专利名称：无创产前诊断胎儿非整倍体性的方法和组合物的制作方法
无创产前诊断胎儿非整倍体性的方法和组合物
背景技术：
产前诊断目前一般使用传统细胞遗传学分析(例如核型)或者DNA分析(例如QF-PCR),其要求通过羊膜穿刺术,绒毛膜绒毛样检或者脊索穿刺(chordocentesis)获得胎儿遗传材料。尽管如此，这些是创伤性治疗程序，并且具有显著的胎儿死亡风险(绒毛膜绒毛样检和羊膜穿刺术为O. 5至1% ) (Hulten, Μ. A.等(2003)Reproduction 126 279-297)。有效产前诊断测试的必要性尤其重要，就唐氏综合症(也称为三染色体21综合症)来说，其是产生智力迟钝频率最高的形式(具有在世界范围所有出生婴儿中700分之一的发生率)。尽管如此，由于目前的产前测试的风险，产前诊断只提供给高风险的妊娠(所有妊娠中的6-8%)，其评价是根据母体血清筛选和胎儿和胎儿超声波检查方法。因此，迫切需要发展不会对胎儿造成危险的诊断方法，也通常被称为无创产前诊断。在怀孕期间的母体循环中发现了游离胎儿DNA (ffDNA) (Lo, Y. M.等(1997)Lancet^迎485-487)，其已经成为发展无创产前测试的重要替代途径。ffDNA已经被成功 用于确定胎儿性别和在母体血浆中的胎儿RhD状态(Lo，Y. Μ.等(1998) N. Engl. J. Med. 339 1734-1738 ；Bianchi,D. ff.等(2005)Obstet. Gynecol. 106 :841-844)。尽管如此，对存在于过量母体DNA中的限定量的ffDNA (3至6 % )进行直接分析，其对发展胎儿非整倍体性的无创性测试是巨大挑战。在所述领域的最新进展显示所述ffDNA的物理和分子特性可以用于将其从循环母体DNA中鉴别出来或者作为胎儿DNA富集的手段(Chan，K. C.等(2004)Clin. Chem. 50j88-92 ；Poon, L. L.等(2002) Clin. Chem.坚35-41)。例如，按大小进行分离的方法已经被用于血浆DNA，以富集胎儿DNA，因为胎儿DNA通常比循环中母体DNA的短(Chan，K. C.等(2004)，supra)。此外，根据母体血浆中ffDNA是来自胎盘起源的证据，母体周围(整体)血液和胎盘DNA之间的表观遗传差异已经被用于检测在来自胎儿的母体血浆中的低甲基化基因序歹Ij (maspin/SERPINB5) (Masuzaki，H.等(2004) J. Med. Genet. 41 :289-292 ；Fiori,E.等(2004) Hum. Reprod. 19 :723-724 ；Chim, S. S.等(2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA102 14753-14758)。后来，描述了少量的其它差异胎儿表观遗传分子标记，包括染色体3上的RASSF1A基因和染色体 21 上的标记(Chiu,R. W.等(2007) Am. T. Pathol. 170 :941-950 ；01d,R. W.等(2007) R印rod. Biomed. Online 15 :227-235 ；Chim, S. S.等(2008) Clin. Chem. M :500-511)。尽管这些研究已经证明在胎儿DNA(从绒毛膜绒毛样检获得的胎盘DNA)和母体外周血DNA之间的表观遗传差异，可以作为无创产前诊断潜在的胎儿分子标记，并且目前为止仅仅限定量的基因组区域已经被识别或检测出来。大量的研究集中于单基因启动子区域(Chim, S. S.等(2005) supra ；Chiu, R. W.等(2007, supra),然而其它的已经研究了在染色体 21 上的 CpG 岛(Old, R. W.等(2007) supra ；Chim, S. S.等(2008) supra)，尽管其仅仅覆盖一小部分的所述染色体(Fazzari, M. J.等(2004) Nat. Rev. Genet. 5 :446-455) 目前的方法发展了使用ffDNA进行无创产前诊断，常遭受大量的限制。被研究的一种方法涉及利用甲基化敏感限制酶来消除低甲基化母体DNA从而允许ffDNA的直接聚合酶链反应(PCR)分析(Old，R.W.等(2007)，supra)。尽管如此，差异甲基化DNA的必要区域(含有甲基化敏感限制酶识别的限制性微点)限制了适合测试的区域的数量。被研究的另一种方法涉及利用亚硫酸氢钠转换以允许区别在母体和胎儿DNA之间的差异甲基化。在这种方法中，亚硫酸氢钠转换之后进行甲基化特异性PCR或者甲基化敏感单核苷酸引物延伸和 / 或亚硫酸氢钠测序(Chim, S. S.等(2005) supra ；Chiu, R. W.等(2007) supra ；Chim,
S.S.等(2008)SUpra)。这种方法，尽管有两个主要问题。首先，亚硫酸氢盐转换之后的甲基化状态的精确分析取决于非甲基化胞嘧啶到脲嘧啶的完全转换(这个条件很少能达到)。其次，在从亚硫酸氢盐处理后获得的DNA的降解(描述参见于Grunau，C.等(2001)Nucl.Acids Res. 29 E65-5)变得复杂，甚至进一步的极低量的胎儿DNA的测试和定量。另一种最近的方法已经直接测序细胞游离DNA(cell-free DNA)(来自于怀孕妇女的血衆中)，使用高通量鸟枪测序技术(Fan, H. C.等(2008) Proc. Natl. Acas. Sci. USA105 16266-71 ；Chiu, R. W.等(2008) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 105 :20458-63)。但是，这种方法要求技术，并且这种方法的成本高使得它的应用对多数实验室诊断来说相当困难。·因此，需要其它的途径和方法，作为无创产前诊断胎儿非整倍体性，以减少胎儿死亡的风险并允许筛选所有的妊娠，而不仅限于高风险妊娠。发明概述本发明提供一种新的途径，其根据检测ffDNA进行无创产前诊断。已经识别在每种被检测染色体上(染色体13、18、21、X和Y)的大量(多于2000)差异甲基化区域(DMR)(其在母体外周血和胎儿DNA(胎盘DNA)之间被差异甲基化)，通过利用具有高分辨率tiling寡核苷酸阵列(tilingoligonucleotide array)分析的系统稱合甲基化DNA免疫沉淀(MeDiP)，其能够以高通量的途径全染色体范围地识别DNA甲基化模式。进一步的，这些DMR的子集的代表性实施例(其在胎儿DNA中高甲基化，在母体外周血中低甲基化)已经被用来精确预测三染色体21，这种预测方法是基于从在母体血液样品中的低甲基化DNA物理分离高甲基化DNA (其通常在胎龄的早期妊娠阶段，并且没有对高甲基化DNA或低甲基化DNA进行化学改变或者酶消化)，然后测定在所述高甲基化DNA样品中的多个DMR的水平。因此，已经证明了本公开的DMR和诊断胎儿非整倍体性的方法的有效性。因此，在一个方面中，本发明涉及使用母体血液样品进行产前诊断胎儿非整倍体性的方法，所述方法包括 a)在母体血液样品中，从低甲基化DNA中物理分离高甲基化DNA，而没有使所述低甲基化DNA或高甲基化DNA进行化学改变或酶消化，以获得高甲基化DNA样品；b)在所述高甲基化DNA样品中，测定多个差异甲基化区域(DMR)的水平，以获得所述闻甲基化DNA样品的闻甲基化值；c)将所述高甲基化DNA样品的所述高甲基化值与所述多个DMR的标准化参考高甲基化值进行比较(例如，相匹配胎龄的正常母体高甲基化参考值)；以及d)基于所述比较诊断胎儿非整倍体性。在优选的实施方案中，所述母体血液样品是母体外周血样品。更优选的，所述高甲基化DNA通过甲基化DNA免疫沉淀(MeDiP)从低甲基化DNA物理分离。更优选的，在高甲基化DNA从低甲基化DNA中物理分离之后，对所述高甲基化DNA进行扩增，例如通过连接介导的聚合酶链反应(LM-PCR)。
所述多个DMR更优选地选自在附录A-E中的列表。在多个实施方案中，所述多个DMR的水平测定为至少3个、至少5个、至少8个、至少10个或至少12个DMR，例如选自在附录A-E中的列表。此外，也可以使用控制区(例如两个控制区)。更优选的，在所述高甲基化DNA样品中的所述多个DMR的水平通过实时定量聚合酶链反应(Real Time QPCR)测定。在一个实施方案中，多个DMR的水平也在总未处理母体血液DNA样品中测定作为LM-PCR效率的对照。更优选的，将所述高甲基化DN A样品的所述高甲基化值与标准化参考高甲基化值比较(例如从怀有正常胎儿的妇女中获得的母体DNA中测定的值)，当所述高甲基化DNA样品的所述高甲基化值高于所述标准化正常参考高甲基化值时，进行胎儿非整倍体性的诊断。在优选的实施方案中，所述多个DMR在诊断三染色体21的染色体21上。更优选的，在染色体21上的所述多个DMR包括三个或更多、五个或更多、或者八个或更多选自以下的区域碱基对 39279856-39280004 (SEQ ID NO :33)，碱基对 44161178-44161323 (SEQ IDNO :34)，碱基对 44161239-44161371 (SEQ ID NO :35)，碱基对 33320735-33320829 (SEQ IDNO :36)，碱基对 42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，碱基对 42355712-42355815 (SEQ IDNO 38)，碱基对 42357215-42357341 (SEQ ID NO 39)，碱基对 22403649-22403792 (SEQ IDNO 40)，碱基对 29136735-29136844 (SEQ ID NO 41)，碱基对 32268843-32268943 (SEQ IDNO 42)，碱基对 44079235-44079322 (SEQ ID NO 43)，碱基对 37841284-37841411 (SEQ IDNO :44)，及其组合。用于三染色体21诊断的染色体21上的优选的DMR是SEQ ID NO :36、37、38、39、40、42、43和44。在其它实施方案中，所述多个DMR在选自以下的染色体上染色体13、染色体18、X染色体和Y染色体。在又一方面中，本发明涉及使用母体外周血样品进行三染色体21的产前诊断方法，所述方法包括 a)在母体外周血样品中，从低甲基化DNA中物理分离高甲基化DNA，而没有使所述低甲基化DNA和高甲基化DNA进行化学改变或酶消化，以获得高甲基化DNA样品；b)在所述高甲基化DNA样品中，测定在染色体21上的多个差异甲基化区域(DMR)的水平，以获得所述闻甲基化DNA样品的闻甲基化值，其中在染色体21上的所述多个DMR包括选自以下的8个或多个区域碱基对39279856-39280004 (SEQ ID NO :33)，碱基对 44161178-44161323 (SEQID N0:34)，碱基对44161239-44161371 (SEQ ID NO :35)，碱基对 33320735-33320829 (SEQ ID N0:36)，碱基对42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，碱基对 42355712-42355815 (SEQ ID N0:38)，碱基对42357215-42357341 (SEQ ID NO :39)，碱基对 22403649-22403792 (SEQ ID N0:40)，碱基对29136735-29136844 (SEQ ID NO :41)，碱基对 32268843-32268943 (SEQ ID N0:42)，碱基对44079235-44079322 (SEQ ID NO :43)，碱基对 37841284-37841411 (SEQ ID N0:44)，及其组合，和其中所述多个DMR的水平通过实时定量聚合酶链反应(Real Time QPCR)测定；c)将所述高甲基化DNA样品的所述高甲基化值与染色体21上的所述多个DMR的标准化正常参考高甲基化值进行比较；以及
