重组病毒的制造方法

专利名称：重组病毒的制造方法
技术领域：
本发明涉及保持所需纯度的重组病毒的制造方法、用于得到该重组病毒的转移载体及其制造方法，特别涉及在制造重组杆状病毒时目的以外的重组体的产生得到抑制的重组病毒的制造方法、用于得到该重组病毒的转移载体及其制造方法。
背景技术：
作为可将免疫原性外源蛋白质作为融合抗原而呈递在病毒粒子上的病毒粒子基因，已知杆状病毒gp64基因、水疱性口炎病毒糖蛋白基因、I型人免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人呼吸道合胞体病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素基因、B型流感病毒血凝素基因、单纯疱疹病毒糖蛋白基因、或者小鼠肝炎病毒S蛋白质基因。另一方面，作为针对感染症、癌等的疫苗用免疫原性外源蛋白质抗原，已知疟疾抗 原、流感病毒抗原、结核菌抗原、SARS病毒抗原、西尼罗热病毒抗原、登革热病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原虫抗原、锥虫抗原、住白细胞虫抗原，以及CEA、WT1、MAGE等癌抗原。此外，已知存在于人活体内的IL-2、IL-12、IL-6、或IFN-Y等细胞因子基因与免疫原性外源蛋白质基因进行融合的免疫原性蛋白质。使这些病毒粒子基因与免疫原性基因融合，表达的融合抗原在疫苗用途中得到利用。另一方面，使用了杆状病毒的蛋白质表达系统已在目标蛋白质的工业生产中得到利用。此外，近年来，可知杆状病毒不仅可将外源性基因导入至昆虫细胞，也可将外源性基因导入至哺乳动物，发现了基因治疗载体的可能性。例如，在专利文献I中公开了一种重组杆状病毒表达载体，其具有由在来自杆状病毒的初期基因启动子中包含编码病毒非结构蛋白质的基因的DNA区域与在来自后期基因的启动子中包含编码病毒结构蛋白质的基因的DNA区域构成的多个独立的启动子。此外，在专利文献2中公开了一种利用使用杆状病毒的基因重组技术生产蛋白质的方法，公开了一种蛋白质的生产方法，其中，使结合杆状病毒的gp64基因与编码所需蛋白质的基因而得到的融合基因表达，以使所需蛋白质与病毒粒子融合的形式进行生产，将融合有所需蛋白质的病毒粒子进行回收，将所需蛋白质从该病毒粒子上切断。在专利文献3中公开了一种经改良的导入基因的表达方法，其中，将外源性DNA的核苷酸密码子的使用频率优化，变成表达外源性DNA序列的宿主细胞的密码子使用频率，将所需蛋白在宿主细胞中进行表达。在专利文献4中，为了利用酵母得到由与子宫颈癌有关的HPV31L1基因所表达的蛋白质产物，公开了一种合成多核苷酸，其不含有由酵母识别的内部转录终止信号，编码密码子得到优化的HPV31L1以使得在酵母细胞内高水平表达。在专利文献5中，对于以蛋白质的表达为目的而优化核苷酸序列的方法及其装置，公开了一种适合表达的宿主细胞系的密码子优化方法。在专利文献6中，对于为了用作杀虫剂而将非同源性肽的信号序列与编码杀虫性毒素的基因摄入其基因组内的重组小菜蛾杆状病毒，为了编码杀虫性毒素的密码子优化基因可通过昆虫细胞蛋白质更有效率地利用，公开了一种用替代密码子置换的编码杀虫性毒素的表达盒。在专利文献7中公开了一种编码在细菌李斯特菌中表达的融合蛋白质的重组核酸分子，对于如下核酸分子、表达盒、及包含表达载体的细菌、以及包含该细菌的疫苗组合物进行了公开，所述核酸分子包含编码细菌本来的肽的信号序列的第一多核苷酸和编码外源性抗原的多肽的第二多核苷酸，该第一多核苷酸为针对细菌中的表达而使密码子得到优化的第一多核苷酸，该第二多核苷酸位于与第一多核苷酸相同的翻译阅读框中，在此重组核酸分子编码包含肽的信号序列及多肽的融合蛋白质。而且，公开了针对细菌中的表达而编码外源性抗原多肽的第二多核苷酸被密码子优化的重组核酸分子。如上所述，目前，出于提高或降低目标蛋白质在宿主中的表达效率的目的，进行了基因的密码子变换。本发明人等先前报告了如下内容制作使编码免疫抗原性蛋白质的氨基酸的多核苷酸与编码表达细胞的病毒粒子的蛋白质的多核苷酸进行融合的转移载体，例如进行与杆状病毒等的所需病毒DNA的同源重组，将制得的重组病毒用作疫苗等医药组合物(专利 文献8)。现有技术文献专利文献专利文献I:日本专利第3366328号公报专利文献2:日本特开2002-253263号公报专利文献3:国际公开第2006/024867号小册子专利文献4:国际公开第2004/084831号小册子专利文献5:国际公开第2004/059556号小册子专利文献6:国际公开第1999/58705号小册子专利文献7:国际公开第2005/071088号小册子专利文献8:国际公开第2007/091624号小册子

发明内容
本发明提供通过抑制在制造重组病毒特别是制造重组杆状病毒时引起的目的之外的重组病毒的产生从而高纯度地制造发挥所需免疫抗原性且可用作疫苗等医药品的方法，及用于制造该重组病毒的转移载体的制造方法。如上所述，本发明人等以前进行了如下专利申请，即在昆虫细胞中和脊椎动物细胞中可将所需免疫原性外源蛋白质与构成病毒粒子的蛋白质作为融合蛋白质进行表达的转移载体及用其制得的重组杆状病毒(专利文献8)，但是在使用该转移载体而制造重组杆状病毒时，有时编码目标免疫抗原性外源蛋白质的基因的DNA区域缺失的目的之外的重组杆状病毒(以下，也称作“变异病毒”)包含在制得的重组杆状病毒中，有可能引起包含目标重组杆状病毒的医药品的纯度降低。因此，本发明人等针对该问题进行了深入研究，结果发现将与转移载体连结的融合基因中编码病毒粒子构成蛋白质的基因序列与天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列进行比较，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列，和/或以使构成该蛋白质的氨基酸的一部分缺失的方式改变多核苷酸序列，在使用该转移载体与杆状病毒DNA—起共转染至昆虫细胞中进行时，可显著抑制上述变异病毒的产生，结果可高纯度地制造所需重组杆状病毒。SP，本发明涉及下述1) 21)。I) 一种转移载体的制造方法，其特征在于，是连结有融合基因的转移载体的制造方法，所述融合基因包含至少一种编码病毒粒子构成蛋白质的基因、和编码免疫原性外源蛋白质的基因，对于所述编码病毒粒子构成蛋白质的基因而言，与天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列相比，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列，和/或以构成该蛋白质的氨基酸的一部分缺失的方式改变多核苷酸序列。2)—种转移载体的制造方法，其特征在于，是连结有融合基因的转移载体的制造方法，所述融合基因包含至少一种编码病毒粒子构成蛋白质的基因、和编码免疫原性外源蛋白质的基因，对于所述编码病毒粒子构成蛋白质的基因而言，与天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列相比，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列。 3)根据上述I)的方法，其中，进行下述(a) (C)和/或(d广Ce):(a)对于编码病毒粒子构成蛋白质的基因而言，与天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列相比，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式进行多核苷酸序列的改变，得到包含编码病毒粒子构成蛋白质的基因的多核苷酸的核酸序列信息的工序；(b)基于在所述工序(a)中得到的核酸序列信息，合成多核苷酸的工序；(C)将编码免疫原性外源蛋白质的基因的多核苷酸连结或者插入至所述工序(b)中合成的多核苷酸的工序；(d)合成对构成病毒粒子构成蛋白质的氨基酸的一部分缺失而形成的该蛋白质的部分多肽进行编码的多核苷酸，或合成以该部分多肽的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列而得的多核苷酸的工序；(e)将编码免疫原性外源蛋白质的基因的多核苷酸连结或插入至所述工序(d)中合成的多核苷酸的工序。4)根据上述I)或2)的方法，其中，融合基因是在其上游包含编码来自病毒粒子构成蛋白质的信号序列的多核苷酸的融合基因。5)根据上述I)或2)的方法，其中，编码病毒粒子构成蛋白质的基因为杆状病毒gp64基因、水疱性口炎病毒糖蛋白基因、I型人免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人呼吸道合胞体病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素基因、B型流感病毒血凝素基因、单纯疱疹病毒糖蛋白基因或小鼠肝炎病毒S蛋白质基因中的任一种。6)根据上述I)或2)的方法，其中，编码病毒粒子构成蛋白质的基因为杆状病毒gp64基因。7)根据上述I)或2)的方法，其中，编码免疫原性外源蛋白质的基因是选自疟疾抗原、流感病毒抗原、结核菌抗原、SARS病毒抗原、西尼罗热病毒抗原、登革热病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原虫抗原、锥虫抗原、住白细胞虫抗原及癌抗原中的抗原的基因，或者是选自这些抗原基因组中的至少一种与细胞因子的融合抗原的基因。8)根据上述I)或2)的方法，其中，转移载体是在能在脊椎动物细胞中起作用的启动子与杆状病毒的启动子连结而得的双重启动子的下游连结融合基因的转移载体。
9)根据上述8)的方法，其中，所述能在脊椎动物细胞中起作用的启动子是选自巨细胞病毒启动子、SV40启动子、逆转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克蛋白启动子、CAG启动子、延伸因子I a启动子、肌动蛋白启动子、泛素启动子、白蛋白启动子及MHC类启动子中的任一种，杆状病毒的启动子是选自多角体启动子、PlO启动子、IEl启动子、p35启动子、p39启动子及gp64启动子中的任一种。10)—种转移载体的制造方法，其特征在于，是在包含至少一种编码病毒粒子构成蛋白质的基因的病毒DNA区域之间插入有编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA区域的转移载体的制造方法，将与编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA区域进行融合的N末端侧和/或C末端侧的病毒DNA区域的多核苷酸序列，以相对于天然来源的同一病毒DNA区域的多核苷酸序列同源性降低的方式进行改变，和/或以构成病毒粒子构成蛋白质的氨基酸的一部分缺失的方式改变该多核苷酸序列。11) 一种重组杆状病毒的制造方法，其特征在于，是使用了连结有融合基因的转移载体的重组杆状病毒的制造方法，所述融合基因包含至少一种编码病毒粒子构成蛋白质的基因、和编码免疫原性外源蛋白质的基因，将所述转移载体与杆状病毒DNA共转染至昆虫 宿主细胞中，所述转移载体如下形成对于所述编码病毒粒子构成蛋白质的基因而言，与天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列相比，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式改变其多核苷酸序列，和/或以构成该蛋白质的氨基酸序列的一部分缺失的方式改变其多核苷酸序列。12)—种转移载体，其特征在于，是连结有融合基因的转移载体，所述融合基因包含至少一种编码病毒粒子构成蛋白质的基因、和编码免疫原性外源蛋白质的基因，对于所述编码病毒粒子构成蛋白质的基因而言，与天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列相t匕，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列，和/或以构成该蛋白质的氨基酸的一部分缺失的方式改变多核苷酸序列。13)—种转移载体，其特征在于，是连结有融合基因的转移载体，所述融合基因包含至少一种编码病毒粒子构成蛋白质的基因、和编码免疫原性外源蛋白质的基因，对于所述编码病毒粒子构成蛋白质的基因而言，与天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列相t匕，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列。14)根据上述12)的转移载体，是通过进行下述(a) (C)和/或(d) (e)而制得的(a)对于编码病毒粒子构成蛋白质的基因而言，与天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列相比，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式进行多核苷酸序列的改变，得到包含编码病毒粒子构成蛋白质的基因的多核苷酸的核酸序列信息的工序；(b)基于在所述工序(a)中得到的核酸序列信息，合成多核苷酸的工序；(c)将编码免疫原性外源蛋白质的基因的多核苷酸连结或插入至所述工序(b)中合成的多核苷酸的工序；(d)合成对构成病毒粒子构成蛋白质的氨基酸的一部分缺失而形成的该蛋白质的部分多肽进行编码的多核苷酸，或合成以该部分多肽的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列而得的多核苷酸的工序；
