序列的相似性，其可能会或可能不会涉及到共同的进化起源。如本文所使用，所有语法形式的术语“序列相似性”，是指可能会或可能不会拥有共同的进化起源的核酸或蛋白的氨基酸序列之间的相似度或相关性。在一个具体实施方案中，当至少21% (优选至少约50%，更优选约75%、90%、95%、96%、97%或99%)的氨基酸序列与氨基酸序列的确定长度匹配时，两个氨基酸序列是“大体同源”或“大体相似”的。大体同源的序列可利用标准软件通过在序列数据库中比较序列，或在例如为该特定系统定义的严格条件下进行Southern杂交实验来确定。定义的杂交条件在本领域范围内(如Sambrook 等人，1989,见下)。本发明的OPSS突变体可催化巯基(SH基团)转移至OPS上以生产半胱氨酸。优选地，所述条件允许本发明的OPSS突变体发挥它们的最佳活性，包括i)存在0-2mMPLP(5’ -磷酸吡哆醛)或O-IOOmMDTT(二硫苏糖醇)作为辅因子，ii) 25 60°C的反应温度，以及iii)pH6. O 10. 0，但不仅限于此。通过将巯基基团转移到OPS底物上从而催化半胱氨酸合成的酶活性的测定与Ape-OPSS(O-磷酸丝氨酸巯解酶)的命名一起被公开。特别是，由于Ape-OPSS具有通过转移巯基基团使OAS转化成半胱氨酸的活性，该检测是基于对大肠杆菌半胱氨酸合成酶的测定(0ASS, O-乙酰丝氨酸巯解酶，EC 4. 2. 99. 8)) (Mino K 和 Ishikawa K, FEBS letters, 551 133-138,2003)。在本发明的一个实施方案的试验中，PLP为OAS (O-乙酰丝氨酸)或OPS提供巯基基团，其在半胱氨酸转化中作为OASS或OPSS的辅因子，添加浓度为O. 2mM。此外，由于其还原能力，加入DTT不仅可以防止暴露于空气的半胱氨酸的半胱氨酸氧化，而且还可以定量已经氧化的半胱氨酸的量。优选地，当加入25mM DTT或O. 2mM PLP时，半胱氨酸的转化率增加2. 3倍。也就是说，PLP和DTT对OPS转化成半胱氨酸具有正面的影响。如之前报道的，酶Ape-OPSS、Mtb-OPSS和Mtb-Τ的最佳反应温度是60°C或37°C，最适pH为 7. 4(Mino K和 Ishikawa K,FEBS letters, 551 :133-138,2003 ；Agren D,SchnellR和Schneider G，FEBS letters, 583 :330-336,2009) 基于该报道，具有提高的酶活性的OPSS突变体的转化反应条件可以得到优化。在本发明的一个实施方案中，OPSS突变体可在37°C 80°C下催化转化。具体地，可在高温下生长的来自古细菌(Archea spp.)的Ape-OPSS酶,在60°C下比在37°C下显示出更高的酶活性。此外，酶本身的高热稳定性使得最佳温度为60°C。另一方面，Msm-T在37°C 下显示出最佳酶活性，且不能耐受60°C下的热处理。据发现OPSS酶在pH值6. O 10. O下保持转化活性。检测到Ape-OPSS在pH7. 4显示出最佳酶活性，Msm-T在pH8. O 9. O显示出最佳酶活性。因此，Msm-T比Ape-OPSS具有更广泛的pH稳定范围。根据其另一个方面，本发明提供一种编码OPSS突变体的核酸分子。如本文所使用，术语“核酸分子”旨在包含DNA和RNA分子。构成核酸分子结构单元的核苷酸，不仅包括天然存在的核苷酸，而且包括糖部分或碱性部分修饰的类似物(Scheit,核苷酸类似物(Nucleotide Analogs), John Wiley,纽约(New York) (1980)；Uhlman 和 Peyman,化学综述(Chemical Reviews), 90 :543-584 (1990))。根据其又一个方面，本发明提供含有所述核酸分子的表达载体。“载体”是指任何用于克隆核酸和/或将核酸转移到宿主细胞中的载体。载体可以是连有另一个DNA片段的复制子，从而使所连接的片段得到复制。“复制子”是指任何能够在体内具有DNA复制自主单元功能，即能够在自身控制下进行复制的遗传元件(如质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)。术语“载体”包括用于将核酸在体外、胞外或体内引入宿主细胞中的病毒和非病毒性的载体。术语“载体”，也可包括微环DNA。例如，载体可以是不含细菌DNA序列的质粒。已证明富含CpG区的细菌DNA序列的去除可降低转基因表达沉默，并形成质粒 DNA 载体的持续表达(见例如，Ehrhardt, A.等，(2003)Hum Gene Ther 10 :215-25 ；Yet, N. S. (2002)MoI Ther 5 :731-38 ；Chen, Z. Y.等，(2004)Gene Ther 11:856-64)。术语“载体”也可包括转座子如睡美人(Sleeping Beauty) (Izsvak等,J. MoI. Biol. 302 93-102 (2000))，或人工染色体。作为载体，使用T7启动子的pET系统(Novagen公司)是本领域众所周知的。在本发明中，可毫无限制的使用本领域已知的各种表达系统。在本发明的一个实施方案中，由本发明人开发的使用CJl启动子的表达系统用于表达外源基因(见韩国专利
发明者严惠媛, 宋秉哲, 张真淑, 李京珉, 申秀安, 赵宰贤 申请人:Cj第一制糖株式会社