d)基于所述比较诊断三染色体21。用于三染色体21诊断的在染色体21上的DMR是SEQ ID NO :36、37、38、39、40、42,43和44。更优选的，所述高甲基化DNA通过甲基化DNA免疫沉淀(MeDiP)从低甲基化DNA物理分离。更优选的，在高甲基化DNA从低甲基化DNA中物理分离之后，对所述高甲基化DNA进行扩增，例如通过连接介导的聚合酶链反应(LM-PCR)。在一个实施方案中，多个DMR的水平也在总未处理母体血液DNA样品中测定作为LM-PCR效率的对照。在又一实施方案中，将所述高甲基化DNA样品的高甲基化值与正常母体血液样品的标准化正常参考高甲基化值进行比较，当所述高甲基化DNA样品的高甲基 化值高于所述标准化正常参考高甲基化值时，进行三染色体21的诊断。在又一方面中，本发明涉及适用于诊断胎儿非整倍体性的识别目标染色体上差异甲基化区域(DMR)的方法，所述方法包括a)提供⑴正常成年女性外周血DNA样品(PB样品)；和(ii)正常胎盘DNA样品(PL样品)；b)在a)的每个样品中，从低甲基化DNA中物理分离高甲基化DNA，而没有使所述高甲基化DNA或低甲基化DNA进行化学改变或酶消化，以获得⑴分离的PB样品；和(iii)分离的PL样品；c)在b)的每个分离样品中，测定目标染色体上多个区域的水平；以及d)选择在所述分离的PB样品中低甲基化和在所述分离的PL样品中高甲基化的区域，从而识别所述目标染色体上的差异甲基化区域(DMR)。在一个实施方案中，其中所述PL样品包括两种不同的样品，早期妊娠PL样品和晚期妊娠PL样品，其中步骤d)进一步包括选择在所述早期妊娠分离的PL样品和所述晚期妊娠分离的PL样品中具有相等程度的甲基化的区域。在优选的实施方案中，所述目标染色体是染色体21。在其它实施方案中，所述目标染色体选自染色体13、染色体18、X染色体和Y染色体。在优选的实施方案中，所述非整倍体是三染色体性。在又一实施方案中，所述非整倍体是单染色体性。在又一方面中，本发明涉及三染色体21的产前诊断试剂盒，所述试剂盒包括a) 一种或多种核酸组合物，用以测定在染色体21上的多个差异甲基化区域(DMR)的水平；以及b)使用这种核酸组合物进行染色体21的产前诊断的说明书。更优选的，在染色体21上的所述多个DMR是选自在附录A中的列表。更优选的，在染色体21上的所述多个DMR包括三个或更多、五个或更多、或者八个或更多的选自以下的区域碱基对 39279856-39280004 (SEQ ID NO :33)，碱基对 44161178-44161323 (SEQ ID NO:34)，碱基对 44161239-44161371 (SEQ ID NO :35)，碱基对 33320735-33320829 (SEQ ID NO:36)，碱基对 42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，碱基对 42355712-42355815 (SEQ ID NO:38)，碱基对 42357215-42357341 (SEQ ID NO :39)，碱基对 22403649-22403792 (SEQ ID NO:40)，碱基对 29136735-29136844 (SEQ ID NO :41)，碱基对 32268843-32268943 (SEQ ID NO:42)，碱基对 44079235-44079322 (SEQ ID NO :43)，碱基对 37841284-37841411 (SEQ ID NO:44)，及其组合。用于三染色体21诊断的在染色体21上的DMR是SEQ ID NO :36、37、38、39、40、42、43 和 44。在所述试剂盒的优选的实施方案中，所述核酸组合物包括选自以下的一种或多种寡核苷酸引物SEQ ID NO :1-24，及其组合。在又一实施方案中，所述试剂盒进一步包括用于控制区检测的寡核苷酸引物(例如两个或更多个)。在又一实施方案中，所述试剂盒进一步包括这样的构件，该构件用于在血液样品中从低甲基化DNA中物理分离高甲基化DNA，而没有使所述高甲基化DNA或低甲基化DNA进行化学改变或酶消化。更优选的，所述从低甲基化DNA中物理分离高甲基化DNA的构件包括用于免疫沉淀甲基化DNA的抗体。在又一实施方案中，所述试剂盒进一步包括扩增高甲基化DNA的构件。在优选的实施方案中，扩增所述高甲基化DNA的构件包括进行连接介导的聚合酶链反应(LM-PCR)的寡核苷酸连接体和/或寡核苷酸引物。在又一方面中，本发明涉及核酸组合物，包含选自以下的一种或多种隔离的寡核苷酸引物SEQ ID NO :1-24，及其组合。 附图
简述图I是其显示通过核苷酸阵列分析的CHR21 (A)区域的DNA甲基化的富集的图表。所述图表显示在第3期妊娠胎盘和周围(全部)血液之间的甲基化差异，以及周围(全部)血液、第I期妊娠和第3期妊娠胎盘DNA样品的单独甲基化状态。图2是显示CHR21㈧的DNA甲基化的富集(来自核苷酸阵列分析和实时定量PCR，使用外周血、第一期妊娠和第3期妊娠胎盘DNA样品)的图表。所述Y轴指示与外周血DNA样品相比的胎盘相对富集倍数，所述X轴指示染色体位置(以bp计)。灰线代表覆盖染色体21特定区域的寡核苷酸，而黑线代表当应用实时荧光定量PCR时所述PCR产物(CHR21 (AD&CHR21 (A2))。点线代表从第一期妊娠胎盘获得的结果，而实线代表从第3期妊娠胎盘获得的结果。图3是显示CHR21 (B4)的DNA甲基化的富集(通过在MeDiP和输入复制的DNA样品上的实时定量PCR)的条形图。开放的棒是周围(全部)血液样品，灰色的棒是第一期妊娠胎盘DNA样品，黑色的实棒是第3期妊娠胎盘DNA样品。所述误差杆指示在技术副本之间的标准偏差。WB :全部(周围)血液，PL :胎盘。图4是显示CHR13(HYP1)的DNA甲基化的富集(使用实时定量PCR)的条形图。开放的棒是相对于周围(全部)血液的输入DNA，黑色的实棒是相对于周围(全部)血液的的免疫沉淀DNA，1PL&2PL是第3期妊娠胎盘，3PL是第I期妊娠胎盘。WB是全部(周围)血液，PL是胎盘。图5是识别差异甲基化区域(DMR)的方法流程图。图6是无创性诊断测试三染色体21 (NID21)的发展和确认的方法流程图。图7是所述DNA甲基化比率分析策略的图解性说明，其用于使用母体外周血分析的三染色体21无创性检测，通过对定位在染色体21上的胎儿特异性DNA甲基化区域的相
对定量。图8是DNA甲基化比率测定的分析途径的图解性说明。图9是BoxPlot箱线图表示，该结果从4个DMR获得在正常和三染色体21上的EP1、EP4、EP7 和 ΕΡΙΟ。发明详述本发明是至少部分根据发明人对多种差异甲基化区域(DMR)的识别，所述差异甲基化区域(DMR)在胎儿DNA中表现高甲基化和在母体DNA中表现低甲基化。更进一步地，本发明是至少部分根据本发明人的证明高甲基化胎儿DNA能从低甲基化母体DNA中纯化出来，通过物理分离这两种DNA群，其不对这两种DNA群进行化学改变或者酶消化，从而导致在样品中富集高甲基化胎儿DNA。更进一步的，本发明人已经精确地诊断在一组母体外周血样品中的三染色体21，使用本文公开的DMR的代表性实施例，从而证明识别的DMR和公开的诊断胎儿非整倍体性中方法的有效性。本公开的多个方面在下述部分被进一步地描述。I.胎儿非整倍体性的无创产前诊断方法 在一个方面中，本发明提供了使用母体血液样品进行胎儿非整倍体性的产前诊断方法，所述方法包括 a)在母体血液样品中，从低甲基化DNA中物理分离高甲基化DNA，而没有使所述低甲基化DNA或高甲基化DNA进行化学改变或酶消化，以获得高甲基化DNA样品；b)在所述高甲基化DNA样品中，测定多个差异甲基化区域(DMR)的水平，以获得所述闻甲基化DNA样品的闻甲基化值；c)将所述高甲基化DNA样品的所述高甲基化值与所述多个DMR的标准化参考高甲基化值进行比较(例如下文进一步公开的标准化正常参考高甲基化值)；以及d)基于所述比较诊断胎儿非整倍体性。母体血液样品所述母体血液样品能通过标准技术获得，例如使用枕头和注射器。在优选的实施方案中，所述母体血液样品是母体外周血样品。可选择地，所述母体血液样品是外周血的分离部分，例如母体血浆样品。一旦获得所述血液样品，总DNA可以使用标准技术(其非限制性实施例是QIAmp DNA Blood MidiKit(Qiagen))从所述样品中提取出来。通常，然后分离所述总DNA，更优选的得到大小约300bp-800bp。例如，所述总DNA可以通过超声波降解。从低甲基化DNA分离高甲基化DNA在本方法中，从低甲基化DNA中物理分离高甲基化DNA以获得高甲基化DNA样品，其没有对所述低甲基化DNA或高甲基化DNA进行化学改变或酶消化。更优选的，这种物理分离通过甲基化DNA免疫沉淀(MeDiP)实现，这种技术已经在现有技术中描述(参见例如 Weber, Μ.等(2005) Nat. Genet. 37 :853-862 ；和 Rakyan,等(2008) Genome Res. 18 1518-1529 ;其表述都以参考的方式并入本文)。在所述MeDiP技术中，所述输入DNA是变性的，与直接抗5_甲基胞嘧啶的抗体孵育，然后通过免疫沉淀分离得到所述甲基化DNA。例如，为了实现免疫沉淀，所述抗-5-甲基胞嘧啶抗体可以被连接到固体支持物上(例如免疫磁珠、琼脂糖微球或顺磁珠)，以允许从溶液中沉淀(直接免疫沉淀)甲基化DNA。可选择地，次级抗体或试剂可以用于识别所述抗-5-甲基胞嘧啶抗体(例如所述抗体的恒定区)，并且其被连接到固体支持物上，从而允许从溶液中沉淀(非直接免疫沉淀)所述甲基化DNA。对直接或非直接免疫沉淀来说，其它在现有技术中已知用于在一个样品中进行物理分离的途径，例如可以使用所述生物素/抗生物素蛋白体系或者生物素/链霉亲和素体系。例如，所述抗-5-甲基胞嘧啶抗体可以被连接到生物素上，然后抗生物素蛋白或者链霉亲和素被连接到固体支持物上，用以允许从溶液中沉淀所述甲基化DNA。在现有技术中已知的用于导致免疫沉淀的其它变体对于本发明来说也是合适的，这对于普通技术人员来说是非常明显的。因此，如本文使用的，所述术语“甲基化DNA免疫沉淀”或者“MeDiP”目的是包含任意和所有方法，在这些方法中，使区别高甲基化DNA和低甲基化DNA的抗体与来自所述母体血液样品的DNA接触，接着从溶液中沉淀所述高甲基化DNA (例如特异性地和所述抗体结合的所述DNA)。在实现从所述母体血液样品中所述低甲基化DNA中物理分离所述高甲基化DNA的过程中，所述样品中的所述DNA没有被化学改变或者酶消化。如本文使用的，所述术语“化学改变”是指使所述DNA与非抗体化学物质反应，所述非抗体化学物质能区别高甲基化DNA和低甲基化DNA，例如亚硫酸氢钠转换。