(e)将编码免疫原性外源蛋白质的基因的多核苷酸连结或插入至所述工序(d)中合成的多核苷酸的工序。15)根据上述12)或13)的转移载体，其中，融合基因是在其上游连结有编码来自病毒粒子构成蛋白质的信号序列的多核苷酸的融合基因。16)根据上述12)或13)的转移载体，其中，编码病毒粒子构成蛋白质的基因为杆状病毒gp64基因、水疱性口炎病毒糖蛋白基因、I型人免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人呼吸道合胞体病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素基因、B型流感病毒血凝素基因、单纯疱疹病毒糖蛋白基因或小鼠肝炎病毒S蛋白质基因中的任一种。17)根据上述12)或13)的转移载体，其中，编码病毒粒子构成蛋白质的基因为杆状病毒gp64基因。18)根据上述12)或13)的转移载体，其中，编码免疫原性外源蛋白质的基因是选自疟疾抗原、流感病毒抗原、结核菌抗原、SARS病毒抗原、西尼罗热病毒抗原、登革热病毒抗 原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原虫抗原、锥虫抗原、住白细胞虫抗原及癌抗原中的抗原的基因，或者是选自这些抗原基因组中的任一种与细胞因子的融合抗原的基因。19)根据上述12)或13)的转移载体，是在能在脊椎动物细胞中起作用的启动子与杆状病毒的启动子连结而得的双重启动子的下游连结融合基因的转移载体。20)根据上述19)的转移载体，其中，所述能在脊椎动物细胞中起作用的启动子是选自巨细胞病毒启动子、SV40启动子、逆转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克蛋白启动子、CAG启动子、延伸因子I a启动子、肌动蛋白启动子、泛素启动子、白蛋白启动子及MHC类启动子中的任一种，杆状病毒的启动子是选自多角体启动子、PlO启动子、IEl启动子、P35启动子、p39启动子及gp64启动子中的任一种。21)—种转移载体，其特征在于，是在包含至少一种编码病毒粒子构成蛋白质的基因的病毒DNA区域之间插入有编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA区域的转移载体，将与编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA区域进行融合的N末端侧和/或C末端侧的病毒DNA区域的多核苷酸序列，以相对于天然来源的同一病毒DNA区域的多核苷酸序列同源性降低的方式进行改变，和/或以构成病毒粒子构成蛋白质的氨基酸的一部分缺失的方式改变该多核苷酸序列。若使用本发明的转移载体，则在利用同源重组技术而制作所需重组病毒的共转染时，可抑制编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA区域缺失的产生物(变异病毒DNA)的生成，可由靶标细胞高纯度地制造所需重组病毒。即，根据本发明，可高效率地制造可用作疟疾、流感病毒、结核、肝炎等感染症、癌、自身免疫性疾病等的治疗和/或预防药或者可用作细胞医药、疫苗制剂的重组病毒，特别是重组杆状病毒。


图I是示出继代培养的杆状病毒的纯度降低与变异病毒DNA的增加的图。图2是示出在病毒溶液中存在的变异病毒为gp64基因的变异病毒的图。图3是示出在由编码病毒粒子构成蛋白质的病毒DNA区域以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式得到改变、或者上述DNA区域一部分缺失的DNA区域构成的融合构建物中，未检测或者难以检测变异病毒的图。
图4是示出在由编码病毒粒子构成蛋白质的病毒DNA区域一部分缺失的DNA区域构成的融合构建物中无论抗原基因的不同与否都难以检测变异病毒的图。图5是示出在由编码病毒粒子构成蛋白质的病毒DNA区域以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式得到改变、或者上述DNA区域一部分缺失的DNA区域构成的融合构建物中得到高纯度的重组杆状病毒的图。图6是示出无论单启动子和双重启动子的不同与否都出现变异病毒的图。图7是示出即使在纳入以构成GP64蛋白质的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列的gp64基因的杆状病毒中，也可使所需基因与来自gp64基因的融合蛋白进行表达的图。图8是确认在图7中使用的重组杆状病毒中不产生变异病毒的图。
具体实施方式

就本说明书中利用氨基酸、肽、碱基序列、核酸等的代号的表示而言，按照IUPAC-IUB 的规定[IUPAC-1UB Communication on Biological Nomenclature, Eur.J. Biochem. ,138:9 ( 1984)]、“用于制作包含碱基序列或氨基酸序列的说明书等的指南”(专利厅编)及在该领域中的惯用符号。在本说明书中，所谓DNA分子意思是不仅包含双链DNA，而且还包含构成该双链DNA的正义链和反义链这样的各单链DNA，此外并不受其长度所限制。因此，只要未特别言及，在编码本发明的免疫原性外源蛋白质的多核苷酸(DNA分子)中包含如下中的任意种类包含基因组DNA的双链DNA及包含cDNA的单链DNA (正义链)以及具有与该正义链互补的序列的单链DNA (反义链)及合成DNA、它们的片段。此外，在本说明书中，多核苷酸、DNA分子无论功能区域有何区别，均可包含表达抑制区域、编码区域、前导序列、外显子及内含子中的至少一种。此外，在多核苷酸中包含RNA和DNA。在由特定氨基酸序列构成的多肽和由特定DNA序列构成的多核苷酸中，包含它们的片段、同源体、衍生体及变异体。例如，在变异体DNA中包含天然存在的等位基因变异体；非天然存在的变异体；进行缺失、取代、添加及插入的变异体等。在本发明中，在利用同源重组技术由转移载体制作所需重组病毒的工序中，对于有时在分析时出现的预想之外的PCR产物，有时特别将编码免疫抗原性蛋白质的基因的DNA区域缺失而得的产生物称作变异病毒DNA。在本发明中，所谓“构成蛋白质的氨基酸不改变的多核苷酸序列的改变”，可举出以构成蛋白质的氨基酸不改变的方式使多核苷酸的序列同源性降低的情形，例如，可举出目视观察遗传密码表等而任意选择编码天然来源的氨基酸的密码子，或者利用计算机软件而进行机械性选择，选择与编码天然来源的氨基酸的密码子不同的密码子，使天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列与整体序列同源性降低。以下，对于本发明的转移载体、重组病毒特别是重组杆状病毒进行说明。本发明的转移载体是插入有包含至少一种编码病毒粒子构成蛋白质的基因与编码免疫原性外源蛋白质的基因的融合基因、且在该融合基因的上游及下游具有可与杆状病毒DNA发生同源重组的DNA的质粒。此外，就转移载体而言，作为启动子，需要至少拥有可在昆虫细胞中表达的杆状病毒的启动子，但是不仅可拥有单一启动子，也可拥有脊椎动物启动子(哺乳动物启动子和鸟类启动子)与杆状病毒的启动子连结而成的双重启动子。作为脊椎动物启动子(能在脊椎动物细胞中起作用的启动子),可例示哺乳动物启动子、鸟类启动子等启动子。作为哺乳动物启动子(能在哺乳动物细胞中起作用的启动子)，可例示巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、逆转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克蛋白启动子、CAG启动子、延伸因子I a启动子、肌动蛋白启动子、泛素启动子、白蛋白启动子、MHC类启动子等。作为鸟类启动子，可例示肌动蛋白启动子、热休克蛋白启动子、延伸因子启动子、泛素启动子、白蛋白启动子。作为杆状病毒启动子,可例示多角体(Polh)启动子、plO启动子、IEl启动子、p35启动子、p39启动子、gp64启动子等。此外，作为双重启动子，可很好地例示作为脊椎动物启动子的巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV启动子得到改良的CAG启动子、或泛素(UBB)的启动子与CMV增强子接合而成的启动子与作为杆状病毒启动子的多角体(Polh)启动子连结而得的启动子。
被连结的脊椎动物启动子特别是哺乳动物启动子与杆状病毒启动子的两个启动子的多核苷酸序列可直接连结，也可在相互的启动子的DNA序列之间存在插入DNA序列。
此外，被连结的脊椎动物启动子特别是哺乳动物启动子与杆状病毒启动子在启动子区域中均可配置在接近表达基因的位置，在后述实施例中，以杆状病毒启动子位于与哺乳动物启动子相比更接近表达基因的位置的结构进行制作。构成本发明融合基因的DNA的编码病毒粒子构成蛋白质的基因序列可通过与天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列相比，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式改变核苷酸而得的多核苷酸序列、或者以构成病毒粒子构成蛋白质的氨基酸的一部分缺失的方式改变核苷酸而得的多核苷酸序列(进而，可使该多核苷酸序列以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式得到改变)而进行特定。针对编码病毒粒子构成蛋白质(包含其氨基酸的一部分缺失的部分多肽)的多核苷酸序列进行的以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式的改变可通过将包含编码利用病毒粒子的构成成分得到的蛋白质的病毒DNA区域的多核苷酸序列与天然来源的多核苷酸序列进行比较而进行，但是从可抑制共转染时的编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA区域缺失的产生物(变异病毒DNA)的生成而制作高纯度的重组病毒的方面考虑，优选以在改变前后整体碱基序列的同源性成为85%以下、进而成为80%以下、进而成为70%以下的方式进行来决定多核苷酸序列信息。在此，就多核苷酸序列的同源性而言，利用Lipman-Pearson法(Science, 227,1435, (1985))等进行计算即可,例如,使用遗传信息处理软件Genetyx-Win (Ver. 5. I. I ;软件开发)的同源性分析(Search homology)程序,将Unit size to compare (ktup)设为2进行分析，由此算出。此外，作为病毒粒子构成蛋白质，如杆状病毒GP64蛋白质这样，使用杆状病毒的病毒构成蛋白质时，在病毒基因组DNA中存在编码该蛋白质的天然DNA序列(内源性病毒DNA序列)，因此需要通过与该多核苷酸序列比较，以构成天然来源的病毒粒子构成蛋白质的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列，针对天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列，使整体多核苷酸序列的同源性降低。
天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列的不改变该氨基酸序列的核苷酸的改变可参考公知的遗传密码表进行识别，从而进行特定，或者可使用软件等，从而对在作为以医药组合物给药的对象的人细胞中考虑到表达改良的各基因的多核苷酸序列进行特定。包含将天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列进行该氨基酸序列不改变的核苷酸的改变而得到的多核苷酸序列的融合基因的多核苷酸序列例如可例示由实施例I的序列号34的多核苷酸序列所示的多核苷酸序列。该多核苷酸序列在改变前后，序列的同源性降低至77%以下，在该情况下，能更可靠地抑制共转染时的免疫抗原性基因的DNA区域缺失的变异病毒DNA的产生，可使所需融合蛋白质在病毒粒子上进行表达(参照实施例7、
8、及 10)。此外，所谓“以构成病毒粒子构成蛋白质的氨基酸的一部分缺失的方式改变核苷酸”是指生成病毒粒子构成蛋白质的氨基酸的一部分缺失的多肽(部分多肽)的多核苷酸序列的改变，可举出使编码病毒粒子构成蛋白质的天然(来源)的多核苷酸的碱基的一部分缺失的情况。此外，在该改变的多核苷酸中，可进一步进行构成部分多肽的氨基酸不改变的多 核苷酸序列的改变。在此，作为部分多肽，只要是在昆虫细胞中可表达作为能成为病毒粒子的构成成分的蛋白质即可，例如，可举出去除病毒粒子构成蛋白质的N末端侧的氨基酸而长度相对于全长氨基酸序列成为例如55 1%、优选35 1%、更优选15 1%的蛋白质，优选地，可举出与融合的免疫原性外源蛋白质的全长序列相比长度短的多肽。例如，若举出将杆状病毒GP64蛋白质用作病毒粒子构成蛋白质时的示例，则如后述实施例所示，包含信号序列(20个氨基酸序列)的全长序列为512个氨基酸序列长，与此相对，免疫原性外源蛋白质的氨基酸序列长为330个氨基酸(残基)长时，以成为由261个氨基酸序列长(51%)构成的融合体、由66个氨基酸序列长(13%)构成的融合体的方式改变核苷酸时，可相当抑制变异病毒DNA的出现，可得到所需高纯度的DNA融合体。因此，在将杆状病毒GP64蛋白质用作病毒粒子构成蛋白质时，可举出将除了信号序列(1-20 )以外的构成GP64蛋白质的氨基酸(21-512 )的N末端侧的氨基酸去除例如251个、446个而得的部分肽，更具体而言，可举出由272-512、467-512的氨基酸构成的部分肽。应予说明，GP64蛋白质的氨基酸序列的GenBank登录号为AAA66758(序列号62)。作为编码病毒粒子构成蛋白质的基因，可举出编码能够成为病毒粒子的构成成分的蛋白质的基因，例如，可例不出杆状病毒GP64蛋白质(GenBank Accession No. L22858)、水疱性口炎病毒糖蛋白G (VSVG:GenBank Accession No. M27165)、单纯疱疫病毒糖蛋白(K0S:GenBank Accession No. K01760)、I 型人免疫缺陷病毒 gpl20 (GenBank AccessionNo. U47783)、人呼吸道合胞体病毒膜糖蛋白(GenBank Accession No. M86651 )、A型流感病毒血凝素蛋白质(GenBank Accession No. U38242)等的基因、或者与杆状病毒近缘的病毒包膜蛋白等的基因，其中，优选杆状病毒GP64蛋白质基因。上述编码病毒粒子构成蛋白质的基因的多核苷酸的制造可通过如下方式容易地制造获得，即，基于对于编码天然来源的病毒粒子构成蛋白质的氨基酸序列的基因，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列而得到的多核苷酸、或编码构成病毒粒子构成蛋白质的氨基酸的一部分缺失的该蛋白质的部分多肽的多核苷酸(包含以构成该部分多肽的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列而得的多核苷酸)的核酸序列信息，进行合成(DNA化学合成法)等。