专利名称：用于检测抗天然人白细胞抗原抗体的组合物和方法
用于检测抗天然人白细胞抗原抗体的组合物和方法I.相关申请的交叉引用本申请要求美国临时申请号61/338，258的优先权，其全部内容整体參考并入本文。
2.发明领域本披露提供的组合物和方法一般涉及组合物，例如用于检测抗天然人白细胞抗原(HLA)的抗体的组合物，及其制备方法。
3.
背景技术：
人白细胞抗原(Human leukocyte antigens, HLA)能够结合并展示人细胞表面的 抗原至效应T细胞。两类主要的HLA，I类和II类HLA，既提呈异体抗原也提呈天然抗原。
I类HLA可以结合并提呈细胞内产生的肽抗原，包括病毒和肿瘤特异性蛋白，至⑶8+效应T细胞(例如，细胞毒性T细胞(Cytotoxic T cells, CTL))。在应对由含有I类HLA的细胞提呈的异体抗原吋，CD8+效应T细胞能够破坏提呈异体抗原的细胞。II类HLA能够结合并提呈细胞外来源的肽抗原至CD4+T细胞(例如，辅助T细胞)。在应对由含有II类HLA的细胞提呈的异体抗原吋，CD4+效应T细胞能够支持体液免疫应答。HLA被认为在某些癌症和自身免疫性疾病以及移植物排斥中发挥作用。HLA抗体通常由输血、妊娠或移植导致的同种免疫产生。其也见于非同种免疫的个体。Morales-Buenrostro 等，Transplantation 86:1111-15(2008)。有研究显不在移植受体中发现的HLA抗体是导致急性和慢性移植物排斥的ー个原因。因此，确定受体中是否携带了抗供体HLA的抗体对确定受体中移植物排斥的风险可能是重要的。迄今为止，与HLA连接的底物一直用于HLA抗体的检测。将来自受体的样品与底物接触，随后采用常规技术检测抗体与底物的結合。然而，常规底物通常与天然和变性HLA均连接。因此，这些底物在区分天然HLA抗体和变性HLA抗体的能力方面受到了限制。在某些情况下，抗天然HLA抗体而非抗变性HLA抗体对移植失败具有预测性。Cai等，Transplantation 88 (2) : 226-31 (2009)。因此需要这样的组合物和方法，其能够检测抗天然HLA抗体同时又不受抗变性HLA抗体的干扰。此类组合物和方法可以用于防止潜在供体因假阳性信号而被排除，例如，当产生上述假阳性信号时，在受体中筛选抗供体HLA抗体时检测到的其实是抗变性HLA的抗体。4.发明概述本披露提供了例如能够检测抗天然HLA抗体的组合物和方法。在第一个方面，本披露提供了ー种包含天然和变性HLA的组合物，其中天然HLA的量较多。在某些实施方式中，至少90%的HLA是天然的，并且至多10%的HLA是变性的。在某些实施方式中，至少95%的HLA是天然的，并且至多5%的HLA是变性的。在某些实施方式中，至少99%的HLA是天然的，并且至多1%的HLA是变性的。在某些实施方式中，天然和变性HLA选自I类HLA、II类HLA及其组合。在某些实施方式中，HLA是I类HLA。在某些实施方式中，HLA是II类HLA。在某些实施方式中，HLA是I类和II类HLA的组合。天然和变性HLA可以属于相同的等位基因或两个或多个不同的等位基因。在某些实施方式中，至少90%的HLA属于相同的等位基因。在某些实施方式中，至少95%的HLA属于相同的等位基因。在其它实施方式中，至少99%的HLA属于相同的等位基因。在某些实施方式中，天然和变性HLA连接至固体底物。可以通过本领域技术人员公知的任意技术将HLA与固体底物连接。在某些实施方式中，HLA与固体底物直接连接。在其它实施方式中，HLA与固体底物间接连接。固体底物可以由本领域技术人员公知的任意适宜材料制备。在某些实施方式中，固体底物包含选自二氧化硅、金、乳胶、聚苯乙烯、聚乙烯、聚砜、水凝胶、聚氯乙烯、玻璃及其组合的材料。此外，固体底物的形式可以是本领域技术人员认为适宜的任意形式。在某些实施方式中，固体底物选自数个珠子、数个微珠、数个微粒、数个微球、孔、膜、聚合物、滤片和微 阵列及其组合。在某些实施方式中，固体底物是数个微珠。在某些实施方式中，固体底物包含一个可检测标记。在某些实施方式中，可检测标记包含荧光染料、放射性标记、磁标记或条码。在某些实施方式中，可检测标记是荧光染料。另一方面，本披露提供了包含数个固体底物的嵌板，其中数个固体底物中的每个各自与HLA连接，其中连接的HLA中的至少90%是天然的，并且至多10%的HLA是变性的，其中与数个特定固体底物连接的HLA中的至少90%属于相同的等位基因，并且其中数个固体底物中的每个各自连接于与于其余数个固体底物不同的HLA。在某些实施方式中，HLA包含选自I类HLA、II类HLA及其组合的HLA。在某些实施方式中，数个包含4个固体底物、8个固体底物、16个固体底物或32个固体底物。另一方面，本披露提供了制备组合物的方法，所述组合物包含至少90%天然HLA和至多10%变性HLA。该方法包括a)将包含天然和变性HLA的第一组合物在丝氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶消化变性HLA的条件下，与所述丝氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶接触；以及b)中和所述丝氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶，以产生产物组合物，所述产物组合物包含至少90%天然HLA和至多10%变性HLA。在某些实施方式中，HLA悬浮于溶液中。在某些实施方式中，HLA与一个或多个固体底物连接。在特定实施方式中，HLA与数个微珠或微粒连接。在所述方法的某些实施方式中，HLA与丝氨酸蛋白酶接触。在特定实施方式中，丝氨酸蛋白酶是胰酶。在某些实施方式中，HLA与脂肪酶接触。在特定实施方式中，脂肪酶是磷脂酶。在某些实施方式中，HLA与酯酶接触。在特定实施方式中，酯酶是乙酰胆碱酯酶。在其它实施方式中，酯酶是硫酯酶。在某些实施方式中，HLA与酰胺酶接触。