因此，在这种即时方法中，所述母体血液样品的DNA不遭受亚硫酸氢钠转换或任何其他相似(非抗体)化学反应(其区别高甲基化DNA和低甲基化DNA)。尽管如此，如本文使用的，所述术语“酶消化”是指使所述DNA与一种或多种甲 基化敏感限制酶反应，从而去除低甲基化DNA。因此，在这种即时方法中，所述所述母体血液样品的DNA没有用甲基化敏感限制酶处理以区别高甲基化DNA和低甲基化DNA。应当注意的是，尽管如此，来自所述母体外周血样品(其通常在从所述低甲基化DNA分离所述高甲基化DNA前进行)的DNA的破碎，其通常是通过超声波剪切实现，也可以通过用限制性酶消化DNA实现。尽管如此，这种所述DNA的一般消化实现破碎的方法不是用甲基化敏感限制酶实现的。因此，不被“酶消化”的所述母体血液样品的所述DNA的要求并不打算排除使用非-甲基化敏感限制酶来实现所述母体血液样品DNA.的全部破碎(即，粉碎)。DNA 扩增在所述诊断方法中，通常在从在所述母体血液样品中的所述低甲基化DNA中物理分离所述高甲基化DNA后，对所述高甲基化DNA进行扩增。如本文使用的，所述术语“扩增”意思是所述DNA的其它副本被制备从而增加所述DNA的拷贝数，其通常是使用聚合酶链反应(PCR)来实现的。所述高甲基化DNA的扩增的优选方法是连接介导的聚合酶链反应(LM-PCR)，其已经在现有技术中被描述过(参见例如Ren，B.等(2000) Science益2306-2309 jP0berley，M. J.等(2004)Methods EnzymoI. 376 :315-334 ;两篇文章的内容都通过参考的方式并入本文)。在LM-PCR中，连接体末端通过平头连接连接到DNA片段样品上，然后在PCR中使用识别所述连接体末端核苷酸序列的寡核苷酸引物，从而扩增所述(所述连接体已经被连接到其上的)DNA片段。因此，在即时诊断方法的优选实施方案中，在来自所述母体血液样品的DNA被破碎(例如破碎成大约300-800bp)之后，和在所述高甲基化DNA被从所述低甲基化DNA(例如通过MeDiP)物理分离出来之前，连接臂通过平头连接被连接到破碎的DNA上。然后，在从低甲基化DNA中物理分离所述高甲基化DNA之后，所述回收的高甲基化DNA使用寡核苷酸引物进行PCR，所述寡核苷酸引物识别连接到所述DNA上的连接体末端。这导致所述高甲基化DNA样品的扩增。差异甲基化区域(DMR)本发明的诊断方法使用多个差异甲基化区域(DMR)。如本文使用的，所述术语“差异甲基化区域”或者“DMR”是指在染色体DNA中的区域，其在胎儿和母体DNA中被差异甲基化，为了更优选地实现本发明，选择的DMR是这些，其在胎儿DNA中高甲基化，在母体DNA中低甲基化。也就是说，这些区域(选定的DMR)在胎儿DNA中，相对于母体DNA表现更大(或更多)的甲基化程度。在理论上，在目标染色体中具有上述特性的任意DMR可以用于所述即时诊断方法。特别地，识别这些DMR的方法在下文和所述实施例中(参见实施例I和2)详细描述。此外，已经识别了适合在所述诊断方法中使用的多种(大约2000)的DMR(对每种染色体，染色体13、18、21、X和Y)。这些DMR在附录A-E中列出，其为染色体21、13、18、X和Y分别提供了选定的DMR。如本文中使用的，所述术语“多个DMR”是指两种或更多个DMR。在优选的实施方案中，所述多个DMR选自附录A-E中的列表，分别对于染色体21、13、18、X或者Y。在多个实施方案中，所述多·个DMR的水平被测定为至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个或者至少12个DMR。又，最优选的，所述多个DMR选自附录A-E中的列表。在优选的实施方案中，所述多个DMR在诊断三染色体21的染色体21上。在尤其优选的实施方案中，在染色体21上的所述多个DMR包括两个或更多，3个或更多，4个或更多，5个或更多，6个或更多，7个或更多，8个或更多，9个或更多，10个或更多，11个或更多，或12个选自以下的区域碱基对39279856-39280004(SEQ ID NO :33)，碱基对44161178-44161323 (SEQID NO :34)，碱基对 44161239-44161371 (SEQ ID N0:35)，碱基对33320735-33320829 (SEQ ID NO :36)，碱基对 42189557-42189683 (SEQ ID N0:37)，碱基对42355712-42355815 (SEQ ID NO :38)，碱基对 42357215-42357341 (SEQ ID N0:39)，碱基对22403649-22403792 (SEQ ID NO :40)，碱基对 29136735-29136844 (SEQ ID N0:41)，碱基对32268843-32268943 (SEQ ID NO :42)，碱基对 44079235-44079322 (SEQ ID N0:43)，碱基对37841284-37841411 (SEQ ID N0:44)，及其组合。关于这些区域的术语，所述术语“碱基对39279856-39280004”(诸如此类)是指在染色体21上的差异甲基化区域的第一个和最后一个碱基对位置。因此，所述在染色体21上的“碱基对39279856-39280004”代表性的DMR，那么所述DMR包括在染色体21上的区域，其起始碱基对39279856，终止碱基对39280004 (因此，这个区域包含148碱基对的区域)。扩增上述列出的DMR的寡核苷酸引物在实施例3中和在表7中被进一步描述，其显示在SEQ ID NO :1-24中。上述列出的DMR的核苷酸序列被在表8和SEQ ID NO 33-44中示出。如同在实施例3中详细描述的，在SEQ ID NO :33_44中示出的12个DMR中的8个的子集被选择出来，并被识别，足以精确诊断在(在怀有三染色体21的胎儿的妇女的怀孕期间的)母体血液样品中的三染色体21。用于本发明的所述染色体21诊断方法的在染色体21上的这8个优选的DMR由以下组成碱基对33320735-33320829 (SEQ ID NO :36)，碱基对 42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，碱基对 42355712-42355815 (SEQ ID N0:38)，碱基对 42357215-42357341 (SEQ ID NO :39)，碱基对 22403649-22403792 (SEQ ID N0:40)，碱基对 32268843-32268943 (SEQ ID NO :42)，碱基对 44079235-44079322 (SEQ ID NO 43)和碱基对 37841284-37841411 (SEQ ID NO 44)。在多个其它实施方案中，所述多个DMR在选自以下的染色体上染色体13、染色体
18、X染色体和Y染色体，其允许这些染色体的任何一种的非整倍体性诊断。
对照的DMR也可以在本发明的诊断方法中使用。例如，所述诊断方法中可以包括另一个已知的高甲基化DMR，其作为高甲基化的对照。优选的对照高甲基化区域包括CHR13 (HYPl)(其引物在 SEQ ID NO :25 和 26 中示出)，以及 CHR13 (HYP2)(其引物在 SEQ IDN0:27和28中示出)。此外，CHR13 (HYPl)的PCR产物的核苷酸扩增序列在表8中和在SEQID N0:45中示出。此外或可选择地，所述诊断方法可以包括另一种已知的低甲基化DMR，其作为低甲基化的对照。优选的对照低甲基化区域包括CHR22 (Ul)(其引物在SEQ ID NO 29和30中示出)、以及CHR22(U2)(其引物在SEQ ID NO :31和32中示出)。此外，CHR22 (Ul)的PCR产物的核苷酸扩增序列在表8中和在SEQ ID N0:46中示出。对照DMR以及其引物，在实施例I中进一步被讨论，在表6、7和8中进一步被描述。在附录A-E中示出的任意DMR的实际核苷酸序列容易从本文以及现有技术提供的信息获得。更加具体的，每个在附录A-E中示出的DMR通过在特定染色体上的起始和终止碱基对限定，例如上文描述的染色体21的“碱基对39279856-39280004”。已经测定染色体.21、13、18、X和Y中的每一条完整核苷酸序列，并且已经可以从公开的现有技术中获得。例如，这5条染色体的每一条完整核苷酸序列可以从UCSC基因组浏览器数据库(UCSCGenomeBrowser)第 36 版 Build 36 (http: //genome, ucsc. edu)中获得。此外，在这 5 条染色体的每条中的特定起始和终止的碱基对位置可以被输入到基因库浏览器(Genome Browser)中，以获得在染色体上的一段DNA核苷酸序列。此外，可以根据所述DMR的核苷酸序列，使用标准分子生物学方法，来设计检测和/或扩增DMR的寡核苷酸引物。因此，本文提供的所述信息，在附录A-E中示出的所述每个DMR的起始和终止碱基对位置，以及由普通技术人员使用现有技术的其它染色体序列容易获得的DMR的核苷酸序列，例如这些容易从UCSC基因库浏览器(UCSC Genome Brower)获得的序列，附录A-E中示出的DMR的每条完整核苷酸序列此处都通过参考的方式并入本文。测定DMR的水平在所述即时诊断方法中，在所述高甲基化DNA从所述低甲基化DNA物理分离后，以及优选的在对所述回收的高甲基化DNA进行扩增后，测定在所述高甲基化DNA样品中的多个差异甲基化区域(DMR)的水平，从而获得所述高甲基化DNA样品中的高甲基化值。如本文使用的，所述术语“测定所述多个DMR的水平”意思是测定所述DMR的数量(amount)、发生程度(prevalence)、或者拷贝数。其基础是在具有胎儿非整倍体性的胎儿中，与正常胎儿相比，作为所述非整倍体的结果其具有大量的(即较高的拷贝数)的DMR。在优选的实施方案中，在所述高甲基化DNA样品中的所述多个DMR的水平通过实时定量聚合酶链反应(RealTime QPCR)测定，实时定量聚合酶链反应是现有技术中已知的技术。代表性的，Real Time QPCR的非限定性条件在实施例中给出。在一个实施方案中，测定所述在未处理母体血液DNA总样品中多个DMR的水平(例如通过Real Time QPCR)，作为LM-PCR效率的对照。如本文使用的，所述术语“未处理母体血液DNA总样品”是指从母体血液获得的DNA样品，其没有遭受处理(从所述低甲基化DNA中物理分离高甲基化DNA)。测定在所述高甲基化DNA样品中的多个差异甲基化区域(DMR)的水平，从而获得所述高甲基化DNA样品的高甲基化值。如本文使用的，所述术语“高甲基化值”意思是包括在所述样品中DMR的水平的任意定量的表述。例如，从Real Time QPCR获得的所述原始数据可以根据多种对照和数据统计进行标准化，以获得一种或多种描述在所述高甲基化DNA样品中的多个DMR的每个的水平的数值。代表性的，可以在样品中应用的非限定性对照实施例和数据分析在实施例3中详细描述。尽管如此，普通技术人员容易理解用于评估实施例3中数据的特定数据测试是代表性统计途径，并且所述可以应用于所述即时发明的可替代统计途径是基于在实施例和图形中提供的指导。与标准化参考值的比较一旦在存在于母体外周血的高甲基化胎儿DNA(也称为检测“DNA”)的高甲基化值被测定，这个值将被拿来与标准化参考高甲基化值(对于在所述检测DNA中中相同多个DMR而言)作比较，然后根据这个比较结果，作出胎儿非整倍体性(或缺少这种胎儿非整倍体性)的诊断。