构成本发明的融合基因的DNA的编码免疫原性外源蛋白质的基因的多核苷酸序列可利用编码免疫原性外源蛋白质的多核苷酸序列的天然来源的核酸序列信息进行特定，但是与上述病毒粒子构成蛋白质同样，对于该多核苷酸序列，可以是以构成天然来源的免疫原性外源蛋白质的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列而得的多核苷酸，可通过基于该多核苷酸序列的核酸序列信息进行合成(DNA化学合成法)等而容易地制造获得。编码免疫原性外源蛋白质的氨基酸序列的基因的多核苷酸序列与构成免疫原性外源蛋白质的氨基酸不改变的多核苷酸序列的核苷酸改变可参照公知的遗传密码表进行识别而进行特定，或者也可通过使用Gene Designer (DNA2. 0社；Gene Designer ；https://www. dna20. com/index. php pageID=220),或 Optimizer (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER)的软件，对考虑了在脊椎动物细胞、进而是哺乳动物细胞、特别是人细胞中的表达改良的各基因的多核苷酸序列进行特定。在本发明中，作为编码免疫原性外源蛋白质的基因，在为哺乳动物的情况下，可例 示编码人、牛、马、猪、羊、猴、小鼠、狗、猫等的感染症等的抗原蛋白质的基因，在为鸟类的情况下，可例示鸡、鸭、鸽子、火鸡、珍珠鸡、鹦鹉等的感染症等的抗原基因(例如禽流感S抗原)，在此，所谓“外源性”基因是指从外部导入的基因，即使同一基因位于细胞内，也属于“外源性”基因。报告了上述哺乳动物与鸟类的感染症的关联的病原体基因可从保存登记有Genbank等的病原体基因的公共数据库的机构容易地获得。其中，在为哺乳动物的情况下，具体而言，可例示编码用于预防、治疗疟疾、流感病毒、结核等感染症、自身免疫性疾病、癌等的作为包含疫苗疗法在内的免疫疗法的免疫原的抗原蛋白质的基因。在此，作为编码疟疾抗原的氨基酸序列的基因，可例示编码CSP蛋白质、MSPl蛋白质、LSAl蛋白质、SERA蛋白质、TRAMP蛋白质、AMAl蛋白质等蛋白质的基因。作为编码流感病毒抗原的氨基酸序列的基因，可例示编码HA抗原(血凝素抗原)、NA抗原(神经氨酸酶抗原)、M2抗原(基质蛋白抗原)、NP抗原(核衣壳蛋白抗原)等蛋白质的基因。作为编码针对结核的抗原蛋白质的氨基酸序列的基因，可例示编码HSP65(65_kDaheat shock protein)、a 抗原(Antigen85A、Antigen85B、Antigen85C)、Mtb72f、MDP-1、ESAT-6、MPB51、Mtb8. 8、Mtb9. 9、Mtb32、Mtb39 及 Mtbll 等蛋白质的基因。作为编码针对癌的抗原蛋白质的氨基酸序列的基因，可例示编码CEA、WT1、MAGE,HER2/neu、SART等蛋白质的基因。此外，在本发明中，就编码免疫原性外源蛋白质的基因而言，除了如上所述的存在于人活体外的免疫抗原以外，存在于人活体内的细胞因子基因，例如IL-12基因、IL-6基因、IL-6受体基因、IL-2基因、IL-18基因、IFN- y基因、M-CSF基因等细胞因子基因，或者具有免疫原性的任意抗原与上述抗原蛋白质的基因用基因重组技术进行融合而得的融合基因，只要从外部导入，也可作为编码免疫原性外源蛋白质的基因进行操作。应予说明，在本发明中利用的多核苷酸序列并不限定于编码具有上述免疫原性的抗原蛋白质的多肽的多核苷酸序列的全长序列，只要由多核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白质具有抗原性，就可以是编码部分氨基酸序列或者反复的部分氨基酸序列的多核苷酸序列，或者编码蛋白质的部分氨基酸序列彼此融合的部分氨基酸序列的多核苷酸序列。上述中编码免疫原性外源蛋白质的基因的天然来源的多核苷酸序列，或者以构成该天然来源的免疫原性外源蛋白质的氨基酸不改变的方式改变的多核苷酸序列，可通过直接合成与该序列相当的DNA (DNA化学合成法)而容易地制造获得。在该制造中，可应用常规的基因工程学方法[例如，参照 Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab.Press (1989);续生化学实验讲座“基因研究法I、II、III”，日本生物化学会编(1986)等]。此外，作为该多核苷酸的合成方法，可例示磷酸三酯法、亚磷酰胺法等的化学合成方法[J. Am. Chem. Soc.，89，4801 (1967);同 91，3350 (1969) ;Science, 150,178 (1968)；Tetrahedron Lett.，22,1859 (1981);同 24，245 (1983)]及它们的组合方法。更具体而言，该多核苷酸可利用亚磷酰胺法或者三酯法进行化学合成，也可利用市售的自动寡聚核苷酸合成装置进行合成。双链片段可通过合成互补链，在适当的条件下使化学合成该互补链而得的单链退火或者使用适当的引物序列和DNA聚合酶对化学合成该互补链而得的单链进行添加而得到。 此外，编码天然来源的免疫原性外源蛋白质的基因的多核苷酸可利用基因工程学的方法进行制造，更具体而言，可从表达编码免疫原性外源蛋白质的基因的多核苷酸的适当起源开始，按照常规方法制备cDNA库，使用编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA所特有的适当探针、对表达物的抗体，从该库中选择所需克隆，由此实施[参照Proc. Natl.Acad. Sci.，USA.，78，6613 (1981) ；Science, 222, 778 (1983)等]。在上述中，作为基因组DNA的起源，可例示表达编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA的各种细胞、组织、来自这些的培养细胞等。特别是，优选以流感病毒感染细胞提取物、疟疾原虫感染的感染红血球提取物、结核菌提取物等为起源。来自该起源的全部DNA、RNA的提取和分离、mRNA的分离和精制、cDNA的获得及其克隆等均可按照常规方法进行实施。编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA的制造，如上所述，使用以上述提取物为起源并将免疫原组织、细胞的mRNA提取、分离、精制而得的各免疫原的cDNA库进行实施，除此以外，例如也可以使用噬菌体库来进行，所述噬菌体库如下制备提取上述各免疫原的mRNA后，将Poly A添加至该RNA中后，收集添加有该Poly A的RNA，用逆转录酶来制造cDNA，在该cDNA的两端添加限制性内切酶部位后，纳入噬菌体中。将编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA从cDNA库中筛选的方法也没有特别限制，可按照常规方法进行。作为具体的方法，例如可例示通过使用了针对由cDNA产生的蛋白质的特异性抗体(例如，抗疟疾抗体、抗流感病毒抗体、抗结核菌抗体)的免疫筛选而选择对应的cDNA克隆的方法；使用与目标DNA序列选择性结合的探针的噬菌斑杂交法；菌落杂交法等；及它们的组合。作为在上述各杂交法中使用的探针，通常是基于与编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA序列相关的信息而化学合成的DNA片段等。此外，已经获得的编码免疫原性外源蛋白质的基因及其片段的DNA序列也可有利地用作上述探针。进而，也可将基于免疫原性外源性基因的DNA序列信息而设定的正义引物和反义引物用作上述筛选用探针。作为探针使用的DNA (核苷酸)是与免疫原性外源性基因的DNA序列对应的部分DNA (核苷酸)，具有至少15个的连续的DNA、优选具有至少20个的连续的DNA，更优选具有至少30个的连续的DNA。还可将用于制造上述DNA的阳性克隆本身也用作探针。在获得编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA时，可优选地利用根据PCR法[Science, 230,1350 (1985)]的DNA/RNA扩增法。特别是，在难以从库中得到全长的cDNA时，优选米用 RACE 法[Rapid amplification of cDNA ends ;实验医学，12(6), 35( 1994)],特别是 5’ -RACE 法[M. A. Frohman, et al.，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA. ,8,8998 (1988)]
坐寸o用于PCR法的引物可基于编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA序列信息而适当设定，按照常规方法进行合成。应予说明，作为该引物，如后述实施例所示，也可使用在纳入有编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA而得的载体质粒的该DNA的两端添加的DNA部分(SP6启动子引物和17终止子引物)。应予说明，用PCR法扩增的DNA片段的分离精制可按照常规方法例如凝胶电泳法 等进行实施。如上述得到的编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA或者各种DNA片段可按照常规方法例如可按照双脱氧链中止法[Proc. Natl. Acad. Sci.，USA.，74，5463 (1977)]、Maxam-Gilbert DNA 化学降解法[Methods in Enzymology, 65,499 (1980)]等，并简便地使用市售的测序试剂盒等，确定其DNA序列。本发明的融合基因的多核苷酸序列可以为由将这些上述2种基因直接连结而成的多核苷酸序列构成，也可在这些基因之间存在插入DNA序列(但是，在该情况下，需要以下游侧的基因与上游侧的基因不发生移码的方式进行配置)。所需免疫原性外源蛋白质的抗原呈递区域优选与病毒粒子构成蛋白质进行融合，因此需要以不将所需免疫原性外源蛋白质从病毒粒子构成蛋白质上分开地与该蛋白质融合的形态进行使用。例如，在本实施例所例示的重组病毒中，就杆状病毒GP64蛋白质而言，N末端在粒子外侧露出，C末端在粒子内侧露出，因此若使所需免疫原性外源蛋白质与GP64蛋白质的N末端侧融合，则在昆虫细胞中其整体作为病毒粒子的构成成分在病毒蛋白质粒子的外侧露出，从而抗原呈递变得更容易，可以说更适于作为疫苗制剂的目的。此外，本发明的包含至少一种编码病毒粒子构成蛋白质的基因与编码免疫原性外源蛋白质的基因的融合基因优选是在其上游包含编码用于促进表达的蛋白质向宿主外的分泌的信号肽(信号序列)的多核苷酸。信号序列优选为表达的病毒粒子构成蛋白质的信号序列，但是也可为在病毒可增殖的细胞内起作用的蛋白质的信号序列。作为信号序列，在使用来自表达的病毒粒子构成蛋白质的信号序列时，本发明的融合基因能够成为在编码信号序列的多核苷酸与编码病毒粒子构成蛋白质的基因的多核苷酸序列之间夹持(插入)编码免疫原性外源蛋白质的基因的多核苷酸序列的结构体。即，作为本发明的优选融合基因，是在编码包含信号序列的病毒粒子构成蛋白质的该信号序列的多核苷酸与编码病毒粒子构成蛋白质的多核苷酸之间插入编码免疫原性外源蛋白质的基因的多核苷酸序列的结构体，可举出将编码包含信号序列的病毒粒子构成蛋白质的全长氨基酸序列的天然来源的多核苷酸序列的核苷酸以构成天然来源的病毒粒子构成蛋白质的氨基酸不改变的方式而使多核苷酸序列改变而得的融合基因。 换言之，本发明的转移载体中包含下述转移载体，即，是在包含至少一种编码病毒粒子构成蛋白质的基因的病毒DNA区域之间插入编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA区域而得的转移载体，与编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA区域融合的N末端侧和/或C末端侧的病毒DNA区域的多核苷酸序列相对于天然来源的同一病毒DNA区域的多核苷酸序列，以同源性降低的方式改变该多核苷酸序列而得的转移载体，和/或以构成病毒粒子构成蛋白质的氨基酸的一部分缺失的方式改变多核苷酸序列而得的转移载体。就上述融合基因向转移载体的导入而言，可以预先形成本发明的融合基因的多核苷酸序列，将此纳入载体，也可首先将任一方的基因的多核苷酸序列纳入载体，接着，将其它基因的多核苷酸序列纳入载体而在载体内形成融合基因。本发明的转移载体是上述融合基因连结在单独的杆状病毒的启动子的下游而形成的，或者连结在一方为脊椎动物启动子特别是哺乳动物启动子而另一方为杆状病毒的启动子的连结起来的双重启动子的下游而形成的。分别使用已经具有本发明转移载体的构成的一部分即脊椎动物启动子特别是哺 乳动物启动子、杆状病毒启动子等的启动子区域与编码病毒粒子构成蛋白质的多核苷酸序列的市售表达载体，用限制性内切酶任意切除，纳入其它启动子等，在该载体的克隆区域，插入编码所需免疫原性外源蛋白质的基因与上述本发明的改变的编码病毒粒子构成蛋白质的基因(对于天然来源的编码病毒粒子构成蛋白质的基因，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列而得的多核苷酸，或者编码构成病毒粒子构成蛋白质的氨基酸的一部分缺失的该蛋白质的部分多肽的多核苷酸(包含以该部分多肽的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列而得的多核苷酸))融合而得的融合基因的多核苷酸序列，或者将编码所需免疫原性外源蛋白质的基因与已经纳入质粒中的本发明的改变的编码病毒粒子构成蛋白质的基因进行连结即可。在此，编码上述具有免疫原性的抗原蛋白质的多肽的多核苷酸序列未限定其全长序列，只要由多核苷酸序列所编码的氨基酸序列的蛋白质具有抗原性，也可以为编码部分氨基酸序列或者反复的部分氨基酸序列的多核苷酸序列、或者编码蛋白质的部分氨基酸序列彼此融合的部分氨基酸序列的多核苷酸序列。