另一方面，本披露提供了筛选抗天然HLA抗体的方法。该方法包括以下步骤a)将样品与组合物接触，其中组合物包含与固体底物连接的HLA，其中至少90%的HLA是天然的，且至多10%的HLA是变性的；以及b)检测抗体与组合物的结合，其中抗体与组合物的结合表明存在抗天然HLA抗体。在某些实施方式中，样品是生物样品。在某些实施方式中，样品来自于人类受试者。在某些实施方式中，样品来自于人类受试者的血液样品。抗体与组合物结合的检测可以通过本领域技术人员公知的任意技术进行。在某些实施方式中，采用流式细胞术检测抗体的结合。在某些实施方式中，采用ニ抗检测抗体的结合。在特定实施方式中，ニ抗包含选自放射性标记、荧光标记、酶标记、亲和素标记、生物素标记及其组合的标记。另ー方面，本披露提供了检测抗天然HLA抗体的试剂盒。这些试剂盒包括a)包含与固体底物连接的HLA的组合物，其中至少90%的HLA是天然的，且至多10%的HLA是变性的，以及b)检测抗体与组合物结合的试剂。在某些实施方式中，试剂包括ニ杭。在某些实施方式中，ニ抗包含可检测标记，其选自放射性标记、荧光标记、酶标记、亲和素标记、生物素标记及其组合。本披露提供的组合物和方法可以方便地检测抗天然HLA的抗体，同时不会对抗变性HLA的抗体进行检測。对天然HLA具有特异性的抗体的检测在某些情况下是有用的，例如，当存在天然而非变性HLA的抗体吋，HLA能预示移植失败。在这些情况下，本披露提供的组合物和方法有助于防止潜在供体由于假阳性信号而被排除，所述假阳性信号产生于受体中抗变性HLA抗体的检测。 5.
图1A-1C提供的图描述了天然I类HLA (W6/32)和变性I类HLA (HClO)的特异性抗体与A-基因座(图1A)、B-基因座(图1B)和C-基因座(图1C) I类HLA的LABScreen单抗原小球(LSAB)的反应。其证实W6/32和HClO均与LSAB反应。图2A-2C提供的图描述了 W6/32和HClO与A-基因座(图2A)、B-基因座(图2B)和C-基因座(图2C) I类HLA的组合物(“天然小珠”)的反应。在这些研究中使用的底物是微珠。这些图证实了与LSAB相比HClO与组合物的反应活性较低。图3A-3C提供的图描述了三个非同种免疫的雄性血清与A-基因座(图3A)、B-基因座(图3B)和C-基因座(图3C)HLA等位基因的LSAB和组合物(“天然小珠”)的反应。在这些研究中使用的底物是微珠。这些图证实了与LSAB相比组合物具有更好的准确度。6.对具体实施方式
的详细说明6. I 定义如本申请所使用的术语“天然”、“天然人白细胞抗原”和“天然HLA”指HLA或其片段，其HLA细胞外部分保持了 HLA在天然状态下的结构和抗原性质。如本申请所使用的术语“天然I类人白细胞抗原”和“天然I类HLA”指I类人白细胞抗原或其片段，其保持了 I类HLA细胞外部分在其天然状态下的结构和抗原完整性，包括包含与重链或重链片段非共价结合的￠2微球蛋白结构域。在某些实施方式中，天然I类 HLA 能够与 W6/32 和 BIH 抗体(One Lambda, Inc.)结合。如本申请所使用的术语“天然II类人白细胞抗原”和“天然II类HLA”指II类人白细胞抗原或其片段，其保持了 II类HLA细胞外部分在其天然状态下的结构和抗原完整性，其包括包含异ニ聚体，所述异ニ聚体包含彼此非共价结合的两条糖基化多肽链。在某些实施方式中，天然II类HLA能够与HB-145 (针对HLA-DP、HLA-DQ, HLA-DR)和HB-180 (针对HLA-DQ和HLA DR)抗体(美国模式培养物保藏中心(ATCC))结合。如本申请所使用的术语“变性的”、“变性人白细胞抗原”和“变性HLA”指包含具有非天然构型的细胞外结构域的HLA。
如本申请所使用的术语“变性I类人白细胞抗原”和“变性I类HLA”指缺乏3 2微球蛋白结构域的I类人白细胞抗原或其片段。在某些实施方式中，变性I类HLA能够与HClO (One Lambda, Inc.)和 HB296 (ATCC)抗体结合。如本申请所使用的术语“变性II类人白细胞抗原”和“变性II类HLA”指单体构型的II类人白细胞抗原或其片段。在某些实施方式中，变性II类HLA能够与HB-298 (针对HLA-DR的a链)抗体(ATCC)结合。如本申请所使用的术语“固体底物”指能够与HLA结合的任意固体底物并且其与本披露所提供的方法具有相容性。固体底物的例子包括数 个珠子、数个微珠、数个微粒、数个微球、孔、膜、聚合物、滤片和微阵列及其组合。如本申请所使用的术语“相同HLA等位基因”指具有相似结构和抗原性质的两个或多个HLA分子或其片段，并且其来自相同的HLA基因座和等位基因。如本申请所使用的术语“不同的HLA等位基因”指具有不同结构和抗原性质的HLA分子或其片段，并且其来自不同的HLA基因座和等位基因。6. 2检测抗天然HLA抗体的组合物本披露提供了一种包括至少90%天然HLA和至多10%变性HLA的组合物。在某些实施方式中，组合物可以用于检测抗天然HLA的抗体。抗天然HLA抗体的检测可用于，例如，确定移植物排斥的可能性。在某些实施方式中，组合物还可用于开发HLA疫苗和效应T细胞结合实验。可以使用本领域技术人员认为适宜的任意技术制备该组合物，包括本披露中所描述的方法。组合物的各个成分将在下文中进一步详细讨论。6. 2. I.天然 HLA在某些实施方式中，本披露提供的组合物包括至少90%天然HLA和至多10%变性HLA。在某些实施方式中，HLA与固体支持物连接。在其它实施方式中，HLA在溶液中。天然I类HLA是57kDa的糖蛋白，其存在于大多数有核的人细胞中。天然I类HLA一般包含45kDa的多肽重链，其与包含12kDa P 2微球蛋白结构域的轻链结合。在某些实施方式中，重链与轻链非共价结合。重链一般包含三个a亚基，跨膜结构域和胞质尾区。a I和a 2亚基形成结合槽，供肽配体结合。相反地，变性I类HLA缺乏￠2微球蛋白结构域。