通常，将所述高甲基化DNA样品的所述高甲基化值与正常胎儿的标准化正常参考闻甲基化值进行比较，并且当所述闻甲基化DNA样品的所述闻甲基化值闻于正常胎儿的标准化正常参考高甲基化值时，作出胎儿非整倍体性的诊断。也就是说，设置“正常”高甲基化值，其是根据从存在与母体外周血的正常胎儿DNA (即从没有胎儿非整倍体性的胎儿中获得的DNA)获得的数据，然后当所述检测DNA的高甲基化值高于所述“正常”值时，作出所述检测样品胎儿非整倍体性的诊断。更优选的，用于与所述“检测DNA”相比较的标准化正常参考高甲基化值的测定，其使用来自怀有相应胎龄的正常胎儿(即没有胎儿非整倍体性的胎儿)的妇女母体外周血样品(即没有胎儿非整倍体性的胎儿)，例如，如果所述检测DNA是来自3个月胎龄的胎儿，那么所述标准化正常参考高甲基化值的测定使用来自怀有3个月胎龄的正常胎儿的母体外周血样品。例如，设置标准化正常参考高甲基化值为“1”，那么如果所述检测DNA的高甲基化值高于“I”表明其为非正常胎儿，而等于“I”或者小于“I”的高甲基化值表明其为正常胎儿。另外或者可选择地，可以将所述高甲基化DNA样品的所述高甲基化值与胎儿非整倍体性的胎儿的标准化参考高甲基化值进行比较，当所述检测DNA的高甲基化值与胎儿非整倍体性胎儿的标准化参考高甲基化值相当时，作出胎儿非整倍体性的诊断。也就是说，可以设置“非正常”或者“胎儿非整倍体性”的标准化参考高甲基化值，根据从母体外周血的胎儿非整倍体性胎儿DNA(即来自具有胎儿非整倍体性的胎儿DNA)获得的数据，当所述检测DNA的高甲基化值与“非正常”或者“胎儿非整倍体性”的数值相当(相似，在相同的范围内)时，可以作出胎儿非整倍体性的诊断。为了建立正常胎儿的所述标准化正常参考高甲基化值，选择了一组怀有健康胎儿的健康怀孕妇女。这些妇女具有相似的胎龄，其使用本发明的方法对于筛选条件(例如先兆子痫，胎儿染色体非整倍体和早产)处于合适的怀孕期。与此相似，使用来自一组健康非怀孕妇女的样品可以建立标准化参考值。选定的怀孕妇女和她们怀有的胎儿的健康状态，通过建立好的、常规使用的方法(包括但不限於检测妇女的血压、记录妊娠最初，和使用CVS和羊膜穿刺术进行胎儿遗传分析)确定。进一步的，所选定组的怀有健康胎儿的健康怀孕妇女必须必须具有合理的大小，以确保正常胎儿的标准化参考高甲基化值的数据是准确的。更优选的，所述选定的组包括至少10个妇女。为了建立正常胎儿的所述标准化正常参考高甲基化值，来自这些怀有正常胎儿的母体血液样品经历相同的步骤(a)和(b)(上文描述的诊断方法)，称为从低甲基化DNA物理分离高甲基化DNA(没有对所述低甲基化DNA或高甲基化DNA进行化学改变或酶消化)以获得高甲基化DNA样品；然后测定在所述高甲基化DNA样品中的多个差异甲基化区域(DMR)的水平，以获得所述高甲基化DNA样品的高甲基化值。与此相似，“非正常”胎儿的标准化参考高甲基化值可以使用相同的途径(如上文描述的建立“正常”胎儿的标准化参考高甲基化值)建立，除了用于建立所述“非正常”参考值的所述母体血液样品是来自(其已经使用传统无创性诊断方法被测定怀有胎儿非整倍体性的胎儿的)怀孕妇女。这些实施例，特别是实施例3，以详细的合适的数据分析途径描述，所述途径可以用来分析从DNA样品中获得的数据。例如，数据分析可以使用在实施例中详细描述的曼-惠特尼检验(Mann-Whitney U test),费歇尔检验(Fisher test)和步进模型分析(stepwisemodel analysis)。但是,本领域普通技术人员容易理解用于评估在实施例中的数据的特定统计检验是代表性的统计途径，并且本发明也可以根据在实施例和附图中提供的指导来 应用可选择的统计途径。II.三染色体21的无创产前诊断检验在又一方面中，本发明提供三染色体21的无创产前诊断检验(本文也称为“NID21检验”)。如在实施例3中详细讨论的，已经使用在实施例I和2中描述的DMR发展和证实了 NID21检验。在所述检验的发展过程中，染色体21上的12个DMR(如本文公开的)被检验，使用来自40个案例的母体血液样品，20个正常和20个非正常(即从已知怀有三染色体21胎儿的妇女中)。所述结果的统计分析(如在实施例3中详细描述的)显示了最富有信息的染色体区域，证明了只有8个特定DMR(其来自总的起始检验的12个DMR)的检验足够实现100%敏感度和精确度，在所有正常和非正常案例的诊断中。因此，在又一方面中，本发明提供了使用母体外周血样品进行三染色体21的产前诊断方法，所述方法包括a)在母体外周血样品中，从低甲基化DNA中物理分离高甲基化DNA，而没有使所述低甲基化DNA和高甲基化DNA进行化学改变或酶消化，以获得高甲基化DNA样品；b)在所述高甲基化DNA样品中，测定在染色体21上的多个差异甲基化区域(DMR)的水平，以获得所述闻甲基化DNA样品的闻甲基化值，其中在染色体21上的所述多个DMR包括选自以下的8个或多个区域碱基对39279856-39280004 (SEQ ID NO :33)，碱基对 44161178-44161323 (SEQID N0:34)，碱基对44161239-44161371 (SEQ ID NO :35)，碱基对 33320735-33320829 (SEQ ID N0:36)，碱基对42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，碱基对 42355712-42355815 (SEQ ID N0:38)，碱基对42357215-42357341 (SEQ ID NO :39)，碱基对 22403649-22403792 (SEQ ID N0:40)，碱基对29136735-29136844 (SEQ ID NO :41)，碱基对 32268843-32268943 (SEQ ID N0:42)，碱基对44079235-44079322 (SEQ ID NO :43)，碱基对 37841284-37841411 (SEQ ID N0:44)，及其组合，以及其中所述多个DMR的水平通过实时定量聚合酶链反应(Real Time QPCR)测定；c)将所述高甲基化DNA样品的所述高甲基化值与染色体21上的所述多个DMR的标准化正常参考高甲基化值进行比较；以及d)基于所述比较诊断三染色体21。
在优选的实施方案中，在染色体21上的所述多个DMR由8个具有以下核苷酸序列的区域组成碱基对 33320735-33320829 (SEQ ID NO 36)，碱基对 42189557-42189683 (SEQID NO :37)，碱基对42355712-42355815 (SEQ IDNO :38)，碱基对42357215-42357341 (SEQ IDNO 39)，碱基对 22403649-22403792 (SEQ ID NO 40)，碱基对 32268843-32268943 (SEQ IDNO :42)，碱基对 44079235-44079322 (SEQ ID NO 43)和碱基对 37841284-37841411 (SEQ IDNO 44)。更优选的，所述高甲基化DNA通过甲基化DNA免疫沉淀(MeDiP)从低甲基化DNA物理分离(在上文第I部分进一步描述)。更优选的，在高甲基化DNA从低甲基化DNA中物理分离之后，对所述高甲基化DNA进行扩增，例如通过连接介导的聚合酶链反应(LM-PCR)(如在第I部分详细描述的)。在实施例3和表7中进一步详细描述了用于扩增上文列出的染色体21的DMR的寡核苷酸引物，并且其在SEQ IDNO 1~24中列出。因此，所述诊断方法也可以使用对照DMR。例如，所述诊断方法可以包括已 知高甲基化的一种或多种DMR，作为高甲基化的对照。优选的对照高甲基化区域包括CHR13 (HYPl)，其引物在SEQ ID NO :25和26中示出(并且其核苷酸序列在SEQ ID NO 45中示出);以及CHR13(HYP2)，其引物在SEQID NO :27和28中示出。另外或者可选择地，另一个已知被低甲基化的DMR可以被包括在所述诊断方法中，作为低甲基化的对照。优选的对照低甲基化区域包括CHR22 (Ul)，其引物在SEQ ID N0:29和30中示出(并且其核苷酸序列在SEQ ID N0:46中示出);以及CHR22 (U2)，其引物在SEQ ID NO :31和32中示出。对照DMR，及其引物在实施例I中被进一步讨论，并且在表6中进一步被描述。在一个实施方案中，多个DMR的水平也在总未处理母体血液DNA样品中测定作为LM-PCR效率的对照(如上文第I部分所描述的)。更优选的，将所述高甲基化DNA样品的所述高甲基化值与正常胎儿的标准化正常参考高甲基化值作比较，并且当所述高甲基化DNA样品的高甲基化值高于正常胎儿的所述标准化正常参考高甲基化值时，进行三染色体21的诊断。也就是说，可以根据从存在于母体外周血的正常胎儿DNA(即从不具有胎儿非整倍体性的胎儿获得的DNA)(如上文详细描述的)中获得的数据，设定“正常的”高甲基化值(对于在染色体21上的多个DMR)，当所述检测DNA的高甲基化值高于所述“正常”值时作出所述检测样品三染色体21的诊断。例如，在实施例3中已经计算了所述12个DMR的“正常”高甲基化值，据此，选定了 8个优选的DMR，其足够允许在检测样品中三染色体21的精确诊断。另外或者可选择地，可以将所述高甲基化DNA样品的所述高甲基化值与三染色体21胎儿的标准化参考高甲基化值作比较，当所述检测DNA的高甲基化值可以与三染色体21胎儿的标准化参考高甲基化值相比时，作出三染色体21的诊断。也就是说，可以设定“非正常”高甲基化值(对于在染色体21上的多个DMR而言)，根据从三染色体21胎儿DNA (即从具有三染色体21的胎儿获得的DNA)获得的数据；并且当所述检测DNA的所述高甲基化值与所述“非正常值”相当(相近，在相同的范围内)时，作出所述检验样品三染色体21的诊断。III.识别差异甲基化区域的方法在又一方面中，本发明提供识别差异甲基化区域(DMR)(其在胎儿DNA中高甲基化,在母体DNA中低甲基化)的方法，基于从低甲基化DNA中中的高甲基化DNA的物理分离。如在实施例I和2中的详细描述，本文所描述的途径已经在染色体-范围内得到应用，来识别多种在染色体21、13、18、X和Y上的差异甲基化区域，其在胎儿DNA中表现较高水平的甲基化(高甲基化)，相对于成年女性外周血DNA而言。此外，可以应用这些相同的途径来识别在这些相同染色体上的其他DMR和识别其它染色体上的新DMR。因此，在又一方面中，本发明提供一种适用于诊断胎儿非整倍体性的识别目标染色体上差异甲基化区域(DMR)的方法，所述方法包括a)提供(i)正常成年女性外周血DNA样品(PB样品)；和(ii)正常胎盘DNA样品(PL样品)；b)在a)的每个样品中，从低甲基化DNA中物理分离高甲基化DNA，而没有使所述·高甲基化DNA或低甲基化DNA进行化学改变或酶消化，以获得⑴分离的PB样品；和(iii)分离的PL样品;c)在b)的每个分离样品中，测定目标染色体上多个区域的水平；和d)选择在所述分离的PB样品中低甲基化和在所述分离的PL样品中高甲基化的区域，从而识别所述目标染色体上的差异甲基化区域(DMR)，其适合在本文描述的诊断方法中使用。在一个实施方案中，所述PL样品包括两种不同的样品，早期妊娠PL样品和晚期妊娠PL样品，其中步骤d)进一步包括选择在所述早期妊娠分离的PL样品和所述晚期妊娠分离的PL样品中具有相等程度的甲基化的区域。