上述中编码免疫原性外源蛋白质的基因(包含以构成该免疫原性外源蛋白质的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列的多核苷酸)与改变的编码病毒粒子构成蛋白质的基因的连结可在改变的编码病毒粒子构成蛋白质的基因的N末端侧插入编码免疫原性外源蛋白质的基因等，插入必需的构成要素。此外，可使用具有已经满足如下质粒载体的一部分构成的市售的质粒进行制造，该质粒载体具有在本发明的昆虫细胞与脊椎动物细胞、特别是哺乳动物细胞两者的细胞中可将编码所需免疫原性外源蛋白质的基因表达作为抗原蛋白质的结构。此外，可插入用于在脊椎动物细胞内利用酶使融合蛋白质开裂的肽的氨基酸序列。此外，本发明的转移载体可在启动子区域的上游配置用于使脊椎动物、特别是哺乳动物细胞中的转录活性上升的增强子。此外，在融合表达的基因的下游，例如具有在脊椎动物细胞中有效的兔P球蛋白终止子之类的脊椎动物终止子区域以使得转录结束。若举出本发明的转移载体的一个具体例，则为形成如下结构的转移载体，即作为脊椎动物启动子特别是哺乳动物启动子的CAG启动子与作为杆状病毒启动子的多角体(Polh)启动子被连结，在其下游，作为融合基因，插入有流感病毒抗原基因或热带热疟疾抗原基因(该多核苷酸序列可为以构成天然来源的免疫原性外源蛋白质的氨基酸不改变的方式进行改变的多核苷酸序列)与以构成gp64的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列的gp64基因、或者编码构成gp64的氨基酸的一部分缺失的gp64的部分多肽的基因(包含以构成gp64的部分多肽的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列的基因)。作为示例，可举出 pCAP-HAl/Vietnam/51、pCAP-HAl/Vietnam/10U pCAP-HAl/Vietnam/154、pCAP-HAl/Vietnam/201、pCAP-HAl/Vietnam/272、pCAP-HAl/Vietnam/467, pCAP-HAI/Anhui、pCAP-HAl/Anhui/272、pCAP-HAl/Anhui/467、pCAP-HAl/Vietnam/OG、pCAP-CO/fulI/OG, pCAP-C0/76/0G、pCAP_C0/205/0G、及 pCAP-C0/76/467 等，对于其中特别优选的转移载体，示出其构成碱基序列(表I)。表 I
威基序列/ (尺寸bp)
转移载体0.0.瓦原性外~ 病毒粒子 __源性蛋白质__构成蛋白质
pCAP-HAl/Vietnani/272—~ GPM (1-20) HA/Vet (17-346)GP84 (272-512)
60bp990bp723bp
_序列编号53 序列编号54_序列编号59___
pCAP-HAl/Vietnam/467GP64(l-20)HA/Vet (17-346)GP64 (467-512)
60bp990bp138bp
_序列编号53_序列编号54序列编号60_
pCAP-HAl/Vietnam/OG GP64 (1-20)^ HA/Vet (17-346) ~~"GP64 (21-512)
60bp990bp1476bp
_序列编号53 序列编号54_序列编号61_
pCAP-CO/full/OGGP64(l-20)PfCSP (1-397)GP64 (21-512)
6ObP1191 bp1476bp
序列编号53 序列编号55序列编号61
「 n pCAP-CO/76/OGGP64(l-20)PfCSP (76-373)GP64 (21-512)
LQ131」60bp894bp1476bp
_序列编号53 序列编号56_序列编号61 一
—PCAP-C0/205/0GGP64 (1-20} PfCSP {205-373}GP64 (21-512)
60bp507bp1476bp
_序列编号53 序列编号57_序列编号61_
pCAP-CO/76/467石洲4 (卜20) PfCSP (76-373)' GP64 ￠467-512)
60bp894bp138tp
__序列编号53 序列编号56 _序列编号60_
pCAP-HAl/Aflhui/272 "GP64 (1-20) HA/Aish ￠17-345)GP64 (272-512)
60bp987bp723bp
__序列编号53 序列编号58_序列编号59_
pCAP-HAl/Anhui/467 "GP64 (1-20)HA/Anh (17-345)GP64 (467-512)
60bp987bp138bp
_序列编号53 序列编号58_序列编号60
pCAP-IIAl/Anhui/OGGP64 (1-20)HA/Anh (17-345)GP64 (21-512)~
BObp 987bp 1476bp_ 丨序列编号53丨序列编号58_I序列编号61这样，可制造本发明的转移载体，若示出其顺序的一例，则可举出进行下述(a) (C)和/或(d广Ce)的工序。(a)对于编码病毒粒子构成蛋白质的基因，与天然来源的多核苷酸序列相比，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式进行多核苷酸序列的改变，得到包含编码病毒粒子构成蛋白质的基因的多核苷酸的核酸序列信息的工序；(b)基于上述工序(a)中得到的核酸序列信息而合成多核苷酸的工序；(c)将编码免疫原性外源蛋白质的基因的多核苷酸连结或插入至上述工序(b)中合成的多核苷酸的工序；(d)合成对构成病毒粒子构成蛋白质的氨基酸的一部分缺失而形成的该蛋白质的部分多肽进行编码的多核苷酸，或合成以该部分多肽的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列而得的多核苷酸的工序；(e)将编码免疫原性外源蛋白质的基因的多核苷酸连结或插入至上述工序(d)中合成的多核苷酸的工序。本发明的重组杆状病毒可通过将上述转移载体与杆状病毒DNA共转染至宿主细胞而得到。杆状病毒是在对昆虫引起感染的昆虫病原病毒中拥有环状双链DNA作为基因的DNA病毒中的一类(杆状病毒科)。其中，被称作核多角体病病毒(Nucleopolyhedrovirus:NPV)的一类病毒在感染后期在感染细胞的核内形成被称作多角体的封入体。即使插入欲表达的外源性基因来代替多角体基因，病毒也没有问题地感染，增 殖，大量产生所需免疫原性外源性基因产物，因此近年来应用于所需蛋白质的制造。作为该杆状病毒，可例示出苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornica multiple nucleopolyhedrovirus ;AcNPV)、以及家香核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus ;BmNPV)、黄杉毒蛾核型多角体病病毒(Orgyiapseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus ;0pNPV)、舞毒蛾核型多角体病病毒(Lymantria disper multiple nucleopolyhedrovirus ;LdNPV)。在本发明中使用的杆状病毒DNA只要是发生与本发明的转移载体的同源重组的杆状病毒DNA即可。在此，作为杆状病毒DNA，可以是野生型、变异型、或者重组杆状病毒DNA中的任意种类。杆状病毒DNA可使用市售品，例如，可使用从AcNPV中除去多角体蛋白基因的BacVector-1000DNA> BacVector-2000DNA (Novagen 公司制)等。为了引起同源重组，转移载体与杆状病毒DNA的重量比可例如以I: f 10:1左右进行混合。作为转移载体向宿主细胞的导入法及利用其的转化法，未特别限定，可采用通常成为该领域中公知的惯用技术的各种方法，例如可按照通常的基因重组技术(例如，Science,224,1431 (1984) ；Biochem. Biophys. Res. Comm. ,130, 692 (1985) ；Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 80, 5990 (1983))进行制备。转移载体的表达方法可参考大野等的“蛋白实验操作规程I功能分析编，细胞工程学另册，实验操作规程系列，1997年，秀润社”来制造。此外，昆虫细胞的操作方法、基因重组、共转染的常规方法可使用与公知的昆虫细胞的重组病毒制作法同样的方法(松浦善治，蛋白核酸酶，37，211-222(1992)，松浦善治，细胞，33(2)30-34 (2001))。应予说明，共转染可使用市售的载体转染试剂盒(BacVector TransfectionKits ；Novagen公司制),按照该载体转染试剂盒所附的操作说明书进行实施。更具体而言，通过将按照上述制造的转移载体与用于进行同源重组的杆状病毒DNA在以来自Spodoptera frugiperda的Sf9细胞、Sf 21细胞、来自粉纹夜蛾(Trichoplusiani)的Tn5细胞(High Five细胞Invitrogen公司制)等的昆虫细胞为宿主细胞的细胞中共转染而进行。
利用共转染工序同时导入到昆虫细胞后，培养后，从上述培养上清制作病毒的菌斑，使之悬浮于培养液中，进行涡旋，使病毒从琼脂中溶出，离心分离，得到包含重组病毒的溶液。例如，可按照上述重组杆状病毒的制造方法，使用pCAP-HAl/Vietnam、pCAP-HAl/Vietnam/51 > pCAP-HAl/Vietnam/101、pCAP-HAl/Vietnam/154、pCAP-HAl/Vietnam/201 >pCAP-HAl/Vietnam/272、pCAP-HAl/Vietnam/467, pCAP-HAl/Anhui、pCAP-HAl/Anhui/272、pCAP-HAl/Anhui/467、pCAP-HAl/Vietnam/OG、pCAP-CO/ful 1/0G、pCAP-CO/76/OG、PCAP-C0/205/0G、及pCAP-CO/76/467的转移载体与杆状病毒DNA在Sf9昆虫细胞中进行共转染，得到 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/51、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/10 I、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/154、AcNPV-CAP-HAI/Vietnam/20 I、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/272、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/467、AcNPV-CAP-HAl/Anhui、AcNPV-CAP-HAl/Anhui/272、AcNPV-CAP-HAl/Anhui/467、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/OG、AcNPV-CAP-CO/full/OG、AcNPV-CAP-CO/76/OG、AcNPV-CAP-⑶/205/0G、及AcNPV-CAP-C0/76/467的重组杆状病毒。
作为其它重组杆状病毒的制作方法，还可使用如下方法在纳入全部杆状病毒基因组的噬菌体(Bacmid)中，利用转座子，在大肠菌体内高效率地插入外源性基因的方法。利用该方法，可仅通过从菌体中提取具有病毒基因的Bacmid并转染至昆虫细胞中，就可容易地制造并回收重组杆状病毒。这样，制得的转移载体与杆状病毒DNA —起被转染至Sf9细胞等昆虫细胞中，可得到重组杆状病毒。所得重组杆状病毒可用公知的病毒精制法进行精制。例如，对Sf9细胞等昆虫细胞(I X IO7个/IOcm皿)，接种0. 5^1. Oml的由上述重组杆状病毒的制造方法得到的Stock病毒(通常1\107_8 血/1111)，感染数天(4天)后，回收培养上清，然后离心分离(25000印111，60分钟，4°C的条件)，将所得病毒颗粒混悬于PBS等缓冲液中。对所得混悬液施加10飞0%的蔗糖密度梯度离心分离，作为病毒带进行回收。将回收物进一步混悬于PBS中后，接着进行离心分离，将所得精制重组体病毒颗粒在PBS等的缓冲液中于4°C进行保存。应予说明，上述得到的精制重组杆状病毒的感染性可使用Sf9细胞等昆虫细胞，利用菌斑分析进行测定(Fields VIROLOGY 4th Edition，p29_32，2001)。所得重组杆状病毒可按照常规方法进行培养，利用该培养，免疫原性外源蛋白质与病毒粒子构成蛋白质融合的融合物(表达物)在昆虫细胞的细胞内、细胞外或者细胞膜上进行表达、生产(蓄积、分泌)。作为用于培养的培养基，可根据采用的宿主细胞而适宜地选择利用惯用的各种培养基，培养也可在适于宿主细胞生长的条件下实施。以下，为了更详细地说明本发明，举出实施例。这些实施例仅为例示，并非限定本发明。实施例实施例I:转移载体质粒及其制造法(I)转移载体质粒pBACsurf_HAl/PR8的制作(1.1)质粒 pBACsurf-Hsp65 的构建