I类HLA的重链由三个主要基因(HLA-A、HLA-B和HLA-C)之一或三个次要基因(HLA-E,HLA-F和HLA-G)之一编码。在这些基因座之间的等位变体使得I类HLA呈现出多态性。可以通过表达I类HLA的基因座和特定等位基因对特定I类HLA进行分类。示例性的I类HLA等位基因列于表I (HLA-A等位基因)、表2 (HLA-B等位基因)和表3 (HLA-C等位基因)。天然II类HLA是多态的61kDa异二聚体蛋白，其存在于特定抗原提呈细胞(例如，B淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞)的表面。II类HLA分为三个亚类HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR0天然II类HLA通常包括彼此相连的a链和0链。在某些实施方式中，a链和^链彼此非共价结合。相反地，变性II类HLA是单体蛋白。II类HLA的各条链均包含细胞外结构域、跨膜结构域和胞质尾区。共有六个主要 II 类 HLA 基因(HLA-DPAI、HLA-PBU HLA-DQAU HLA-DQBU HLA-DRA 和 HLADRB1)，各基因编码a或0链。与I类HLA基因类似，各II类HLA基因包含多个等位基因。I类和II类HLA可以由本领域技术人员公知的任意技术制备,包括如Pei等，Transplantation75(1) :43-49(2003)中所描述的重组DNA技术。在某些实施方式中，组合物包含大量天然HLA。在某些实施方式中，至少90%的HLA是天然的，并且至多10%的HLA是变性的。在某些实施方式中，至少95%的HLA是天然的，并且至多5%的HLA是变性的。在某些实施方式中，至少99%的HLA是天然的，并且至多1%的HLA是变性的。在某些实施方式中，至少99. 5%的HLA是天然的，并且至多0. 5%的HLA是变性的。制备这些组合物的技术如下文所述。在某些实施方式中，组合物包含选自I类HLA、II类HLA及其组合。在某些实施方式中，组合物包含I类HLA。在某些实施方式中，组合物包含II类HLA。在某些实施方式中，组合物包含I类和II类HLA的组合。组合物包含全长天然HLA或其片段。在某些实施方式中，组合物包含全长天然I类HLA，各I类HLA包含与￠2微球蛋白链非共价结合的重链。在某些实施方式中，组合物 包含全长II类HLA，各II类HLA包含与P链非共价结合的a链。在某些实施方式中，各HLA包含的修饰如删除、添加或氨基酸取代，其不会破坏天然HLA细胞外结构域的结构和抗原的完整性。在某些实施方式中，各HLA是I类HLA，其包含天然I类HLA的细胞外结构域。在某些实施方式中，各HLA是I类HLA，其包含天然I类HLA的细胞外结构域和跨膜结构域片段。在某些实施方式中，各HLA是I类HLA，其包含天然I类HLA的细胞外结构域和跨膜结构域。在某些实施方式中，各HLA是I类HLA，其包含天然I类HLA的细胞外结构域、跨膜结构域和胞质尾区片段。在某些实施方式中，各HLA是II类HLA，其包含天然II类HLA的细胞外结构域。在某些实施方式中，各HLA是II类HLA，其包含天然II类HLA的细胞外结构域和跨膜结构域片段。在某些实施方式中，各HLA是II类HLA，其包含天然II类HLA的细胞外结构域和跨膜结构域。在某些实施方式中，各HLA是II类HLA，其包含天然II类HLA的细胞外结构域、跨膜结构域和胞质尾区片段。本披露提供的组合物可以包含相同等位基因或两个或多个不同等位基因的HLA。相同等位基因的HLA具有相同的结构和抗原性质，并且来自相同的HLA基因座和等位基因。
在某些实施方式中，至少90%的HLA属于相同的等位基因。在某些实施方式中，至少95%的HLA属于相同的等位基因。在其它实施方式中，至少99%的HLA属于相同的等位基因。在某些实施方式中，至少90%的HLA属于相同的等位基因并且包含HLA-AI类HLA。在某些实施方式中，至少90%的HLA属于相同的等位基因并且包含表I列出的HLA-AI类HLA。在某些实施方式中，至少90%的HLA属于相同的等位基因并且包含HLA-BI类HLA。在某些实施方式中，至少90%的HLA属于相同的等位基因并且包含表2列出的HLA-BI类HLA。在某些实施方式中，至少90%的HLA属于相同的等位基因并且包含HLA-CI类HLA。在某些实施方式中，至少90%的HLA属于相同的等位基因并且包含表3列出的HLA-CI类HLA。在某些实施方式中，至少90%的HLA属于相同的等位基因并且包含HLA-DP II类HLA0在某些实施方式中，至少90%的HLA属于相同的等位基因并且包含HLA-DQ II类HLA。在某些实施方式中，至少90%的HLA属于相同的等位基因并且包含HLA-DR II类HLA。6.2.2.固体底物
在某些实施方式中，本披露提供的HLA与固体底物连接。天然HLA连接至固体底物使得组合物能与抗天然HLA抗体结合。可以采用本领域技术人员公知的任意技术对已结合的抗天然HLA的抗体进行检测。在某些实施方式中，大量连接至固体底物的HLA是天然的。如本申请所使用的，“大量”可以是允许抗体结合并检测天然HLA抗体，同时抗体与变性HLA不会产生显著结合的量。该量可以表示为天然HLA的总量占连接至固体底物HLA总量的百分率。在某些实施方式中，至少75%的HLA是天然的。在某些实施方式中，至少80%的HLA是天然的。在某些实施方式中，至少85%的HLA是天然的。在某些实施方式中，至少90%的HLA是天然的。在某些实施方式中，至少95%的HLA是天然的。在某些实施方式中，至少99%的HLA是天然的。在某些实施方式中，至少99. 5%的HLA是天然的。HLA可以通过本领域技术人员公知的任意技术与固体底物连接。进一步地,HLA可以直接或间接地与固体底物连接。在某些实施方式中，HLA可以直接与固体底物连接。在某些实施方式中，HLA通过吸附、化学偶联或通过与HLA上添加的尾部元件形成的化学键 与固体底物直接连接。