在优选的实施方案中，所述目标染色体是染色体21。在多个其它实施方案中，所述目标染色体选自染色体13、染色体18、X染色体和Y染色体。更优选的，所述非整倍体是三染色体。如本文使用的，“正常成年女性”是不具有染色体非整倍体性的女性。如本文使用的，“正常胎盘DNA”是来自不具有胎儿非整倍体性的胎儿胎盘的DNA。在每个样品中，所述高甲基化DNA从低甲基化DNA物理分离，其没有对所述高甲基化DNA或低甲基化DNA进行化学改变或酶消化，如上文第I部分详细描述的。更优选的，这种分离是使用甲基化DNA免疫沉淀(MeDiP)实现的，如在第I部分所描述的，以获得所述“分离的”样品。如本文使用的所述术语“分离的PB样品”和“分离的PL样品”是指所述部分的原始外周血样品或者原始胎盘DNA样品，其被认为含有已经从低甲基化DNA分离的高甲基化DNA。例如，当使用MeDiP进行分离，所述“分离的”样品是已经被免疫沉淀的部分的外周血或者胎盘DNA。更优选的，在分离之后，扩增所述分离的PB样品和所述分离的PL样品的DNA，更优选的通过LM-PCR扩增。因此，在这个实施方案中，连接末端是在分离之前通过平头连接连接到所述DNA，并且在分离之后，使用识别连接末端的寡核苷酸引物(如上文第I部分中详细描述的)，在所述分离的DNA样品中进行PCR。所述多个目标染色体上的区域的水平在分离的样品中被测定(如在上文第I部分中描述的)，更优选的通过Real Time QPCR。也如同上文描述的，对照和统计分析可以被应用到所述原始数据，以测定所述多个区域的高甲基化值。最后，为了识别在目标染色体上的特定差异甲基化区域(DMR)，选定在来自正常成年女性的分离的外周血(PB)样品中是低甲基化的而在来自正常胎儿的分离的胎盘(PL)中是高甲基化的区域。IV.本发明的试剂盒在又一方面中，本发明提供能用于本发明诊断方法的试剂盒。这种试剂盒通常包括至少一种试 剂和所述试剂盒的使用说明。在优选的实施方案中，本发明提供三染色体21的产前诊断试剂盒，所述试剂盒包括a) 一种或多种核酸组合物，用以测定在染色体21上的多个差异甲基化区域(DMR)的水平；和b)使用所述核酸组合物进行无创三染色体21的产前诊断的说明书。可以选择在染色体21上的所述多个DMR，例如在附录A的列表中所示出的所述染色体21DMR。更优选的，在染色体21上的所述多个DMR包括至少一个选自以下的区域碱基对 39279856-39280004 (SEQ ID NO :33)，碱基对 44161178-44161323 (SEQ ID N0:34)，碱基对44161239-44161371 (SEQID NO :35)，碱基对 33320735-33320829 (SEQ ID N0:36)，碱基对 42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，碱基对 42355712-42355815 (SEQ ID N0:38)，碱基对 42357215-42357341 (SEQ ID NO :39)，碱基对 22403649-22403792 (SEQ ID N0:40)，碱基对 29136735-29136844 (SEQ ID NO :41)，碱基对 32268843-32268943 (SEQ ID N0:42)，碱基对 44079235-44079322 (SEQ ID NO :43)，碱基对 37841284-37841411 (SEQ ID N0:44)，及其组合。在其它实施方案中，在染色体21上的所述多个DMR包括两个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、或10个或更多的上文所列出的区域。在优选的实施方案中，在染色体21上的所述多个DMR由分别具有以下序列的8个区域组成SEQ ID NO :36、37、38、39、40、42、43和44。扩增上文列出的12个DMR的寡核苷酸引物在实施例3和表7中进一步详细描述，并且在SEQ ID NO 1~24示出。因此，在所述试剂盒优选的实施方案中，所述核酸序列包括选自SEQ IDNO 1-24的一种或多种寡核苷酸引物及其组合。此外，一种或多种扩增对照高甲基化或低甲基化区域的寡核苷酸引物可以被包括在所述试剂盒内。例如，优选的对照高甲基化区域包括CHR13 (HYPl)和 CHR13(HYP2) ;CHR13 (HYPl)的引物在 SEQ ID NO :25 和 26 (并且其具有的核酸序列在SEQ ID N0:45中示出)中示出；CHR13(HYP2)的引物在SEQ ID N0:27和28中示出。优选的对照甲基化区域包括CHR22 (Ul)和CHR22(U2) ；CHR22(U1)的引物在SEQ IDNO 29和30中示出(并且其具有的核酸序列在SEQ ID NO :46中示出；CHR22(U2)的引物在SEQID NO 31和32中示出。对照DMR及其引物，在实施例I中被进一步讨论，并且在表6中被进一步描述。在又一实施方案中，所述试剂盒进一步包括从低甲基化DNA中物理分离高甲基化DNA的方法，其没有对在血液样品中的所述高甲基化DNA或低甲基化DNA进行化学改变或酶消化。优选的从低甲基化DNA中物理分离高甲基化DNA的方法包括免疫沉淀甲基化DNA的抗体，例如与5-甲基胞喃唳特异结合的抗体。在又一实施方案中，所述试剂盒进一步包括高甲基化DNA的扩增方法。优选的高甲基化DNA的扩增方法包括寡核苷酸连接体和/或进行连接介导的聚合酶链反应(LM-PCR)的寡核苷酸引物。V.核酸组合物在又一方面中，本发明提供在本发明所述方法和试剂盒的核酸组合物。这些核酸组合物对于检测DMR是有效的。例如，在优选的实施方案中，所述核酸组合物包括一种或多种寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物能有效扩增本发明一种或多种DMR，例如选自附录A中的列表一种或多种DMR。更优选的，所述寡核苷酸引物是“隔离的”，意思是它们是从其它具有不同(预期外的)特异性的引物中纯化出的、或分离出的，从其它具有不同。此外，所述“隔离的”寡核苷酸引物是从其它核酸中纯化出来、或者分离出来，所述核酸可能侧翼具有所述引物序列并存在于天然或原生的位置中，例如在染色体DNA中或者其它核酸的天然或原生形式中。在优选的实施方案中，本发明提供包括一种或多种隔离的寡核苷酸引物的核酸组合物，用于扩增EP1-EP12 (如在表7中描述的)的DMR，选自以下组GCTGGACCAGAAAGTGTTGAG(SEQ ID NO : I)，GTGTGCTGCTTTGCAATGTG (SEQ ID NO :2)，GGTCGAGTTTTTGGTGGTGT(SEQ ID NO :3)，CCACCGTCACTGTTCCTAGA(SEQ ID NO :4)，CCTCGTGCTCGTGTCTGTAT (SEQ ID NO 5), GAGGAAACAGCTTGGCTCTG (SEQ ID NO :6)，CTGTTGCATGAGAGCAGAGG (SEQ ID NO :7)，CGTCCCCCTCGCTACTATCT (SEQ ID NO :8)，TGCAGGATATTTGGCAAGGT(SEQ ID NO :9)，CTGTGCCGGTAGAAATGGTT(SEQ ID NO :10)，TGAATCAGTTCACCGACAGC(SEQ ID NO 11), GAAACAACCTGGCCATTCTC(SEQ ID NO :12)，·CCGTTATATGGATGCCTTGG(SEQ ID NO 13), AAACTGTTGGGCTGAACTGC (SEQ ID NO :14)，CCAGGCAAGATGGCTTATGT (SEQ ID NO 15), ACCATGCTCAGCCAATTTTT(SEQ ID NO :16)，GACCCAGACGATACCTGGAA(SEQ ID NO 17), GCTGAACAAAACTCGGCTTC(SEQ ID NO :18)，CCACATCCTGGCCATCTACT(SEQ ID NO : 19)，TTCCACAGACAGCAGAGACG (SEQ ID NO :20)，TGAGCTCACAGGTCTGGAAA (SEQ ID NO :21)，CCCCACAGGGTTCTGGTAAT(SEQ ID NO :22)，ATTCTCCACAGGGCAATGAG (SEQ ID NO :23)，TTATGTGGCCTTTCCTCCTG (SEQ ID NO: 24)，及其组
八
口 ο在又一实施方案中，本发明提供包括一种或多种隔离的寡核苷酸引物的核酸组合物(用于扩增对照高甲基化或低甲基化区域)，选自CAGGAAAGTGAAGGGAGCTG (SEQID NO 25), CAAAACCCAATGGTCAATCC(SEQ ID NO :26)，AATGATTGTGCAGGTGGTGA(SEQ IDNO 27), GAGCGCCTTGAGTAGAGGAA(SEQ ID NO :28)，AAGGTGCCCAATTCAAGGTA(SEQ ID NO:29)，CTTCCCCACCAGTCTTGAAA(SEQ ID NO :30)，TGAGAGCGGATGACAGATTG(SEQ ID NO :31)，GGTCCCTCCCTTTTCTGTCT(SEQ ID NO:32)，及其组合。VI.实施例本发明通过下文的非限制性的实施例进一步解释。本申请涉及的所有的参考文献、附录、基因库(Genbank)整体、引用的专利和公开专利申请都以它们整体通过参考的方式并入本文。实施例I :在胎盘和外周血之间差异甲基化位点的识别在这个实施例中，识别了染色体13、18、21、X和Y中的差异甲基化区域(DMR)，使用具有高分辨率的系统稱合的tiling寡核苷酸阵列(tilingoligonucleotide array)分析，能够高通量染色体范围地识别DNA甲基化模式。在这个实施例中描述的实验其描述页参见于Papageorgiou, E. A.等(2009)Am. J. Pathol. 174 :1609-1618,其全部内容,包括所有增补的数据和材料，都清禁地通过参考的方式并入本文。