以结核菌H37Rv的基因组DNA为模板，使用引物phsp65_Fl (5，-AATAATAGATCTAATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGA-3’(序列号 I) ；BgIII 位点用下划线表示)与 phsp65_Rl(5 ’ -AATCCAATGCGGCCGCGGGAATTCGATTCCTGCAGGTCAGAAATCCATGCCACCCATGTCGCC-3 ’(序列号2) ；NotI用下划线表示)，进行PCR。精制PCR产物后，用限制性内切酶BgIII与NotI切断，插入到用限制性内切酶BamHI 与 NotI 切断的 pcDNA3. I ( + ) (Invitrogen 公司)中，构建质粒 pcDNA_Ighsp65。以pcDNA-Ighsp65 为模板，使用引物 phsp65_F2(5’ -CACCCCTGCAGG[ACTACA AGGACGACGATGACA AG]GAATTCATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGAGGCC-3’(序列号3) ；Sse8387I, EcoRI位点用下划线表示，FLAG序列用[]表示)与 phsp65_R2(5，-CCCGGGCGAAATCCATGCCACCCATGTCGCCGCCACC-3，(序列号 4);XmaI 位点用下划线表示)，进行PCR，将所得Hsp65基因DNA片段在pENTR/D-T0P0( Invitrogen公司)中进行克隆后，用限制性内切酶Sse8387I与XmaI切断，插入到用限制性内切酶PstI与XmaI切断的 pBACsurf-CSP (Yoshida et al. Virology 316 ; 161-70, 2003),构建质粒 pBACsurf_Hsp65。(I. 2)质粒 pBACsurf_HAl/PR8 的构建从流感病毒PR8/34株感染的MDCK细胞上清中，使用QIAamp MiniElute VirusSpin Kit(QIAGEN公司)，提取 RNA，使用弓丨物HA-f (5’ -CCTGCAGGTATGAAGGCAAACCTACTGGTC-3，(序列号5);SbfI位点用下划线表示)与HA-r (5，-GCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3，(序列号6) ；SbfI位点用下划线表示)，进行RT-PCR，将流感病毒HA基因片段在pCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen公司)中进行克隆。将所得质粒命名为pCR-Blunt-HA。以pCR-Blunt-HA 为模板，使用弓丨物 pHA-Fl (5’ -CACCGAATTCGACACAATATGTATAGGCTACCATGCG-3’(序列号 7);EcoRI 位点用下划线表示)与 pHA-Rl (5，-CCCGGGCACCTCTGGATTGGATGGACGGAATG-3’(序列号8) ；XmaI位点用下划线表示)，进行PCR，将所得H1N1/HA1基因DNA片段用限制性内切酶EcoRI与XmaI切断，插入到用限制性内切酶EcoRI与XmaI处理的pBACsurf-Hsp65 中，构建质粒 pBACsurf_HAl/PR8。(2)转移载体质粒PCAP-HA1/PR8的制作以 pBACsurf-HAl/PR8 为模板，使用 Polh-f Rsr 11 (5 ’ -GGGCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCG-3’(序列号 9);RsrII 位点用下划线表示)与 GP64_r DraIII (5，-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3 (序列号 10);DraIII 位点用下划线表示)，进行 PCR。将所得DNA片段用限制性内切酶RsrII与DraIII进行处理，插入到用限制性内切酶RsrII与DraIII切断pTriEx-1. I (Novagen公司)而得的载体中，构建质粒pCAP_HAl/PR8。(3)转移载体质粒 pCAP-HAl/Vietnam、pCAP-HAl/Vietnam/51、pCAP-HAl/Vietnam/101、pCAP-HAl/Vietnam/154、pCAP-HAl/Vietnam/201、pCAP-HAl/Vietnam/272、pCAP-HAl/Vietnam/467 的构建从流感病毒H5N1/Vietnam的血凝素的HAl区域的氨基酸序列制作人工合成基因序列(序列号11)。以该人工序列为模板，使用VN-Fl (5，-CAGTCTGCAGGACCAGATCTGTATC-3，(序列号 12);PstI 位点用下划线表示)与 VN-R4 (5，-CAGTCCCGGGCTCTCTTCTTCCTGC-3，(序列号13) ;XmaI位点用下划线表示),进行PCR,用限制性内切酶PstI与Xmal切断,插入至用限制性内切酶PstI与Xmal处理的pCAP-HAl/PR8中。将构建的质粒命名为pCAP-HAl/Vietnam。进而，以pCAP-HAl/PR8 为模板，使用 gp64 (51) -f (5，-GACTCCCCGGGTGGAAATCACCATCGTGGAGACG-3’(序列号14);Xmal位点用下划线部分表示)、或者gp64 (101)-f (5’_GACTCCCCGGGATTTGCTTATGTGGAGCATCAGG-3J (序列号 15);Xmal 位点用下划线部分表示)、或者gp64 (154) -f (5，-GACTCCCCGGGCGCACCACACGTGCAACAAATCG-3，(序列号 16) ；Xmal 位点用下划线部分表示)、或者 gp64 (201) -f (5，-GACTCCCCGGGACACTGTGCTTCATCGAGACGGC-3’(序列号17);Xmal位点用下划线部分表示)、或者gp64 (272)-f (5，-GACTCCCCGGGTCGAGCACCGAGTCAAGAAG-3’(序列号 18);Xmal 位点用下划线表示)、或者 gp64 (467)-f (5’_GACTC￡CCGGGACATCACTTCCATGGCTGAA-3，(序列号 19);Xmal 位点用下划线表示)与 GP64_r DraIII(5，-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3^ (序列号 20) ；Dralll 位点用下划线表示)，进行PCR，将所得的各个DNA片段用限制性内切酶Xmal与DraIII切断，插入到用限制性内切酶XmaI与DraIII处理的pCAP-HAl/Vietnam中。将构建的质粒命名为pCAP-HAl/Vietnam/51 > pCAP-HAl/Vietnam/101、pCAP-HAl/Vietnam/154、pCAP-HAl/Vietnam/201、pCAP-HAl/Vietnam/272、pCAP-HAl/Vietnam/467。
应予说明，流感病毒A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)血凝素的氨基酸序列的GenBank 登录号为 AAW80717。(4)转移载体质粒 pCAP-HAl/Anhui、pCAP-HAl/Anhui/272、pCAP-HAl/Anhui/467的构建由流感病毒H5Nl/Anhui/l/05的血凝素的HAl区域的氨基酸序列制作人工合成基因序列(序列号21)。以该人工序列为模板，使用AH-FlC5，-CAGTCTGCAGGACCAGATTTGCATC-3，(序列号 22);PstI 位点用下划线表示)与 AH-R4 (5，-CAGTCCCGGGCTCTCTTGCGCCTGC-3，(序列号23) ；XmaI位点用下划线表示)，进行PCR，将所得DNA片段分别用限制性内切酶PstI与Xmal切断，插入到用限制性内切酶PstI与Xmal处理的pCAP-HAl/Vietnam，pCAP-HAl/Vietnam/272, pCAP-HAl/Vietnam/467 中。将构建的质粒命名为 pCAP-HAl/Anhui、pCAP-HAI/Anhui/272、pCAP-HAI/Anhui/467。应予说明，流感病毒A/H5N1/Anhui的血凝素的氨基酸序列的GenBank登录号为ABD28180。(5)所需基因未与gp64基因融合的转移载体质粒的构建pCAP-bGal 的构建对pCMV-SPORT-P Gal (Invitrogen 公司制)模板，使用上游引物 bGal-F PstIF189-105 (ACTGCTGCAGATGTCGTTTACTTTGACCAACAAG)(序列号 24)、下游引物 bGal_Rev(Dra3) (ACTGCACTTAGTGTTTTTGACACCAGACCAACTGG)(序列号 25)，进行 PCR，将所得 DNA 片段在pCAP-HA I/Anhui的PstI、DraIII位点进行克隆。将构建的质粒命名为pCAP-bGal。pCAP-Rluc 的构建以pRL-SV40 (Promega 公司制)为模板，使用上游引物 Rluc FPstI F189-134 (ACTGCTGCAGATGACTTCGAAAGTTTATGATCC)(序列号 26)、下游引物 Rluc R DraIII F189-134CACTGCACTTAGTGTTAITGTTCAITITTGAGAACT)(序列号 27)，进行 PCR，将所得 DNA 片段在 pCAP-HAl/Anhui的PstI、DraIII位点进行克隆。将构建的质粒命名为pCAP-Rluc。pCAP-Luc 的构建
以pLuc-MCS (stratagene 公司制)为模板，使用上游引物 Rluc FPstI F189-105(ACTGCTGCAGATGGGAGCTCGAATTCCAGCTTG)(序列号 28)、下游引物 Rluc-Rev2F189_127 (ACTGCACTTAGTGTTACAATTTGGACTTTCCGCCC)(序列号 29)，进行 PCR，将所得 DNA 片段在 pCAP-HAl/Anhui的PstI、DraIII位点进行克隆。将构建的质粒命名为pCAP-Luc。pCAP-AFP 的构建以pQBI25_fAl (MP Biomedicals 公司制)为模板，使用上游引物 AFP-F F189-77(ACGCCTGCAGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTCTTCA)(序列号 30)、下游引物 AFP_Rev2F189_127 (ACTGCACTTAGTGTCAATCGATGTTGTACAGTTCA)(序列号 31 )，进行 PCR，将所得 DNA 片段在 pCAP-HAl/Anhui的PstI、DraIII位点进行克隆。将构建的质粒命名为pCAP-AFP。pCAP-Neo 的构建 以pcDNA3.l( + )(Invitrogen公司制)为模板，使用上游引物Neo-F SbfI F189-105(ACTGCCTGCAGGTGATTGAACAAGATGGATTGCAC)(序列号 32)、下游引物 Neo-Rev2F189_127(ACTGCACTTAGTGTCAGAAGAACTC GTCAAGAAGG)(序列号 33)，进行 PCR，将所得 DNA 片段在pCAP-HAl/Anhui的PstI、DraIII位点进行克隆。将构建的质粒命名为pCAP-Neo。(6)转移载体质粒 pCAP-HAl/Vietnam/OG 的制作(6. I)转移载体质粒pCAP-OG的制作将用限制性内切酶SpeI与DraIII切断pCAP-HAl/Vietnam，导入同样用限制性内切酶SpeI与DraIII切断的人工合成gp64基因序列(序列号34)而构建的质粒命名为pCAP-OG。(6. 2)转移载体质粒 pCAP-HAl/Vietnam/OG 的制作将用限制性内切酶PstI与XmaI切断pCAP-HAl/Vietnam而产生的包含HAl基因的片段插入到用限制性内切酶PstI与XmaI消化的pCAP-OG中，将构建的质粒命名为pCAP-HAl/Vietnam/OG。(7)转移载体质粒 pCAP-C0/full/0G、pCAP-C0/76/0G、pCAP_C0/205/0G、及pCAP-CO/76/467 的制作从Plasmodium falciparum 3D7株的CSP的氨基酸序列制作人工合成基因序列(序列号 35，;PfCSP (3D7)_opt)。以该人工序列为模板，使用 PfCSP_opt_f (5 -GACTCTGCA￡ATGATGCGAAAATTGGCCATACTG-3’，PstI 位点用下划线部分表示，序列号 36)与 PfCSP_opt_r(397)(5’ -CGATCCCGGGCATTGAGGAACAGAAAGGAAAGAACCATG-3’，XmaI 位点用下划线部分表示，序列号 37)、PfCSP_opt-f (76) (5，-GACTCTGCAGGACGACGGAAATAATGAGGACAACG-3’，PstI 位点用下划线部分表示，序列号 38)与 PfCSP_opt-r (373) (5，-CGATCCCGGGCCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCMTATCATTAGC-3’，XmaI 位点用下划线部分表示，序列号 39)、及PfCSP_opt_f(205)(5’ -GACTCTGCAGAATGCAAACCCAAATGCCAATCCAAACGC-3’，PstI 位点用下划线部分表示，序列号 40)与 PfCSP_opt-r (373) (5，-CGATCCCGGGCCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC-3’，XmaI位点用下划线部分表示，序列号39)，进行PCR，将所得DNA片段分别用PstI与 XmaI 切断，插入到用 PstI 与 XmaI 处理的 pCAP-HAl/Anhui 或者 pCAP-HAl/Anhui/467 中。将构建的质粒命名为 pCAP-C0/full、pCAP-CO/76、pCAP-CO/76/467、pCAP-C0/205。应予说明，Plasmodium falciparum 3D7株的CSP的氨基酸序列的GenBank登录号为 NC 000521。