在某些实施方式中，HLA通过被动吸附与底物直接连接。Cantarero等，Anal. Biochem.，105:373-382(1980)。在某些实施方式中，HLA通过连接基团间接与固体底物连接。在某些实施方式中，连接基团选自抗体、凝集素、CD8分子、CD4分子、T细胞受体及其片段。在某些实施方式中，连接基团是双功能交联剂。有用的双功能交联剂是本领域技术人员公知的。固体底物可以由本领域技术人员公知的能够连接至HLA的任意材料制备。公知的固体底物材料包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和修饰纤维素、聚丙烯酰胺、聚砜、水凝胶、聚乙烯和磁铁矿。在某些实施方式中，固体底物包括选自二氧化硅、金、乳胶、聚苯乙烯、聚乙烯、聚砜、水凝胶、聚氯乙烯、玻璃及其组合的材料。进一步地，固体底物可以具有本领域技术人员认为适宜的任意结构构型。固体底物可以包含数个珠子、数个微珠、数个微粒、数个微球、孔、膜、聚合物、滤片和微阵列及其组
口 o在某些实施方式中，固体底物是数个微珠。有用的微珠可以从例如Luminex, Inc.、Invitrogen Corp. > Polysciences, Inc.和 Bangs Laboratories, Inc.购买获得。在某些实施方式中，微珠的直径为2至8 ii m。在某些实施方式中，微珠的直径为4至6 ii m。在某些实施方式中，固体底物是数个微粒。在某些实施方式中，微粒是纳米晶体或
量子点。固体底物还可以包括可检测标记或任意其它的鉴别特征，使得能够对与HLA结合的抗体进行鉴别、分离和分类。例如，底物可以是数个微珠，每个均标记有可用流式细胞术对微珠进行分选的荧光团。可检测标记可以包括荧光染料、放射性标记、磁标记、条码及其组合。在某些实施方式中，可检测标记是荧光染料。在某些实施方式中，可检测标记是放射性标记。在某些实施方式中，可检测标记是条码。在某些实施方式中，底物包含选自荧光染料、放射性标记、磁标记、条码及其组合的可检测标记。6. 3 嵌板另一方面，本披露提供了包含数个固体底物的嵌板，其中数个固体底物中的每个均与HLA连接，其中至少90%连接的HLA是天然的且至多10%的HLA是变性的，其中连接至数个特定固体底物的HLA中的至少90%属于相同的等位基因，且其中数个固体底物中的每个各自连接于与其余数个固体底物不同的HLA。嵌板可以与本披露所提供的任意HLA连接。嵌板的优点为允许同时检测针对一个或多个天然I类HLA的多个抗体。在某些实施方式中，数个包含至少2个或更多固体底物。在某些实施方式中，数个包含至少4个或更多固体底物。在某些实施方式中，数个包含至少8个或更多固体底物。在某些实施方式中，数个包含至少16个或更多固体底物。在某些实施方式中，数个包含至少32个或更多固体底物。在某些实施方式中，数个包含至少64个或更多固体底物。在某些实施方式中，数个包含至少128个或更多固体底物。在某些实施方式中，数个包含至少256个或更多固体底物。在某些实施方式中，数个固体底物中的每个各自与HLA-A I类HLA连接。在某些实施方式中，数个固体底物中的每个各自与HLA-B I类HLA连接。在某些实施方式中，数个固体底物中的每个各自与HLA-CI类HLA连接。在某些实施方式中，数个固体底物中的每个各自与选自表1、2和3及其组合所示的I类HLA中的任意I类HLA连接。
在某些实施方式中，数个固体底物中的每个各自与HLA-DP II类HLA连接。在某些实施方式中，数个固体底物中的每个各自与HLA-DQ II类HLA连接。在某些实施方式中，数个固体底物中的每个各自与HLA-DR II类HLA连接。在某些实施方式中，嵌板包含数个与HLA连接的底物，所述HLA选自HLA-A、HLA_B、HLA-C、HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR 及其组合。在某些实施方式中，连接至特定固体底物的HLA中至少90%属于相同的等位基因。在某些实施方式中，连接至特定固体底物的HLA中至少95%属于相同的等位基因。在某些实施方式中，连接至特定固体底物的HLA中至少99%属于相同的等位基因。在某些实施方式中，连接至特定固体底物的HLA中至少99. 5%属于相同的等位基因。6. 4制备用于检测抗天然HLA抗体的组合物的方法另一方面，本披露提供了制备组合物的方法，所述组合物包含至少90%天然人白细胞抗原和至多10%变性人白细胞抗原。在某些实施方式中，该方法包括a)包含天然和变性HLA的第一组合物在丝氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶消化变性HLA的条件下，与所述丝氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶接触；以及b)中和所述丝氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶以产生产物组合物，所述产物组合物包含至少90%天然人白细胞抗原和至多10%白细胞抗原。该方法可以用于制备本披露提供的包含至少90%天然HLA和至多10%变性HLA的任意组合物。6. 4. I.天然和变性HLA的组合物第一组合物的HLA可以包含一种或多种类型的HLA。在某些实施方式中，HLA包含选自I类HLA、II类HLA及其组合。在某些实施方式中，HLA包含I类HLA。在某些实施方式中，HLA包含II类HLA。在某些实施方式中，HLA包含I类和II类HLA的组合。在某些实施方式中，第一组合物的HLA可以在溶液中。在其它实施方式中，HLA附着于固体底物上。在某些实施方式中，第一组合物的HLA悬浮于溶液中。HLA可以悬浮于或溶于本领域技术人员认为适宜的任意溶液中。在某些实施方式中，溶液是缓冲溶液。在某些实施方式中，溶液包含添加剂，其有助于阻止HLA非特异性降解但能使变性HLA特异性裂解。此类添加剂的例子包括蛋白酶抑制剂、抗菌剂、金属螯合剂和还原剂。