材料和方法人类样品在这项研究中使用的样品是从AMS生物技术(欧洲)有限公司(牛津郡，英国)获得的。这些最初来源于所述Biochain Institute (Hayward, CA)的样品，同意使用经过伦理审查委员会(ethical Internal Review Board, I RB)核准的协议书。总共，这项研究中使用了 5份正常女性外周血样品和5份正常胎盘DNA样品。所述胎盘DNA样品的3个从早期妊娠中(怀孕的前3个月)获得，其中一个来自女性胎儿妊娠，其中两个来自男性胎儿妊娠。剩余的2个胎盘DNA样品来自后期妊娠(怀孕的后3个月)中获得，其中一个来自女性胎儿妊娠，另一个来自男性胎儿妊娠。MeDiP分析联合LM-PCR扩增 所述MeDIP 分析(Weber, Μ.等(2005)Nat. Genet. 37 :853-862)之后接着进行连接-介导的 PCR(LM-PCR)，如在 Ren，B.等(2000) Science益:2306-2309 和 Oberley,M.J.等(2005) Methods Enzvmol. 376 :315-334,中描沭的，伯是带有其它修饰。简而言之，在100 μ I总体积中的2. 5 μ gDNA最初通过超声波剪切成约300bp-1000bp大小，使用 Virsonic300sonicator (Virtis ；Gardiner, NY)。所述破碎的 DNA 在与以下物质混合后是平头末端1X NEB 缓冲剂 2(New England BioLabs ;Ipswich, UK)、IOX BSA(NewEnglandBioLabs ;Ipswich, UK)、IOOmM dNTP 混合物、T4DNA 聚合酶(3U/ μ I) (NewEnglandBioLabs ；Ipswich, UK)、以及蒸馏水达到终体积为120 μ I。在12°C孵育20分钟后，所述反应根据制造商的指导，使用所述DNA Clean和Concentrator-5 (Zymo Research Corp ；Glasgow, Scotland)清理干净。但是,所述最终的洗脱步骤在30 μ I的EB缓冲剂中进行,其由QiAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen ；ffest Sussex,UK)提供。然后将所述被清理的样品与以下物质混合40μ I的退火连接体(50 μ Μ) (SIGMA Genosys ；Gillingham, UK)(所述退火连接体的描述参见 Ren，B.等(2000) supra, Oberley, M. J.等(2004) supra)、T4DNA 连接酶IOX 缓冲剂(Roche ；Mannheim, Germany)、6μ I 的 T4DNA 连接酶(5U/ μ I) (Roche ；Mannheim,Germany)、以及蒸懼水直到终体积为101 μ I。所述样品然后在16°C孵育过夜，以允许连接上街头。所述样品的纯化使用上文描述的DNA Clean和Concentrator-5 进行。然后将所述洗脱的样品与 IOOmM dNTP 混合物、Ix PCR Gold Buffer (Roche ;Mannheim, Germany)、I. 5mM MgCl2 (Roche ；Mannheim, Germany)和 5U AmpliTaq 聚合酶混合。然后将所述样品在70°C下孵育10分钟以填充DNA突出臂，使用上文描述的DNA Clean和Concentrator-5 进行纯化。50ng的DNA被迁移和作为输入基因组对照DNA保留。所述剩余的连接的DNA样品(700ng-l. 2 μ g)经历了如上文所描述的MeDiP (Weber, Μ.等(2005) supra),所述反应按比例缩小。然后根据制造商的指导，对所述免疫沉淀的DNA样品使用所述DNA Clean和Concentrator-5 (使用700 μ I结合缓冲剂)进行清理。连接-介导的PCR(LM-PCR)使用IOng的每个输入量和免疫沉淀DNA碎片，使用Advantage-GC Genomic PCRi式剂盒(Clontech ;Saint-Germain-en_Laye,France)进行。所应用的热循环条件是95°C、2分钟，20个循环(94°C、30秒和68°C、3分钟)，以及68°C、10分钟。在PCR扩增之后,所述反应使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen ;West Sussex,UK)纯化，然后在50 μ I的蒸馏水中预热到50°C。杂交阵列
所述输入和所述免疫沉淀DNA碎片被送到Roche NimbleGen Inc (Reykjsvik,Iceland)进行杂交，所述输入和所述免疫沉淀DNA碎片来自于女性外周血DNA样品、第3期妊娠胎盘DNA样品和第I期妊娠胎盘DNA样品(两个胎盘样品都从男性胎儿妊娠获得)。所使用的阵列平台是高精度tiling寡核苷酸阵列，其对染色体13、18、21、X和Y具有特异性，其中染色体13具有225bp的平均探针间距(median probe spacing),染色体18具有170bp的平均探针间距，染色体21具有70bp的平均探针间距，染色体X具有340bp的平均探针间距，染色体Y具有20bp的平均探针间距。简而言之，每个样品的输入基因组对照DNA和免疫沉淀DNA都用荧光染料(Cy3，Cy5)差异标记，然后将其在寡核苷酸阵列上共杂交。所述原始数据在ArrayEroressftittD:// www. ebi. ac. uk/microarray-as/ae/)中取出，其登陆号(accession number)E-TABM-507。TilinR寡核苷酸阵列的数据分析
为了计算胎盘和外周血之间的相对甲基化差异，从外周血DNA中获得的所述寡核苷酸阵列标准化的Iog2的比率值(免疫沉淀对输入分数)，是从来自胎盘DNA中使用R统计计算环境(http://www. r-pro ject. orR)获得的Iog2的比率值(免疫沉淀对输入分数)中减去的。正差异代表在胎盘DNA中的相对高甲基化，负差异代表相对低甲基化。然后建立所述被减去的Iog2比率值数据(log2ratio data)的通用特征格式(General FeatureFormat, GFF)的文件，其结果使用 SignalMap viewer (NimbleGen system ；Reykjsvik,Iceland)显示，并结合染色体13、18、21、X和Y的基因、CpG岛和CG含量。基因数据从Ensembl 基因组浏览器(NCBI build36) (http://www. ensembl. orR.)下载下来，而所述CpG 岛和 CG 含量从 UCSC 基因组浏览器，(NCBI build36) (http: //Renome. ucsc. edu.)下载下来。为了对在外周血和胎盘之间的明显差异甲基化富集区域的进行自动选择，我们使用所述Smith-Waterman动态规划算法,所述Smith-Waterman动态规划算法适合于Array-CGH(Sff-ARRAY)，其先前曾被用于 CopyNumber Variation (CNV)的调用(Price,T.S.等(2005)Nucleic Acids Res. 16 :3455-3464) 这种算法被用于识别连续寡核苷酸的片段或“岛”，其显示在胎盘DNA中相对于外周血DNA的甲基化富集或甲基化缺失。每个寡核苷酸阵列数据的分析以染色臂为单位。检测在O. 2和I之间的SW-ARRAY的阈值(tj，以识别相对高分的片段或者“岛”的调用最适值，根据对至少两个连续寡核苷酸(其具有相同甲基化状态，并在从不同的阈值Utl)获得的分值中显示最高分)的识别。直接比较由SW-ARRAY识别的差异甲基化区域、基因位置、启动子区域(其被定义为在每个基因的5’端的上游2kb的区域)和CpG。同时识别所述基因组的差异甲基化区域的上述分析，其利用MeDiP作为富集方法，然后进行用于无创产前诊断的拷贝数(即用于例如三染色体21的识别)的定量分析，其选定的区域在所述胎儿内是高甲基化的，这很重要。因此，我们识别所有区域，其中所述免疫沉淀对于输入的比率在所述胎盘中是正的，在所述外周血样品中是负的(在所述胎盘中高甲基化)。对于其它被调查的其它分析系统，其要求在胎盘中有低甲基化DNA，因此我们记录所有区域(其中所述免疫沉淀对于输入的比率在所述胎盘中是负的，在所述外周血样品中是正的)。为了实现这个，从从胎盘DNA(只有这里所述比率值的标志是不同的)获得所述Iog2比率值(免疫沉淀对于输入分数)中，减去从外周血DNA获得的所述寡核苷酸阵列标准化的Iog2比率值(免疫沉淀对于输入分数)。小量在胎盘中的最大差异甲基化区域(在染色体21上的8个区域和在染色体18上的一个区域加上所述SERPINB5启动子区域)，是从这些数据中选择出来，以设置这些数据通过使用任意的大于I. O的微分比率(至少一个连续探针显示其Iog2比率值> I)进一步确定和分析其发展。TilinR寡核苷酸阵列数据通过使用实时定暈PCR的i正实在染色体21上和染色体18上选定的甲基化富集区域通过实时定量PCR证实。对于这个目的，我们使用5个女性外周血DNA样品和5个胎盘DNA样品，两者都具有第一期(妊娠前3个月)和第三期(妊娠后3个月)妊娠胎龄。使用primerf网页地址(http://frodo. wi. mit. edu/.),设计目标区域的特异性引。所述因为设计被最优化，使产物在80-150bp的长度，如同优化SYBR绿色荧光溶解曲线分析所推荐的。另外，所有引物的Tm值被选定为接近60°C。引物序列和PCR产物序列的特性通过使用Blat将其绘图到所述人类参考序列上进行确认。引物购买自Sigma Genosys (Gillingham, UK)。每种定量PCR反应在终体积为25 μ I中进行，其内伴随有20ng的免疫沉淀甲基·化DNA或者输入基因组DNA.。我们使用SYBR Green PCR master混合液(Eurogentec ;Seraing, Belgium)和 ABI Prism 7900HT 序列检测系统(Applied Biosystems)。在使用正常基因组DNA检测一系列的稀释液(150-900nM)后，选定每种引物的最初浓度。对每个选定的引物浓度，标准曲线在I : 2系列稀释(200ng下至3. 125ng)上计算，最终，所述样品反应物按一式三份进行。所述扩增程序由以下组成2分钟、50°C和10分钟、95°C，接着进行40个循环；所述每个循环包括15秒的95°C变性、以及I分钟的60°C退火/延伸。在扩增之后，溶解曲线分析通过加热所述反应混合物从60加热至95°C (以O. 2°C /s的速率)进行。扩增产物是通过琼脂糖凝胶电泳常规检验非特异性产物。为了评估在MeDiP后的靶标序列的富集，我们计算了在所述检验DNA(免疫沉淀的或输入的DNA) (Cltest)和未处理正常基因组DNA(CT_tMl)(在所述免疫沉淀的DNA对于输入的基因组DNA中)之间的计算循环差值(ACT)，(ACT = CT_tMl_CTtest)。另外，为了评估胎盘样品相对于外周血的甲基化富集，我们计算了胎盘免疫沉淀的DNA对于外周血免疫沉淀的DNA的比率值。而且，我们的寡核苷酸阵列结果表明的在外周血和胎盘DNA样品中具有相似DNA甲基化状态的对照区域，在每次跑胶中使用，以检测可能的MeDiP或者PCR扩增偏差。在单个个体之间或在技术重复试验之间的甲基化富集的变异性中间值(median variability)和重复性中间值(medianreproducibility)的获得,是通过计算所有不同检验样品或者特定区域的技术副本之间的比率值的平均值(平均的IP/INPUT)，然后每个比率值被所述平均比率值除，从而获得每次检验的重复性(其表示为百分数)(IPi/INPUTi)/mean (IPi/INPUTi, IPi i/INPUTii,...)=Ri(IPi :所述“ith”样品的免疫沉淀的，INPUTi :所述“ith”样品的输入的DNA，RI =所述“ith”样品的重复性)。所述重复性中间值(median reproducibility)通过计算所有所述不同的重复性值的中间值得到median(Ri, Riis,...)。最后,所述变异性(variability)通过使用以下公式计算(I-Ri)xlOO = Vi,以及变异性中间值(median variability)median (Vi, Vii, . . .). (Vi =所述“ith” 样品的变异性)。结果差异甲基化标记侯诜物的诜择在胎盘和外周血DNA样品中获得染色体13、18、21、X和Y标准化寡核苷酸阵列Iog2的比率值，并最初用来计算胎盘和外周血DNA之间的比例差值(相对甲基化)。我们用SW-ARRAY来识别外周血和胎盘之间的差异甲基化区域。在所有染色体中，发现的用于区域鉴定的最佳SW-ARRAY起点为O. 9。分别对于染色体21、13、18、X和Y而言，由SW-ARRAY分析确定的外周血DNA中第一孕期和第三孕期的差异甲基化区域，如附录A-E所示。我们发现，确定的高甲基化区域数目约等于所有五个染色体测定的高甲基化区域的总数目，总结见下表I。此外，第一和第三孕期胎盘的差异甲基化区域的总数是可以相比的，概括为下表I。基因位置的识别位点、启动子区、以及CpG岛位置的直接关系，显示在附录A-E中。表I :在染色体13、18、21、X和Y之间，与外周血DNA样品相比，胎盘中的差异甲基化区域。