实施例2本发明重组杆状病毒及其制造法重组杆状病毒如下制作使用重组杆状病毒制作试剂盒(BacVector-2000Transfection Kit, Novagen公司)，将在上述实施例I中构建的转移载体pBACsurf-HAl/PR8、pCAP_HAl/PR8、pCAP-HAl/Vietnam、pCAP-HAl/Vietnam/51、pCAP-HAl/Vietnam/ΙΟ 、pCAP-HAl/Vietnam/154、pCAP-HAl/Vietnam/201、pCAP-HAl/Vietnam/272、pCAP-HAl/Vietnam/467、pCAP-HAl/Anhui、pCAP-HAl/Anhui/272、pCAP-HAl/Anhui/467、pCAP-HAl/Vietnam/OG、pCAP-bGal、pCAP-Rluc、pCAP-Luc、pCAP-AFP、及pCAP-Neo中的各个转移载体与BacVector-2000DNA在Sf9细胞中进行共转染(co-transfection)。将制得的重组杆状病毒分别命名为AcNPV-Pol-HAl/PR8、AcNPV-CAP_HAl/PR8、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/51、AcNPV-CAP-HAI/Vietnam/10UAcNPV-CAP-HAl/Vietnam/154、AcNP V_CAP-HA1/Vietnam/201、AcNP V-CAP-HAl/Vietnam/272、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/467、AcNPV-CAP-HAl/Anhui、AcNPV-CAP-HA I/ Anhui/272、AcNPV-CAP-HA I/Anhui/46 7、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/OG、AcNPV-CAP-bGal、AcNPV-CAP-Rluc、AcNPV-CAP-Luc、AcNPV-CAP-AFP、及 AcNPV-CAP-Neo。对于制得的重组杆状病毒，以在每150mm细胞培养用板(SUMIL0N:秋田SumitomoBakelite公司制)中成为2X107个细胞的方式培养Sf9细胞，使各个上述重组杆状病毒以感染重复度约O. I进行感染。5天后，将培养液在10000 X g、4° C进行25分钟离心，回收，进而用Beckman超离心机(SW28Swing Rotor)在25000rpm、4° C进行90分钟离心，从而得到病毒粒子。实施例3重组杆状病毒的继代培养将在上述实施例2中得到的各重组杆状病毒与实施例2同样地用BacVector-2000试剂盒(Novagen公司制)，进行转染，培养5天后，回收上清，进行2次菌斑纯化。使第2次的分离菌斑对播种在48孔板上的Sf9细胞进行感染，培养5天后，回收上清。使该上清在25cm2烧瓶中以感染重复度约0. I进行感染，培养7天后回收上清(以此为P2stock病毒)。使P2stock病毒进一步以感染重复度约0. I对Sf9细胞进行感染，以培养7天的培养上清为P3Stock病毒。应予说明，在转染与48孔感染时，使用BacVectorInsect Cell Medium (Novagen公司制)的培养基，在菌斑纯化中使用I. 3XSf900II 培养基(Invitrogen 公司制)，在 25cm2 烧瓶时，使用 TNM-FHInsect cellmedium (Becton, Dickinson and Company 公司制)。实施例4从重组杆状病毒中的病毒基因组DNA的回收，及病毒DNA的PCR分析在病毒溶液50 μ I 中加入 DNA 提取缓冲液(50mM Tris-HCl (pH8. 0),20mM EDTA,0. IM NaCl，1%SDS>400 μ I与蛋白酶K (20mg/ml)8 μ 1，于50°C进行3小时温育。将溶液冷却至室温后，进行458 μ I的苯酚 氯仿(TE饱和苯酚氯仿=1:1，和光纯药公司制)处理，从所得上清中利用乙醇沉淀而回收病毒基因组DNA。(I)病毒DNA的PCR分析以从病毒回收的病毒基因组DNAlng为模板,进行PCR。PCR反应循环将94°C反应2分钟、98°C 10秒、60°C 30秒、及68°C 5分钟进行30个循环后，返回至4°C。然后，从PCR反应液中将10 μ I装载至琼脂糖凝胶中，进行电泳，利用溴化乙锭染色将DNA进行染色。在PCR反应中使用的引物的各组合如下所示，为上游引物 Pol h-F (5，-CCATCTCGCAAATAAATAAGTA-3’(序列号 41))及下游引物 Pol A-f (5，-AGAAGTCAGATGCTCAAG-3’(序列号 42))、上游引物 CAG-F-FseI (5，-CTAGTTATTAATAGTAAT-3’(序列号 43))及下游引物 GP64-R2 (5，-CATCGCCACGATTTGTTGCAC-3’(序列号 44))、上游引物 Polh-F (5，-CCATCTCGCAAATAAATAAGTA-3’(序列号 41)及下游引物 GP64-R2(5，-CATCGCCACGATTTGTTGCAC-3’(序列号 44))。对于PCR产物从琼脂糖凝胶中的提取，将用溴化乙锭染色的凝胶照射UV，切出所映出的目标DNA带,使用QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen公司制),从凝胶中提取DNA。此外，对于PCR产物的DNA的序列确定，从凝胶中提取用PCR扩增的目的DNA，将提取物直接用作序列分析的模板，或者使用Zero Blunt T0T0PCR克隆试剂盒(Invitrogen 公司制)进行一次克隆，用作序列分析的模板。在模板中，使用5-300ng的DNA,用BigDyeTerminator v3. I (BigDye Terminator v3. I ；Applied Biosystems 公司制)，进行循环反应。在引物中，使用 Pol h-F (5，-CCATCTCGCAAATAAATAAGTA-3’(序列号 41))，Pol A-f(5，-AGAAGTCAGATGCTCAAG-3’(序列号 42))。测序仪使用Applied Biosystems 3130x1 Genetic Analyzer (AppliedBiosystems 3130x1 Genetic Analyzer ；Applied Biosystems 公司制X接着,在后述实施例的Southern blot分析中，为了检测经限制性内切酶处理的病毒DNA片段，准备HA1/VN探针(可检测抗原基因HAl与gp64基因的融合基因)、gp64探针(可检测抗原基因HAl与gp64基因的融合基因、抗原基因从该融合基因脱落而成的基因(变异病毒DNA)及内源性的gp64基因)、及启动子探针(可检测抗原基因HAl与gp64基因的融合基因、及抗原基因从该融合基因脱落而成的基因。若为上述gp64探针，则无法与从天然来源的gp64基因的多核苷酸序列改变的多核苷酸的病毒DNAjf gp64基因的DNA序列缩短而成的病毒DNA进行结合，因此制作该探针)，利用PCR进行基因片段的扩增。应予说明，测定扩增的基因片段的浓度，针对IOml的杂交缓冲液，将50-100ng的基因片段用作各探针。(2)用于实施例5的探针的制作I为了得到HA1/VN探针的DNA片段，使用10 μ M的上游引物VN-F2(5，-GTGTCCAGCGCCTGCCCCTACCAGG-3’(序列号 45))及 10 μ M 的下游引物 VN-R3(5，-CCGTACTCCAGTTCTGACTTCATG-3’(序列号 46))、作为模板 DNA 的转移质粒pCAP-HAl/vietanam，进行PCR。为了制作gp64探针，使用10 μ M的上游引物GP64-271-F (5，-ACCGAGTCAAGAAGCGGCC-3’(序列号 47))及 ΙΟμΜ 的下游引物 pol A-f(5’-AGAAGTCAGATGCTCAAG-3，(序列号 42))、作为模板 DNA 的转移质粒 pCAP_HAl/PR8，进行PCR0利用这些PCR，得到用于制作探针的基因片段。各DNA片段的核酸序列如序列号50、51所示。使用这些基因片段，利用AlkPhos Direct Labelling and Detection SystemCGEHealthcare公司制)试剂盒制作探针。(3)用于实施例8的探针的制作II
HA1/VN探针、gp64探针使用与上述实施例5相同的探针。为了制作启动子探针，使用 ΙΟμΜ 的上游引物 CAP-PromF F213-22 (5 ’ -GCCTCTGCTAACCATGTTCATGC-3 ’(序列号48))及 ΙΟμΜ 的下游引物 CAP-PromRF213-22 (5 ’-CTTGCTTGTGTGTTCCTTATTGAAGCC-3 ’(序列号49))、作为模板DNA的转移质粒pCAP-HAl/Vietnam，进行PCR。这样，得到所需HA1/VN探针的DNA片段、gp64探针的DNA片段、及用于制作启动子探针的基因片段。各DNA片段的核酸序列如序列号50、51及52所示。使用这些基因片段，利用AlkPhos Direct Labelling and Detection SystemCGEHEALTHCARE公司制)试剂盒，制作探针。如实施例3所示，继代培养重组病毒，通过Western印迹观察到利用PCR确认病毒DNA的产生量与所需抗原表达量减少。因此，为了研究该表达量降低的原因，用包含启动子序列与抗原序列的引物对(CAG-F-FseI x GP64-R2)，进行以从病毒制备的病毒基因组DNA为模板(5 μ I)的PCR。PCR 后，进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图I所示，与推定尺寸(上段)不同尺寸地呈现预想之外的带(下段)。从凝胶切出该预想之外的带，确认序列，结果确认了不包含抗原基因的启动子的序列与gp64基因的序列连结而成的序列。由此启示了在重组病毒中存在抗原基因脱落的变异病毒。作为阳性对照，使用质粒pCAP-HAl/PR8 (泳道1、2)。此外，即使将来自SF9细胞的基因组DNAlOOng用于模板，也不能得到这样的带(泳道8)，因此，考虑所得预想之外的带为来自重组杆状病毒的可能性。这也确认了成为医药的有效成分的重组病毒的纯度降低。应予说明，就琼脂糖凝胶电泳而言，在相对于模板量5 μ I为50 μ I的反应液中，将10 μ I装载于琼脂糖凝胶中。图I为在退火温度60°C进行PCR的结果。泳道I示出以5pg的质粒pCAP_HAl/PR8为模板进行PCR的结果，泳道2示出以O. 5pg的质粒pCAP_HAl/PR8为模板进行PCR的结果，泳道3示出以分子量标记(Ikb Plus DNA ladder (Invitrogen社))为模板进行PCR的结果，泳道4示出以从P2ST0CK病毒制备的病毒DNA为模板进行PCR的结果，泳道5 7分别示出以将用于泳道4的病毒进行I代继代后制备而成的病毒(P3Stock病毒)的DNA为模板进行PCR的结果。实施例5利用Southern Blot分析的变异病毒的确认将由在上述实施例3中经继代培养的重组杆状病毒AcNPV-CAP-HAl/Vietnam的P3Stock病毒进一步进行I代继代培养的病毒得到的病毒DNA0. 2 μ g用限制性内切酶SwaI(NEB公司制)及XbaI (NEB公司制)进行消化，使用全量进行琼脂糖凝胶电泳。将凝胶用O. 25M的HCl溶液、改性缓冲液(O. 5M NaOH, I. 5MNaCl)、中和缓冲液(IMTris-HCl (pH7. 5), I. 5M NaCl)进行处理,使用 Turbo blotter (Wattmann 公司制)，将 DNA转移至膜片，利用UV交联(1200X100uj/cm2)，使DNA固定在膜片中。接着，将膜片浸溃于杂交缓冲液中，进行预杂交(杂交缓冲液10ml/6X Ilcm膜片)(65。。，30 分钟)。应予说明，就杂交缓冲液而言，按照所附说明书使用在AlkPhos DirectLabelling and Detection System (GE HEALTHCARE)试剂盒中所附的杂交缓冲液。在上述杂交液中，加入在实施例4中制作的HA1/VN探针、及gp64探针，于65°C进行4小时以上的杂交。杂交后，清洗膜片，使用CDP-star检测试剂(GE HEALTHCARE公司制)，进行带的检测。在检测信号之后，进行重探测的操作，进而使用Ikb plus DNAladder探针(将Ikb plus DNA ladder (Invitrogen 公司制)20_100ng 用 AlkPhos Direct Labelling andDetection System (GE HEALTHCARE公司制)试剂盒进行标示而制得的探针)进行再次杂交，确认带的尺寸。其结果如图2 (A)及(B)所示。图2中，(A)示出使用HA1/VN探针的结果，(B)示出使用gp64探针的结果，泳道I示出 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam 的克隆 1，泳道 2 示出 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam 的另一克隆(克隆2),泳道3示出分子量标记(Ikb plus DNA ladder (Invitrogen公司制))，泳道4示出 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam 的克隆 1，泳道 5 示出 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam 的克隆 2，泳道6 不出分子量标记(lkb plus DNA ladder (Invitrogen 公司制))。