在某些实施方式中，HLA在包含磷酸盐缓冲液(PBS)的溶液中。在某些实施方式中，HLA在包含金属螯合剂的溶液中。在某些实施方式中，金属螯合剂是こニ胺四こ酸(EDTA)0在某些实施方式中，HLA在包含抗菌剂的溶液中。在某些实施方式中，抗菌剂是叠氮钠。在某些实施方式中，抗菌剂是硫柳汞。在某些实施方式中，HLA在包含还原剂的溶液中。在某些实施方式中，还原剂是ニ硫苏糖醇(DTT)。在某些实施方式中，还原剂是2-巯基こ醇(2-ME)。进ー步地，在某些实施方式中，溶液中可以包含有助于阻止天然和变性HLA非特异性降解，但能使变性HLA裂解的蛋白酶抑制剂。在某些实施方式中，溶液中包含的蛋白酶抑制剂选自酸性蛋白酶抑制剂、硫醇蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂及其组合。此类抑制齐IJ的例子包括胃蛋白酶抑制剂A (酸性蛋白酶抑制剂)、亮抑酶肽(硫醇蛋白酶抑制剂)、抗蛋白酶(硫醇蛋白酶抑制剂)、EDTA (金属蛋白酶抑制剂)和こニ醇ニこ醚ニ胺四こ酸(EGTA) (金属蛋白酶抑制剂)。在某些实施方式中，第一组合物的HLA附着于固体底物。与天然和变性HLA连接的固体底物可以由本领域技术人员公知的任意技术获得。与天然和变性HLA连接的固体底物可以由例如商品化途径获得，包括可购买获得与I类HLA、II类HLA或其组合连接的微珠(例如，FIowPRA I类和II类珠子、LABScreen I类和II类PRA珠子、LABScreen混合珠子和LABScreen单抗原I类和II类珠子(One Lambda, Inc.))。在其它实施方式中，与天然和变性HLA连接的固体底物可以通过将重组天然和变性HLA附着于固体底物上制备。可以采用本领域技术人员公知的任意技术制备重组天然和变性HLA，并将其附着于固体底物上，包括例如在 Pei 等，Transplantation 75 (I) :43-49 (2003)中描述的技术。6. 4. 2.使用丝氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶裂解变性HLA在某些实施方式中，该方法包括将天然和变性HLA的第一组合物在丝氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶裂解变性HLA的条件下，与所述丝氨酸蛋白酶、脂肪酶、酷酶或酰胺酶接触的步骤。本领域技术人员公知的可以裂解变性HLA的任意丝氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶均可以与底物接触。理想地，丝氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶选择性地裂解变性HLA但保留天然HLA的完整性。进ー步地，特定丝氨酸蛋白酶、脂肪酶、酷酶或酰胺酶选择性地裂解变性HLA的能力可以随着温度和HLA与特定丝氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶接触持续时间的改变而改变。本领域技术人员将能够确定特定蛋白酶、脂肪酶、酷酶或酰胺酶裂解特定类别变性HLA的适宜条件。在该方法的某些实施方式中，将HLA与丝氨酸蛋白酶接触，所述丝氨酸蛋白酶能够选择性裂解变性HLA同时保留天然HLA完整性。在特定实施方式中，将HLA与来自胰酶样家族的丝氨酸蛋白酶接触，其包括胰酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶。在特定实施方式中，丝氨酸蛋白酶是胰酶。在特定实施方式中，丝氨酸蛋白酶是糜蛋白酶。在特定实施方式中，丝氨酸蛋白酶是弹性蛋白酶。在其它实施方式中，丝氨酸蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。在某些实施方式中，将HLA与脂肪酶接触，所述脂肪酶能够选择性地裂解第一组合物中的变性HLA同时保留天然HLA完整性。在特定实施方式中，脂肪酶是磷脂酶。在特定实施方式中，磷脂酶选自磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C和磷脂酶D。
在某些实施方式中，将HLA与酯酶接触，所述酯酶能够选择性地裂解第一组合物中的变性HLA同时保留天然HLA完整性。在特定实施方式中，酯酶是乙酰胆碱酯酶。在其它实施方式中，酯酶是硫酯酶。在特定实施方式中，硫酯酶选自乙酰辅酶A水解酶、棕榈酰基辅酶A水解酶、琥珀酰基辅酶A水解酶和酰基辅酶A水解酶。在某些实施方式中，将HLA与酰胺酶接触，所述酰胺酶能够选择性地裂解变性HLA同时保留天然HLA完整性。在某些实施方式中，酰胺酶是肽酰胺酶。6.4.3.丝氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶的中和在用蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶裂解变性HLA后，中和蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶的酶活性。可以采用本领域技术人员公知的任意技术中和特定蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶。例如，通过将特定蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶与试剂接触可以实现中和，所述试剂包含所述蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶的抑制剂。在某些实施方式中，通过将蛋白酶与试剂接触实现中和，所述试剂包含一种或多 种蛋白酶抑制剂。在某些实施方式中，蛋白酶抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂。在特定实施方式中，丝氨酸蛋白酶抑制剂是胰酶抑制剂。在特定实施方式中，胰酶抑制剂是抑肽酶。在特定实施方式中，胰酶抑制剂是苯甲脒。在特定实施方式中，胰酶抑制剂是苯甲基磺酰氟(PMSF)0在特定实施方式中，胰酶抑制剂是胰酶中和溶液(Lonza，CC-5002)。在特定实施方式中，丝氨酸蛋白酶抑制剂是糜蛋白酶抑制剂。在特定实施方式中，糜蛋白酶抑制剂是糜蛋白酶抑制剂2。在特定实施方式中，丝氨酸蛋白酶抑制剂是弹性蛋白酶抑制剂。在某些实施方式中，弹性蛋白酶抑制剂是a I-抗胰酶。在某些实施方式中，丝氨酸蛋白酶抑制剂是枯草杆菌蛋白酶抑制剂。在某些实施方式中，枯草杆菌蛋白酶抑制剂是链霉菌属枯草杆菌蛋白酶抑制剂。在某些实施方式中，通过将脂肪酶与一种或多种脂肪酶抑制剂接触实现中和。在某些实施方式中，脂肪酶抑制剂是尼普司他汀(lipistatin)。在某些实施方式中，通过将酯酶与一种或多种酯酶抑制剂接触实现中和。在某些实施方式中，酯酶抑制剂是乙酰胆碱酯酶抑制剂。在某些实施方式中，乙酰胆碱酯酶抑制剂是有机磷酸酯或氨基甲酸酯。在某些实施方式中，酯酶抑制剂是硫酯酶抑制剂。在某些实施方式中，硫酯酶抑制剂是5-(呋喃-2-亚甲基)嘧啶-2，4，6-三酮。在某些实施方式中，通过将酰胺酶与一种或多种酰胺酶抑制剂接触实现中和。在某些实施方式中，酰胺酶抑制剂是腈。在某些实施方式中，腈是二(对硝基苯基)磷酸酯。6. 5抗天然HLA抗体的检测方法在另一方面，本披露提供了一种抗天然HLA抗体的检测方法。抗天然HLA抗体的检测可用于，例如，在组织或器官移植中，抗供体天然HLA的抗体的检测可以有助于确定移植物排斥的风险。在某些实施方式中，这些方法包括步骤a)将样品与包含连接至固体底物的HLA的组合物接触,其中至少90%的HLA是天然的，并且至多10%的HLA是变性的；以及b)检测抗体与组合物的结合，其中抗体与固体底物的结合表明存在对样品中的天然HLA具有特异性的抗体。组合物可以包含含有连接至固体底物的HLA的任意组合物，其中本披露提供的至少90%的HLA是天然的，并且至多10%的HLA是变性的。在某些实施方式中，连接至固体底物中至少90%的HLA属于相同的等位基因。在某些实施方式中，连接至固体底物中至少95%的HLA属于相同的等位基因。在某些实施方式中,连接至固体底物中至少99%的HLA属于相同的等位基因。在某些实施方式中，连接至固体底物中至少99. 5%的HLA属于相同的等位基因。在某些实施方式中，HLA选自I类HLA、II类HLA及其组合。在某些实施方式中，HLA是I类HLA。在某些实施方式中，HLA是II类HLA。在某些实施方式中，HLA是I类和II类HLA的组合。在某些实施方式中，组合物包含数个所述固体底物，其中与特定固体底物连接的HLA中至少90%属于相同的等位基因，且数个固体底物中的每个各自连接于与其余数个固体底物不同的HLA等位基因。在某些实施方式中，数个包含4个或更多的固体底物。在某些实施方式中，数个包含8个或更多的固体底物。在某些实施方式中，数个包含16个或更多的固体底物。在某些实施方式中，数个包含32个或更多的固体底物。可以使用本领域技术人员公知的任意有用的样品，包括生物样品。有用的生物样品的例子包括全血、血液衍生物、红血细胞浓缩物、血浆、血清、速冻血浆、来自于全血的血 小板浓缩物、球蛋白、冷沉淀物、脑脊液、组织和细胞如上皮细胞，如那些从口腔、干细胞、白细胞、中性粒细胞和粒细胞中收集得到的上皮细胞。样品可以来自人类供体的移植组织、细胞或器官或目标受体的所述移植组织、细胞或器官。在某些实施方式中，样品来自人类供体的移植肾脏、肝脏或心脏。在某些实施方式中，样品来自人类受体要移植的组织、细胞或器官。在特定实施方式中，样品来自人类受体要移植的肾脏、肝脏或心脏。在其它实施方式中，样品来自输血的人类供体或受体。在其它实施方式中，样品来自在受体中要输入的血液或血液衍生物。在某些实施方式中，样品来自骨髄移植的人类供体或受体。本领域技术人员公知的能够用于检测抗体与底物结合的任意系统均可以用于检测抗体的結合。例如，可以用偶联于可检测标记的ニ抗来检测抗体与天然HLA的结合，所述可检测标记如放射性标记、荧光标记、酶标记、亲和素标记、生物素标记或其组合。底物进ー步包含可检测标记，如本申请所描述的可以对结合的抗天然HLA抗体进行多重检测和分类的标记。在特定实施方式中，采用免疫吸附三明治检测如酶联免疫吸附试验(ELISA)进行抗体结合检測。当固体底物为微孔板时，免疫吸附三明治检测会特别有用。对于膜和滤片固体底物，可以采用免疫印迹技术进行抗体结合检测。在其它实施方式中，采用流式细胞术进行抗体结合检測。6. 6试剂盒另ー方面，本披露提供了用于检测抗天然HLA抗体的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒包括a)包含连接至固体底物的HLA的组合物，其中至少90%的HLA是天然的，并且至多10%的HLA是变性的，以及b)用于检测抗体与组合物结合的试剂。组合物可以包含含有连接至固体底物的HLA的任意组合物，其中本披露提供的至少90%的HLA是天然的，并且至多10%的HLA是变性的。在某些实施方式中，组合物包含数个所述固体底物，其中连接至特定固体底物的HLA中的至少90%属于相同的等位基因，且数个固体底物中的每个各自连接于与其余数个固体底物不同的HLA等位基因。在某些实施方式中，数个包含4个或更多的固体底物。在某些实施方式中，数个包含8个或更多的固体底物。在某些实施方式中，数个包含16个或更多的固体底物。在某些实施方式中，数个包含32个或更多的固体底物。可以使用本领域技术人员公知的用于检测抗体结合的任意试剂。例如，二抗可以用于在试验中检测抗体的结合，所述试验如Western印记、免疫印记、流式细胞术、ELISA和放射性免疫检测(RIA)中。在某些实施方式中，试剂包含二抗。在某些实施方式中，二抗是抗-人IgG抗体。在某些实施方式中，试剂包含含有可检测标记的二抗。在某些实施方式中，试剂盒包含可检测标记，所述可检测标记选自放射性标记、荧光标记、酶标记、亲和素标记、生物素标记及其组合。在某些实施方式中，试剂盒可以进一步包含洗涤缓冲液、对照缓冲液、凝胶、上样缓冲液、分子量标记、含有数个孔的板以及阳性和阴性对照样品。