' ------------------ - ----
HYPER.的 HYPO. 总 HYPER^ HYPO 的
CHR.*妊娠期
N°f的 N0J N0. %§%||
13 第一期 13101336 2646 49.550,5
13 第三期 13111318 2629 49.950.1
18 第一期 19671888 3855 51.048.9
18 第三期 19571944 3901 50.249.8
21 第一期 10631015 2078 51.148.8
21 第三期 10421040 2082 50.049.9
X 第一期 19921951 3943 50.549.5
X 第三期 19951989 3984 50,149.9
Y第一期 11921120 2312 51.648.4
Y笫三期 1986 1990 3976 49.950.0*染色体汴高基化区域数量；；|低基化区域数量；§高基化区域百分比；11低基化区域百分比；已识别区域的17. 5-43. 6%位于基因内部，而且在不同染色体之间以及不同的孕期内，他们的甲基化状态不同，总结如下表2。对13号和Y染色体而言，大多数差异甲基化区域(位于基因内)是在第一孕期胎盘中被低甲基化，但是大多数在第3孕期胎盘中变成高甲基化。在21号和X染色体中，大多数区域在第一和第三孕期胎盘中都为低甲基化，而在18号染色体内发现高甲基化和低甲基化的区域数目相等，总结如下表2。表2 :染色体13、18、21、X和Y内基因的差异甲基化区域。
权利要求
1.一种使用母体血液样品进行产前诊断胎儿非整倍体性的方法，所述方法包括 a)在母体血液样品中，从低甲基化DNA中物理分离高甲基化DNA，而没有使所述低甲基化DNA或高甲基化DNA进行化学改变或酶消化，以获得高甲基化DNA样品； b)在所述高甲基化DNA样品中，测定多个差异甲基化区域(DMR)的水平，以获得所述高甲基化DNA样品的闻甲基化值； c)将所述高甲基化DNA样品的所述高甲基化值与所述多个DMR的标准化参考高甲基化值进行比较；以及 d)基于所述比较诊断胎儿非整倍体性。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述母体血液样品是母体外周血样品。
3.根据权利要求I所述的方法，其中高甲基化DNA通过甲基化DNA免疫沉淀(MeDiP)从低甲基化DNA中物理分离。
4.根据权利要求I所述的方法，其中在高甲基化DNA从低甲基化DNA中物理分离之后，对所述高甲基化DNA进行扩增。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述高甲基化DNA通过连接介导的聚合酶链反应(LM-PCR)扩增。
6.根据权利要求I所述的方法，其中所述多个DMR选自附录A-E中的列表。
7.根据权利要求I所述的方法，其中对于至少3个DMR，测定所述多个DMR的水平。
8.根据权利要求I所述的方法，其中对于至少5个DMR，测定所述多个DMR的水平。
9.根据权利要求I所述的方法，其中对于至少8个DMR，测定所述多个DMR的水平。
10.根据权利要求I所述的方法，其中对于至少10个DMR，测定所述多个DMR的水平。
11.根据权利要求7-10中任意一项所述的方法，其中所述多个DMR选自附录A-E中的列表。
12.根据权利要求I所述的方法，其中在所述高甲基化DNA样品中的所述多个DMR的水平通过实时定量聚合酶链反应(Real Time QPCR)测定。
13.根据权利要求5所述的方法，其中多个DMR的水平也在总未处理的母体血液DNA样品中测定作为LM-PCR效率的对照。
14.根据权利要求I所述的方法，其中所述高甲基化DNA样品的所述高甲基化值与正常母体血液DNA样品的标准化正常参考高甲基化值进行比较，并且当所述高甲基化DNA样品的所述高甲基化值高于所述正常母体血液DNA样品的标准化正常参考高甲基化值时，进行胎儿非整倍体性的诊断。
15.根据权利要求I所述的方法，其中对于三染色体21的诊断，所述多个DMR在染色体21上。
16.根据权利要求I所述的方法，其中在染色体21上的所述多个DMR包括选自以下的3个或多个区域碱基对39279856-39280004 (SEQ ID NO 33)，碱基对44161178-44161323 (SEQ ID NO :34)，碱基对 44161239-44161371 (SEQ ID NO:35)，碱基对33320735-33320829 (SEQ ID NO :36)，碱基对 42189557-42189683 (SEQ ID NO:37)，碱基对42355712-42355815 (SEQ ID NO :38)，碱基对 42357215-42357341 (SEQ ID NO:39)，碱基对22403649-22403792 (SEQ ID NO :40)，碱基对 29136735-29136844 (SEQ ID N0:41)，碱基对32268843-32268943 (SEQ ID NO :42)，碱基对 44079235-44079322 (SEQ ID NO:43)，碱基对37841284-37841411 (SEQ ID NO :44)，及其组合。
17.根据权利要求I所述的方法，其中在染色体21上的所述多个DMR包括选自以下的8个或多个区域碱基对39279856-39280004 (SEQ ID NO 33)，碱基对44161178-44161323 (SEQ ID NO :34)，碱基对 44161239-44161371 (SEQ ID NO:35)，碱基对33320735-33320829 (SEQ ID NO :36)，碱基对 42189557-42189683 (SEQ ID NO:37)，碱基对42355712-42355815 (SEQ ID NO :38)，碱基对 42357215-42357341 (SEQ ID NO:39)，碱基对22403649-22403792 (SEQ ID NO :40)，碱基对 29136735-29136844 (SEQ ID N0:41)，碱基对32268843-32268943 (SEQ ID NO :42)，碱基对 44079235-44079322 (SEQ ID NO:43)，碱基对37841284-37841411 (SEQ ID N0:44)，及其组合。
18.根据权利要求17所述的方法，其中在染色体21上的所述多个DMR由8个具有以下核苷酸序列的区域组成碱基对33320735-33320829 (SEQ ID NO: 36)，碱基对42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，碱基对 42355712-42355815 (SEQ ID NO:38)，碱基对42357215-42357341 (SEQ ID NO :39)，碱基对 22403649-22403792 (SEQ ID N0:40)，碱基对32268843-32268943 (SEQ ID NO :42)，碱基对44079235-44079322 (SEQ ID NO :43)和碱基对37841284-37841411(SEQ ID NO :44)。
19.根据权利要求I所述的方法，其中所述多个DMR在选自以下的染色体上染色体13、染色体18、X染色体和Y染色体。
20.一种使用母体外周血样品进行三染色体21产前诊断的方法，所述方法包括 a)在母体外周血样品中，从低甲基化DNA中物理分离高甲基化DNA，而没有使所述低甲基化DNA或高甲基化DNA进行化学改变或酶消化，以获得高甲基化DNA样品； b)在所述高甲基化DNA样品中，测定在染色体21上的多个差异甲基化区域(DMR)的水平，以获得所述闻甲基化DNA样品的闻甲基化值， 其中，在染色体21上的所述多个DMR包括选自以下的8个或多个区域碱基对39279856-39280004 (SEQ ID NO :33)，碱基对 44161178-44161323 (SEQ ID NO:34)，碱基对44161239-44161371 (SEQ ID NO :35)，碱基对 33320735-33320829 (SEQ ID NO:36)，碱基对42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，碱基对 42355712-42355815 (SEQ ID NO:38)，碱基对 42357215-42357341 (SEQ ID NO :39)，碱基对 22403649-22403792 (SEQ ID N0:40)，碱基对 29136735-29136844 (SEQ ID NO :41)，碱基对 32268843-32268943 (SEQ ID NO:42)，碱基对 44079235-44079322 (SEQ ID NO :43)，碱基对 37841284-37841411 (SEQ ID N0:44)，及其组合，以及 其中，所述多个DMR的水平通过实时定量聚合酶链反应(Real Time QPCR)测定； c)将所述高甲基化DNA样品的所述高甲基化值与染色体21上的所述多个DMR的标准化正常参考高甲基化值进行比较；以及 d)基于所述比较诊断三染色体21。
21.根据权利要求20所述的方法，其中高甲基化DNA通过甲基化DNA免疫沉淀(MeDiP)从低甲基化DNA物理分离。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，在对高甲基化DNA从低甲基化DNA中物理分离之后，对所述高甲基化DNA进行扩增。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述高甲基化DNA通过连接介导的聚合酶链反应(LM-PCR)扩增。
24.根据权利要求20所述的方法，其中多个DMR的水平也在总未处理母体血液DNA样品中测定作为LM-PCR效率的对照。
25.根据权利要求20所述的方法，其中所述高甲基化DNA样品的所述高甲基化值与正常母体血液DNA样品的标准化正常参考高甲基化值进行比较，并且当所述高甲基化DNA样品的所述闻甲基化值闻于所述正常母体血液DNA样品的标准化正常参考闻甲基化值时，进行三染色体21的诊断。