其结果是，如图2 (A)所示，HA基因被检出该尺寸，在图2 (B)中不仅检出HAl与gp64基因的融合基因的带与内源性gp64基因的带(均为正常病毒)，而且检出HAl基因缺损的gp64基因的带(变异病毒)。由此可知变异病毒存在于病毒溶液中。实施例6用于避免变异病毒产生的gp64基因修饰体的Southern分析由于可知上述变异病毒的存在，因此作为用于避免变异病毒产生的GP64修饰体，制作使用在实施例I中制作的转移载体(包含编码天然来源的GP64蛋白质的氨基酸的多核苷酸序列与以构成GP64蛋白质的氨基酸不改变的方式使多核苷酸序列的同源性降低至约77%的多核苷酸的质粒载体)制作的重组杆状病毒(AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/OG)。为了进一步详细分析，使用具有部分缩短GP64的一部分的序列的几个GP64修饰体，进行同样的PCR实验。S卩，将在上述实施例3中经继代培养的P3Stock病毒AcNPV-CAP-HAI/Vietnam/0G、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/51、AcNPV-CAP-HA I /V i e tnam/10 UAcNPV-CAP-HAl/Vietnam/154、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/20U AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/272、及AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/46 7按照实施例4而得到病毒DNA，使用各引物，进行病毒DNA的PCR分析。其结果如图3所示。图3中，泳道I示出分子量标记(lkb plus DNA ladder (Invitrogen公司制))，泳道 2 示出 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/OG 的病毒 DNA 的带，泳道 3 示出 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam的病毒DNA的带，泳道4示出AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/51的病毒DNA的带，泳道 5 示出 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/ΙΟ 的病毒 DNA 的带，泳道 6 示出 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/154的病毒DNA的带，泳道7示出AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/201的病毒DNA的带，泳道 8 示出 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/272 的病毒 DNA 的带，而且泳道 9 示出 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/467的病毒DNA的带。由图3可知，将AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/OG的gp64基因的多核苷酸序列与编码天然来源的GP64蛋白质的氨基酸的多核苷酸序列进行比较，就以构成GP64蛋白质的氨基酸不改变的方式使编码其的多核苷酸的序列同源性降低至约77%的修饰体与缩短以构成GP64蛋白质的氨基酸的一部分(分别缺失49%、87%氨基酸序列而成的)缺失的方式使多核苷酸序列改变的 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/272 及 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/46 7 的 gp64 基因的一部分的修饰体而言，几乎未确认变异病毒的检出，或者未确认检出。实施例7用于避免变异病毒产生的gp64基因修饰体构建物的Southern分析上述结果，为了避免或者抑制变异病毒的产生，将gp64基因的核苷酸与编码天然来源的GP64蛋白质的氨基酸的多核苷酸序列进行比较，构建以构成GP64蛋白质的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸的修饰体的转移载体，或构建以构成GP64蛋白质的氨基酸的一部分缺失的方式改变多核苷酸缩短gp64基因的一部分的修饰体的转移载体，从而可知可避免变异病毒的检出，或者几乎不能确认检出。因此，进一步对于将免疫抗原蛋白代替成其它流感抗原的情况，对于在构建缩短gp64基因的一部分的修饰体的转移载体的情况下的变异病毒产生,进行研究。S卩，将在上述实施例3中继代培养的P3Stock病毒AcNPV-CAP-HAI/Vietnam、AcNPV-CAP-HA I /V i e t nam/ 2 7 2, AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/467、AcNPV-CAP-HAl/Anhui、AcNPV-CAP-HAl/Anhui/272、及 AcNPV-CAP-HAl/Anhui/467 按照实施例 4 得到病毒 DNA，使用 各引物，进行病毒DNA的PCR分析。其结果如图4所示。图4中，泳道I不出分子量标记(lkb plus DNA ladder (Invitrogen公司制))，泳道 2 示出 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam 的病毒 DNA 的带，泳道 3 示出 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/272 的病毒 DNA 的带，泳道 4 示出 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/46 7 的病毒 DNA 的带，泳道 5 示出 AcNPV-CAP-HAl/Anhui 的病毒 DNA 的带，泳道 6 示出 AcNPV-CAP-HAl/Anhui/272的病毒DNA的带，泳道7示出AcNPV-CAP-HAl/Anhui/467的病毒DNA的带，而且泳道8示出过去检测变异病毒的AcNPV-CAP-HAl/Vietnam (阳性对照)的带，泳道扩13分别示出以使用在所需基因中未融合gp64基因的转移载体(pCAP-bGal，pCAP-Rluc、pCAP-Luc、pCAP-AFP、pCAP-Neo)而制作的杆状病毒 AcNPV-CAP-bGal、AcNPV-CAP-R-Luc、AcNPV-CAP-Luc、AcNPV-CAP-AFP及AcNPV-CAP-Neo的基因组DNA为模板进行PCR时的DNA的带，而且泳道14 不出分子量标记(lkbplus DNA ladder (Invitrogen 公司制))。由图4可知，将GP64蛋白质的N末端侧的氨基酸序列长分别在基因水平上缩短至 51%、13% 而修饰的 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/272、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/467、AcNPV-CAP-HAl/Anhui/272、及 AcNPV-CAP-HA I/Anhui/46 7，与将 GP64 蛋白质的氨基酸序列长在基因水平上缩短前的构建物相比，来自变异病毒的带明显减少(泳道3、4、6、7 )。此外，在具有编码未融合gp64基因的外源性蛋白的基因的5个克隆(泳道扩13)中，未检出这样的变异病毒。进而，即使将免疫抗原蛋白替代成其它流感抗原时，也未确认变异病毒的检出。实施例8利用Southern Blot分析的重组病毒及变异病毒量的确认将从在上述实施例3中继代培养的P3Stock病毒进一步再I代继代培养而成的重组杆状病毒 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/272、AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/467、AcNPV-CAP-HA I/Vie tnam/OG、及野生型杆状病毒(AcNPV)中得到的病毒 DNA用限制性内切酶SwaI (NEB公司制)及XbaI (NEB公司制)进行消化，进行琼脂糖凝胶电泳。使2yg的病毒DNA用限制性内切酶SwaI (NEB公司制)及XbaI (NEB公司制)进行消化后，进行乙醇沉淀。将所得颗粒溶解在TE缓冲液中，用O. 8%琼脂糖凝胶进行分解。接着，将凝胶用O. 25M的HCl溶液、改性缓冲液(O. 5M NaOH, I. 5M NaCl)、中和缓冲液(1M Tris-HCl (pH7. 5), I. 5M NaCl)进行处理,使用 Turbo blotter (Whatman 公司制)，将凝胶中含有的DNA转移至膜片，利用UV交联(1200X100uj/cm2)，使DNA固定在膜片上。
接着，将膜片浸至杂交缓冲液中，于65°C进行30分钟预杂交(杂交缓冲液10ml/6Xllcm膜片)。应予说明，就杂交缓冲液而言，按照所附的说明书使用AlkPhosDirect Labelling and Detection System (GEHEALTHCARE 公司制)试剂盒所附的杂交缓冲液。在上述杂交液中，加入在实施例4中制作的启动子探针，于65°C进行4小时以上的杂父。杂交后，使用CDP-star检测试剂(GE HEALTHCARE公司制)，进行带的检测。在检测信号之后，进行重探测的操作，进而用lkb plus DNA ladder探针再次进行杂交，确认带的尺寸。其结果分别如图5及表2所示。图5中，泳道I示出对照的pCAP-HAl/Vietnam质粒的浓度IX IO8拷贝(O. 84ng)，泳道2示出对照的质粒的浓度3 X IO7拷贝(O. 252ng)，泳道3示出对照的质粒的浓度I X IO7 拷贝(O. 084ng),泳道4示出野生型杆状病毒的病毒DNA的带，泳道5示出AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/OG的病毒DNA的带，泳道6示出AcNPV-CAP-HA I/Vietnam的病毒DNA的带，泳道 7 示出 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/272 的病毒 DNA 的带，泳道 8 示出 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/467的病毒DNA的带。由图5可知，与编码天然来源的GP64蛋白质的氨基酸的多核苷酸序列进行比较，对于以构成GP64蛋白质的氨基酸不改变的方式改变编码GP64蛋白质的氨基酸的多核苷酸序列而成的本发明的重组杆状病毒(AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/OG)、相当缩短构成GP64蛋白质的氨基酸序列的N末端侧的一部分的修饰体(AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/467)，未检出变异病毒。然而，在 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam、AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/272 中检出来自变异病毒的带。因此，从正常病毒的带和变异病毒的带与质粒对照的浓度比，将变异病毒的出现量进行定量化。其结果如表2所示。表2
突变率
__W_ND No detection如表2所示可知，在未使gp64基因的多核苷酸序列的同源性降低的AcNPV-CAP-HAl/Vietnam中，约9%的病毒变异，在仅缩短GP64蛋白质的N末端侧的氨基酸序列的 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/272 中，0. 8% 的病毒发生变异。而且，在 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/OG、相当缩短GP64蛋白质的N末端侧的氨基酸序列的AcNPV-CAP-HA I/Vietnam/467中，变异病毒在检测限以下，因此为ND (No detection)。SP，可知，在 AcNPV-CAP-HAl/Vietnam/OG、AcNPV-CAP-HAI/Vietnam/467 中，变异病毒产生得到抑制，可高纯度维持以表达免疫抗原基因与gp64基因融合的融合物的重组杆状病毒为医药有效成分的医药物质。纯度降低的融合物的一方即免疫抗原的表达量降低涉及给予的抗原的致敏量的降低，作为结果，存在治疗效果不充分的问题，但是通过应用本发明的制造方法，可解决这些问题。实施例9使用杆状病毒感染Sf9细胞的Western印迹分析对于转移载体的启动子为单启动子与双重启动子时变异病毒产生量是否不同，进行比较试验。使用在实施例2中制作的具有单启动子的重组杆状病毒AcNPV-Pol-HAl/PR8与具有双重启动子的重组杆状病毒AcNPV-CAP-HA I/PR8，使菌斑产生，分别挑选8个菌斑，使其一部分对48孔板中散布的Sf9细胞进行感染，使之对在48孔板(Corning公司制)上培养的Sf9细胞进行感染。在感染5天后，回收上清，对在板上残留的Sf9细胞加入包含12的2X SDS 样品缓冲液(5mM Tris_HCl(pH7. 0),20% 甘油、4%SDS、0. 004%BPB(溴酚蓝)，10%2-巯基乙醇)，溶解细胞，移入微量离心管后，煮沸5分钟。对该溶液进行SDS-PAGE，将蛋白转移至Immubilon-P膜片(Millipore公司制)后，进行使用抗GP64抗体(eBioscience,稀释5000倍)与二次抗体Goat Anti-Mouse IgG (H+DHRP结合物(BI0RAD公司制，稀释5000倍)的Western印迹，检测GP64与抗原的融合蛋白和内源性的GP64蛋白。应予说明，就SDS-PAGE电泳缓冲液而言，使用25mM Tris、192mM甘氨酸、及1%SDS，在印迹缓冲液中，使用48mM Tris (pH9. 2)、39mM甘氨酸、O. 038%SDS、及20%甲醇，在检测试剂中，使用高灵敏度化学发光检测ECL plus (GE HEALTHCARE公司制)。Western分析的结果如图6所示。图6左图中，泳道1-8示出转移载体具有双重启动子的构建物的重组病毒AcNPV-CAP-HA I/PR8的克隆广8，泳道9_16示出转移载体具有作为单一启动子的多角体启动子的构建物的重组病毒AcNPV-Pol-HAl/PR8的克隆广8。