通过下述非限制性例子对上文所描述的某些实施方式进行解释说明。7.实施例下述实施例进一步描述了本发明的各个方面。实施例I描述了天然I类HLA微珠的制备。实施例2描述了用于在天然I类HLA微珠上鉴定I类HLA类型的检测方法。实施例3提供的分析结果显示了天然I类HLA微珠的纯度。实施例4为天然I类微珠的抗体反应性结果。在这些实施例中，使用的是可商品化购买获得的来自One Lambda, Inc.的LABScreen产品,用其目录号表示。7. I实施例I :与天然I类HLA连接的微珠的制备本实施例提供了与天然I类HLA连接的微珠(“天然I类HLA微珠”)的示例性制备。LABScreen单抗原小珠(LSAB)，特别是LABScreen .单抗原HLA I类-Combi (目录ID:LS1A04)购自One Lambda, Inc.。不经处理，LSAB含有结合至小珠表面的天然和变性I类 HLA。图1A-1C显示了 W6/32和HClO与LSAB的反应性。单克隆抗体W6/32特异性地与天然I类HLA结合。单克隆抗体HClO特异性地与变性I类HLA结合。图1A-1C描述了针对A-基因座(图1A)、B-基因座(图1B)和C-基因座(图1C)的I类HLA等位基因的平均荧光强度(MFI)。检测抗体的MFI水平对应于抗体与天然或变性I类HLA的结合水平。这些图显示了 LSAB对W6/32和HClO单克隆抗体均具有反应性。为制备天然I类HLA小珠，用胰酶，即一种丝氨酸蛋白酶对LSAB上的变性I类HLA进行选择性蛋白水解消化。冻干形式的胰酶购自Lakewood, New Jersey的WorthingtonBiochemical Corporation (目录代码 TRL,目录号 LS00372)。将胰酶在IX磷酸缓冲盐(PBS)中复溶至工作浓度，所述工作浓度约0. 00004%至约 0. 04% 重量 / 体积，其中所述 PBS 购自 Irvine Scientific of Santa Ana, California。在约37°C条件下，将天然I类HLA小珠暴露于胰酶溶液中约30分钟。随后使用胰酶中和溶液(TNS)(目录号CC-5002)中和胰酶溶液，所述胰酶中和溶液购自 Walkersville, Maryland 的 Lonza ffalkersville, Inc.(目录号 CC-5002)。在使用胰酶消化约30分钟后，按照约2:1的体积加入储备TNS。在其它例子中，通过用混合物迅速稀释(约1:2)完成中和，所述混合物含有IX PBSjSO. 1%牛血清白蛋白(BSA)。接下来，将微珠在约10，OOOg离心约两分钟，使用约I ml. i X LABStm洗涤缓冲液(目录号LSPWABUF)洗涤两次。随后将微珠在约4°C条件下在约2%BSA中孵育过夜。然后使用约ImL LABSereen+^fe涤缓冲液洗涤微珠三次。7.2实施例2 :天然I类HLA微珠的检测本实施例证明了，根据本申请中所描述的方法制备的示例性微珠具有较高纯度。为确证蛋白水解消化除去了变性I类HLA，将根据实施例I制备的微珠嵌板与W6/32或HClO孵育，以分别检测天然I类HLA或变性I类HLA。将溶于约100 U I的约IX PBS的约I ii I稀释抗体与天然I类HLA微珠在室温条件下于震荡器上孵育约30分钟。随后使用约ImL LABSereen +洗漆液将微珠洗漆三次，然后与约IOOiU藻红蛋白偶联(PE-偶联)的山羊杭-小鼠ニ抗在室温条件下于震荡器上孵育约30分钟。随后洗涤微珠三次并用Luminex流式仪进行分析。图2A-2C提供了 W6/32 (对天然I类HLA具有特异性)和HClO (对变性I类HLA具 有特异性)与微珠的反应性。Y-轴代表MFI，X-轴代表对A-基因座(图2A)、B-基因座(图2B)和C-基因座(图2C)的I类HLA等位基因的特异性。通过从小珠嵌板中所有特异性的MFI中减去样品阴性对照小珠的MFI,对Luminex流式仪原始数据进行归ー化处理以除去非-特异性或背景信号。将超过1，000MFI的所有归ー化值认为是阳性。这些图显示天然I类HLA小珠与HClO的反应性较低，表明天然I类HLA小珠上残留的变性I类HLA的百分率较低。7. 3实施例3 :天然I类HLA微珠的纯度本实施例提供了若干示例性天然I类HLA微珠样品的纯度，所述微珠根据本披露所述的方法制备。下表1-3显示了微珠中残留的变性I类HLA的百分率，所述微珠根据上述实施例I中提供的制备方法制备，并利用上述实施例2中提供的方法检测。根据公式计算变性I类HLA的百分率[HC10 MFIバHClO MFI+W6/32 MFI)]*100。数据来自于98个微珠样品(5批次)。下表I中的数据是天然I类HLA微球样品对A-基因座I类HLA等位基因的特异性。该数据显示变性I类HLA的平均百分率是0. 81%，标准偏差是0. 97%。表I 天然I类HLA微珠上(A-基因座)变性HLA的百分率
权利要求
1.一种包含至少90%天然人白细胞抗原和至多10%变性人白细胞抗原的组合物。
2.根据权利要求I所述的组合物，其特征在于所述人白细胞抗原选自I类人白细胞抗原、II类人白细胞抗原及其组合。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于所述人白细胞抗原是I类人白细胞抗原。
4.根据权利要求I所述的组合物，其特征在于至少90%的所述人白细胞抗原属于相同的等位基因。
5.根据权利要求I所述的组合物，其特征在于所述人白细胞抗原与固体底物连接。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于所述固体底物选自数个珠子、数个微珠、数个微粒、数个微球、孔、膜、聚合物、滤片和微阵列及其组合。