26.根据权利要求20所述的方法，其中在染色体21上的所述多个DMR由8个具有以下核苷酸序列的区域组成碱基对33320735-33320829 (SEQ ID NO: 36)，碱基对42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，碱基对 42355712-42355815 (SEQ ID NO:38)，碱基对42357215-42357341 (SEQ ID NO :39)，碱基对 22403649-22403792 (SEQ ID N0:40)，碱基对32268843-32268943 (SEQ ID NO :42)，碱基对44079235-44079322 (SEQ ID NO :43)和碱基对37841284-37841411(SEQ ID NO :44)。
27.一种适用于诊断胎儿非整倍体性的识别目标染色体上差异甲基化区域(DMR)的方法，所述方法包括 a)提供 (i)正常成年女性外周血DNA样品(PB样品)；和 ( )正常胎盘DNA样品(PL样品)； b)在a)的每个样品中，从低甲基化DNA中物理分离高甲基化DNA，而没有使所述高甲基化DNA或低甲基化DNA进行化学改变或酶消化，以获得 ⑴分离的PB样品；和 (iii)分离的PL样品； c)在b)的每个分离样品中，测定目标染色体上多个区域的水平；以及 d)选择在所述分离的PB样品中低甲基化的区域和在所述分离的PL样品中高甲基化的区域，从而识别所述目标染色体上的差异甲基化区域(DMR)。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述PL样品包括两种不同的样品-早期妊娠PL样品和晚期妊娠PL样品，其中步骤d)进一步包括选择在所述早期妊娠分离的PL样品和所述晚期妊娠分离的PL样品中具有相等程度的甲基化的区域。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述目标染色体是染色体21。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述目标染色体选自染色体13、染色体18、X染色体和Y染色体。
31.根据权利要求27所述的方法，其中所述非整倍体性是三染色体性或者单染色体性。
32.—种三染色体21的产前诊断试剂盒，所述试剂盒包括 a)一种或多种核酸组合物，其用以测定在染色体21上的多个差异甲基化区域(DMR)的水平；以及 b)使用这种核酸组合物进行染色体21的产前诊断的说明书。
33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中在染色体21上的所述多个DMR选自在附录A-E中的列表。
34.根据权利要求32所述的试剂盒，其中在染色体21上的所述多个DMR包括选自以下的3个或多个区域碱基对39279856-39280004 (SEQ ID NO 33)，碱基对44161178-44161323 (SEQ ID NO :34)，碱基对 44161239-44161371 (SEQ ID NO:35)，碱基对33320735-33320829 (SEQ ID NO :36)，碱基对 42189557-42189683 (SEQ ID NO:37)，碱基对42355712-42355815 (SEQ ID NO :38)，碱基对 42357215-42357341 (SEQ ID NO:39)，碱基对22403649-22403792 (SEQ ID NO :40)，碱基对 29136735-29136844 (SEQ ID N0:41)，碱基对32268843-32268943 (SEQ ID NO :42)，碱基对 44079235-44079322 (SEQ ID NO:43)，碱基对37841284-37841411 (SEQ ID N0:44)，及其组合。
35.根据权利要求3 2所述的试剂盒，其中在染色体21上的所述多个DMR包括选自以下的8个或多个区域碱基对39279856-39280004 (SEQ ID NO 33)，碱基对44161178-44161323 (SEQ ID NO :34)，碱基对 44161239-44161371 (SEQ ID NO:35)，碱基对33320735-33320829 (SEQ ID NO :36)，碱基对 42189557-42189683 (SEQ ID NO:37)，碱基对42355712-42355815 (SEQ ID NO :38)，碱基对 42357215-42357341 (SEQ ID NO:39)，碱基对22403649-22403792 (SEQ ID NO :40)，碱基对 29136735-29136844 (SEQ ID N0:41)，碱基对32268843-32268943 (SEQ ID NO :42)，碱基对 44079235-44079322 (SEQ ID NO:43)，碱基对37841284-37841411 (SEQ ID N0:44)，及其组合。
36.根据权利要求32所述的试剂盒，其中在染色体21上的所述多个DMR由8个具有以下核苷酸序列的区域组成碱基对33320735-33320829(SEQ ID NO :36)，碱基对42189557-42189683 (SEQ ID NO :37)，碱基对 42355712-42355815 (SEQ ID NO:38)，碱基对42357215-42357341 (SEQ ID NO :39)，碱基对 22403649-22403792 (SEQ ID N0:40)，碱基对32268843-32268943 (SEQ ID NO :42)，碱基对44079235-44079322 (SEQ ID NO :43)和碱基对37841284-37841411(SEQ ID NO :44)。
37.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述核酸组合物包含选自以下的一种或多种寡核苷酸引物 GCTGGACCAGMAGTGTTGAG (SEQ ID NO I), GTGTGCTGCTTTGCMTGTG (SEQ ID NO 2), GGTCGAGTTTTTGGTGGTGT (SEQ ID NO 3), CCACCGTCACTGTTCCTAGA (SEQ ID NO:4)，CCTCGTGCTCGTGTCTGTAT (SEQ ID NO 5), GAGGAAACAGCTTGGCTCTG (SEQ ID NO:6)，CTGTTGCATGAGAGCAGAGG (SEQ ID NO 7), CGTCCCCCTCGCTACTATCT (SEQ ID NO:8)，TGCAGGATATTTGGCAAGGT (SEQ ID NO 9), CTGTGCCGGTAGAAATGGTT (SEQ ID NO 10)，TGAATCAGTTCACCGACAGC (SEQ ID NO 11), GAAACAACCTGGCCATTCTC (SEQ IDNO 12),CCGTTATATGGATGCCTTGG (SEQ ID NO 13),AAACTGTTGGGCTGAACTGC (SEQ IDNO 14),CCAGGCAAGATGGCTTATGT (SEQ ID NO 15),ACCATGCTCAGCCAATTTTT (SEQ IDNO 16),GACCCAGACGATACCTGGAA (SEQ ID NO 17),GCTGAACAAAACTCGGCTTC (SEQ IDNO 18),CCACATCCTGGCCATCTACT (SEQ ID NO 19),TTCCACAGACAGCAGAGACG (SEQ IDNO 20),TGAGCTCACAGGTCTGGAAA (SEQ ID NO 21),CCCCACAGGGTTCTGGTAAT (SEQ IDNO 22),ATTCTCCACAGGGCAATGAG (SEQ ID NO 23),TTATGTGGCCTTTCCTCCTG(SEQ ID NO 24)，及其组合。
38.根据权利要求32所述的试剂盒，其进一步包括这样的构件，该构件用于在血液样品中从低甲基化DNA中物理分离高甲基化DNA，而没有使所述高甲基化DNA或低甲基化DNA进行化学改变或酶消化。
39.根据权利要求38所述的试剂盒，其中使所述从低甲基化DNA中物理分离高甲基化DNA的构件包括免疫沉淀甲基化DNA的抗体。
40.根据权利要求38所述的试剂盒，其进一步包括用于扩增高甲基化DNA的构件。
41.根据权利要求40所述的试剂盒，其中用于扩增所述高甲基化DNA的构件包括执行连接介导的聚合酶链反应(LM-PCR)的寡核苷酸连接体或者寡核苷酸引物。
42.—种核酸组合物,包含选自以下的一种或多种分离的寡核苷酸引物 GCTGGACCAGMAGTGTTGAG (SEQ ID NO I), GTGTGCTGCTTTGCMTGTG (SEQ ID NO 2), GGTCGAGTTTTTGGTGGTGT (SEQ ID NO 3), CCACCGTCACTGTTCCTAGA (SEQ ID NO:4)，CCTCGTGCTCGTGTCTGTAT (SEQ ID NO 5), GAGGAAACAGCTTGGCTCTG (SEQ ID NO:6)，CTGTTGCATGAGAGCAGAGG (SEQ ID NO 7), CGTCCCCCTCGCTACTATCT (SEQ ID NO:8)，TGCAGGATATTTGGCAAGGT (SEQ ID NO 9), CTGTGCCGGTAGAAATGGTT (SEQ ID NO 10)，TGAATCAGTTCACCGACAGC (SEQ ID NO : 11)，GAAACAACCTGGCCATTCTC (SEQ IDNO 12),CCGTTATATGGATGCCTTGG (SEQ ID NO 13),AAACTGTTGGGCTGAACTGC (SEQ IDNO 14),CCAGGCAAGATGGCTTATGT (SEQ ID NO 15),ACCATGCTCAGCCAATTTTT (SEQ IDNO 16),GACCCAGACGATACCTGGAA (SEQ ID NO 17),GCTGAACAAAACTCGGCTTC (SEQ IDNO 18),CCACATCCTGGCCATCTACT (SEQ ID NO 19),TTCCACAGACAGCAGAGACG (SEQ IDNO 20),TGAGCTCACAGGTCTGGAAA (SEQ ID NO 21),CCCCACAGGGTTCTGGTAAT (SEQ IDNO 22),ATTCTCCACAGGGCAATGAG (SEQ ID NO :23)，TTATGTGGCCTTTCCTCCTG(SEQ ID NO 24)，及其组合。
全文摘要
本发明提供胎儿非整倍体性无创产前诊断的方法和组合物。识别了多种差异甲基化区域(DMR)。某些所述的DMR在成人女性血液DNA中低甲基化，在胎儿DNA中高甲基化；而其它的在成年女性血液DNA高甲基化，在胎儿DNA低甲基化。此外，在成人女性血液DNA中低甲基化并且在胎儿DNA中高甲基化的DMR，已经表明，以精确预测存在于妊娠期母体血液样品中胎儿DNA的非整倍体性。在本发明的方法中，高甲基化DNA优选通过甲基化DNA免疫沉淀从低甲基化DNA中物理分离。
文档编号C12Q1/68GK102892899SQ201180009757
公开日2013年1月23日 申请日期2011年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者P·C·帕特萨里斯, E·A·帕帕乔治乌 申请人:Nipd遗传学有限公司