此外，将使用上述由分离的克隆制备的病毒DNA的PCR分析的结果分别示于图6右上图及右下图。在图6右的上下图中，泳道17及27示出分子量标记,泳道18-24示出具有双重启动子的构建物的重组病毒AcNPV-CAP-HAl/PR8的克隆2 8 (克隆I在其它实验中使用，因此不包含在此)，泳道28-34示出转移载体具有单一启动子的多角体的构建物的重组病毒AcNPV-PoI-HAI/PR8的克隆2 8 (克隆I在其它实验中使用，因此不包含在此)，泳道25、35示出阳性对照，而且泳道26、36分别示出阴性对照。其结果，若比较AcNPV-CAP-HA I/PR8及AcNPV-Po I-HAI/PR8，则确认与启动子的种类无关地出现变异病毒。实施例10利用纳入人痕疾(Plasmodium falciparum)的CSP抗原的杆状病毒进行的改变gp64基因密码子的杆状病毒的性状分析将包含疟疾抗原的重组杆状病毒(将P3Stock病毒进一步继代培养的病毒)AcNPV-C0/full/0G、AcNPV-C0/76/0G、AcNPV_C0/205/0G、及 AcNPV-CO/76/467 进行精制，将用2 X SDS样品缓冲液改性的病毒供给到SDS-PAGE，转录至膜片后，进行使用了抗GP64抗体(e-Bioscience公司制，稀释5000倍)与二次抗体羊抗小鼠IgG (H+L)HRP结合物(Bio-rad公司制，稀释5000倍)的免疫染色，检测GP64蛋白与抗原的融合蛋白和内源性的GP64蛋白。此外，为了高灵敏度地检测GP64蛋白与抗原的融合蛋白，进行使用了抗CSP抗体MRA-183(MR4，稀释10000倍)与二次抗体二次抗体羊抗小鼠IgG (H+L) HRP结合物(Bio-rad公司制，稀释5000倍)的免疫染色，检测GP64蛋白与抗原的融合蛋白。
图7中，1-4示出使用抗GP64抗体的免疫染色的结果，5-8示出使用抗CSP抗体的免疫染色的结果，I、5 装载 AcNPV-CAP-CO/ful 1/0G，2、6 装载 AcNPV-CAP-CO/76/OG，3、7 装载AcNPV-CAP-C0/205/0G，4、8 装载 AcNPV-CAP-CO/76/467。这样与内源性 GP64 蛋白相对的量因抗原而有差别，但即使在取代gp64基因的密码子时，也可在全部的克隆中确认GP64蛋白与抗原的融合蛋白的表达。

为了确认在这些重组病毒中未出现变异病毒，从各个病毒中制备基因组DNA，使用Pol h-f引物和Pol A-f引物进行PCR。其结果如图8所示。泳道I使用lkb Plus DNAladder,泳道 2 使用 AcNPV-CAP-CO/full/OG，泳道 3 使用 AcNPV-CAP-CO/76/OG，泳道 4 使用AcNPV-CAP-C0/205/0G，泳道5使用AcNPV-CAP-CO/76/467，泳道6使用作为阴性对照的AcNPV-CAP-HA I /V i e tnam/OG,泳道 7 使用作为阳性对照的 AcNPV-CAP-HA I/Vietnam。其结果显示除了阳性对照以外，未检出变异病毒。
权利要求
1.一种转移载体的制造方法，其特征在于，是连结有融合基因的转移载体的制造方法，所述融合基因包含至少一种编码病毒粒子构成蛋白质的基因、和编码免疫原性外源蛋白质的基因，对于所述编码病毒粒子构成蛋白质的基因而言，与天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列相比，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列，和/或以构成该蛋白质的氨基酸的一部分缺失的方式改变多核苷酸序列。
2.一种转移载体的制造方法，其特征在于，是连结有融合基因的转移载体的制造方法，所述融合基因包含至少一种编码病毒粒子构成蛋白质的基因、和编码免疫原性外源蛋白质的基因，对于所述编码病毒粒子构成蛋白质的基因而言，与天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列相比，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列。
3.根据权利要求I所述的方法，其中，进行下述(a) (C)和/或(d) Ce): (a)对于编码病毒粒子构成蛋白质的基因而言，与天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列相比，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式进行多核苷酸序列的改变，得到包 含编码病毒粒子构成蛋白质的基因的多核苷酸的核酸序列信息的工序； (b)基于在所述工序(a)中得到的核酸序列信息，合成多核苷酸的工序； (C)将编码免疫原性外源蛋白质的基因的多核苷酸连结或者插入至所述工序(b)中合成的多核苷酸的工序； (d)合成对构成病毒粒子构成蛋白质的氨基酸的一部分缺失而形成的该蛋白质的部分多肽进行编码的多核苷酸，或合成以该部分多肽的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列而得的多核苷酸的工序； Ce)将编码免疫原性外源蛋白质的基因的多核苷酸连结或插入至所述工序(d)中合成的多核苷酸的工序。
4.根据权利要求I或2所述的方法，其中，融合基因是在其上游包含编码来自病毒粒子构成蛋白质的信号序列的多核苷酸的融合基因。
5.根据权利要求I或2所述的方法，其中，编码病毒粒子构成蛋白质的基因为杆状病毒gp64基因、水疱性口炎病毒糖蛋白基因、I型人免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人呼吸道合胞体病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素基因、B型流感病毒血凝素基因、单纯疱疹病毒糖蛋白基因或小鼠肝炎病毒S蛋白质基因中的任一种。
6.根据权利要求I或2所述的方法，其中，编码病毒粒子构成蛋白质的基因为杆状病毒gp64基因。
7.根据权利要求I或2所述的方法，其中，编码免疫原性外源蛋白质的基因是选自疟疾抗原、流感病毒抗原、结核菌抗原、SARS病毒抗原、西尼罗热病毒抗原、登革热病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原虫抗原、锥虫抗原、住白细胞虫抗原及癌抗原中的抗原的基因，或者是选自这些抗原基因组中的至少一种与细胞因子的融合抗原的基因。
8.根据权利要求I或2所述的方法，其中，转移载体是在将能在脊椎动物细胞中起作用的启动子与杆状病毒的启动子连结而得到的双重启动子的下游连结融合基因的转移载体。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述能在脊椎动物细胞中起作用的启动子是选自巨细胞病毒启动子、SV40启动子、逆转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克蛋白启动子、CAG启动子、延伸因子I a启动子、肌动蛋白启动子、泛素启动子、白蛋白启动子及MHC类启动子中的任一种，杆状病毒的启动子是选自多角体启动子、PlO启动子、IEl启动子、P35启动子、p39启动子及gp64启动子中的任一种。
10.一种转移载体的制造方法，其特征在于，是在包含至少一种编码病毒粒子构成蛋白质的基因的病毒DNA区域之间插入有编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA区域的转移载体的制造方法，将与编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA区域进行融合的N末端侧和/或C末端侧的病毒DNA区域的多核苷酸序列，以相对于天然来源的同一病毒DNA区域的多核苷酸序列同源性降低的方式进行改变，和/或以构成病毒粒子构成蛋白质的氨基酸的一部分缺失的方式改变该多核苷酸序列。
11.一种重组杆状病毒的制造方法，其特征在于，是使用了连结有融合基因的转移载体的重组杆状病毒的制造方法，所述融合基因包含至少一种编码病毒粒子构成蛋白质的基因、和编码免疫原性外源蛋白质的基因，将所述转移载体与杆状病毒DNA共转染至昆虫宿主细胞中， 所述转移载体如下形成对于所述编码病毒粒子构成蛋白质的基因而言，与天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列相比，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式改变其多核苷酸序列，和/或以构成该蛋白质的氨基酸序列的一部分缺失的方式改变其多核苷酸序列。
12.—种转移载体，其特征在于，是连结有融合基因的转移载体，所述融合基因包含至少一种编码病毒粒子构成蛋白质的基因、和编码免疫原性外源蛋白质的基因，对于所述编码病毒粒子构成蛋白质的基因而言，与天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列相比，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列，和/或以构成该蛋白质的氨基酸的一部分缺失的方式改变多核苷酸序列。
13.一种转移载体，其特征在于，是连结有融合基因的转移载体，所述融合基因包含至少一种编码病毒粒子构成蛋白质的基因、和编码免疫原性外源蛋白质的基因，对于所述编码病毒粒子构成蛋白质的基因而言，与天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列相比，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列。
14.根据权利要求12所述的转移载体，是通过进行下述(a厂(C)和/或(d厂(e)而制得的， (a)对于编码病毒粒子构成蛋白质的基因而言，与天然来源的病毒粒子构成蛋白质的基因序列相比，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式进行多核苷酸序列的改变，得到包含编码病毒粒子构成蛋白质的基因的多核苷酸的核酸序列信息的工序； (b)基于在所述工序(a)中得到的核酸序列信息，合成多核苷酸的工序； (c)将编码免疫原性外源蛋白质的基因的多核苷酸连结或插入至所述工序(b)中合成的多核苷酸的工序； (d)合成对构成病毒粒子构成蛋白质的氨基酸的一部分缺失而形成的该蛋白质的部分多肽进行编码的多核苷酸，或合成以该部分多肽的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列而得的多核苷酸的工序； Ce)将编码免疫原性外源蛋白质的基因的多核苷酸连结或插入至所述工序(d)中合成的多核苷酸的工序。
15.根据权利要求12或13所述的转移载体，其中，融合基因是在其上游连结有编码来自病毒粒子构成蛋白质的信号序列的多核苷酸的融合基因。
16.根据权利要求12或13所述的转移载体，其中，编码病毒粒子构成蛋白质的基因为杆状病毒gp64基因、水疱性口炎病毒糖蛋白基因、I型人免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人呼吸道合胞体病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素基因、B型流感病毒血凝素基因、单纯疱疹病毒糖蛋白基因或小鼠肝炎病毒S蛋白质基因中的任一种。
17.根据权利要求12或13所述的转移载体，其中，编码病毒粒子构成蛋白质的基因为杆状病毒gp64基因。
18.根据权利要求12或13所述的转移载体，其中，编码免疫原性外源蛋白质的基因是选自疟疾抗原、流感病毒抗原、结核菌抗原、SARS病毒抗原、西尼罗热病毒抗原、登革热病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原虫抗原、锥虫抗原、住白细胞虫抗原及癌抗原中的抗原的基因，或者是选自这些抗原基因组中的至少一种与细胞因子的融合抗原的基因。
19.根据权利要求12或13所述的转移载体，是在将能在脊椎动物细胞中起作用的启动子与杆状病毒的启动子连结而得的双重启动子的下游连结融合基因的转移载体。
20.根据权利要求19所述的转移载体，其中，所述能在脊椎动物细胞中起作用的启动子是选自巨细胞病毒启动子、SV40启动子、逆转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克蛋白启动子、CAG启动子、延伸因子I a启动子、肌动蛋白启动子、泛素启动子、白蛋白启动子及MHC类启动子中的任一种，杆状病毒的启动子是选自多角体启动子、P10启动子、IEl启动子、P35启动子、p39启动子及gp64启动子中的任一种。
21.一种转移载体，其特征在于，是在包含至少一种编码病毒粒子构成蛋白质的基因的病毒DNA区域之间插入有编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA区域的转移载体，将与编码免疫原性外源蛋白质的基因的DNA区域进行融合的N末端侧和/或C末端侧的病毒DNA区域的多核苷酸序列，以相对于天然来源的同一病毒DNA区域的多核苷酸序列同源性降低的方式进行改变，和/或以构成病毒粒子构成蛋白质的氨基酸的一部分缺失的方式改变该多核苷酸序列。
全文摘要
本发明提供高纯度地制造发挥所需免疫抗原性且可用作疫苗等医药品的重组杆状病毒的方法、以及用于制造该重组杆状病毒的转移载体及其制造方法。一种转移载体的制造方法，其特征在于，是连结有包含至少一种编码病毒粒子构成蛋白质的基因与编码免疫原性外源蛋白质的基因的融合基因而成的转移载体的制造方法，对于所述编码病毒粒子构成蛋白质的基因，与来自于天然的病毒粒子构成蛋白质的基因序列相比，以构成该蛋白质的氨基酸不改变的方式改变多核苷酸序列，和/或以构成该蛋白质的氨基酸的一部分缺失的方式改变多核苷酸序列。
文档编号C12N15/117GK102822336SQ201180007698
公开日2012年12月12日 申请日期2011年2月10日 优先权日2010年2月12日
发明者川崎昌则, 稻垣胜也, 水腰真己 申请人:大塚制药株式会社