7.根据权利要求5所述的组合物其特征在于所述固体底物是数个微珠。
8.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于所述固体底物包含选自二氧化硅、金、乳胶、聚苯乙烯、聚砜、水凝胶、聚氯乙烯、玻璃、及其组合的材料。
9.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于所述固体底物包含可检测标记。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于所述可检测标记是荧光染料、放射性标记、磁标记、条码或其组合。
11.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于所述人白细胞抗原与固体底物共价连接。
12.根据权利要求5所述的包含数个所述固体底物的组合物，其特征在于与数个特定固体底物连接的人白细胞抗原中的至少90%属于相同的等位基因，且数个固体底物中的每个各自连接于与其余数个固体底物不同的人白细胞抗原等位基因。
13.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于所述天然和变性人白细胞抗原是I类人白细胞抗原。
14.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于数个所述固体底物包含4个或更多个固体底物。
15.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于数个所述固体底物包含8个或更多个固体底物。
16.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于数个所述固体底物包含16个或更多个固体底物。
17.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于数个所述固体底物包含32个或更多个固体底物。
18.制备包含至少90%天然人白细胞抗原和至多10%白细胞抗原的组合物的方法，其包含步骤 a.将包含天然和变性人白细胞抗原的第一组合物在丝氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶消化所述变性人白细胞抗原的条件下，与所述丝氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶接触；以及 b.中和所述丝氨酸蛋白酶、脂肪酶、酯酶或酰胺酶，以产生包含至少90%天然人白细胞抗原和至多10%白细胞抗原的产物组合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述人白细胞抗原包含天然和变性I类人白细胞抗原。
20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述人白细胞抗原与一个或多个固体底物连接。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于所述人白细胞抗原与数个微珠或微粒连接。
22.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述第一组合物与丝氨酸蛋白酶接触。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于所述丝氨酸蛋白酶选自胰酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶或其组合。
24.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述第一组合物与脂肪酶接触。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于所述脂肪酶是磷脂酶。
26.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述第一组合物与酯酶接触。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于所述酯酶是乙酰胆碱酯酶。
28.根据权利要求26所述的方法，其特征在于所述酯酶是硫酯酶。
29.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述第一组合物与酰胺酶接触。
30.筛选与天然人白细胞抗原结合的抗体的方法，包括步骤 a.将样品与权利要求5所述的组合物接触；以及 b.检测抗体与所述组合物的结合，其中抗体与所述组合物的结合表明存在对所述天然人白细胞抗原具有特异性的抗体。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于采用流式细胞术检测所述抗体的结合。
32.根据权利要求30所述的方法，其特征在于采用二抗检测所述抗体的结合。
33.根据权利要求32所述的方法，其特征在于所述二抗包含选自放射性标记、荧光标记、酶标记、亲和素标记生物素标记及其组合的标记。
34.根据权利要求30所述的方法，其特征在于所述组合物包含数个微珠或微粒。
35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于所述组合物包含数个微珠，其中数个微珠中的每个均包含可检测标记。
36.根据权利要求权利要求35所述的方法，其特征在于所述可检测标记是荧光染料、放射性标记、磁标记或条码。
37.包含权利要求5的组合物和试剂的试剂盒，所述试剂用于检测抗体与组合物的结
38.根据权利要求37所述的试剂盒，其特征在于所述试剂包含二抗。
39.根据权利要求38所述的试剂盒，其特征在于所述二抗包含选自放射性标记、荧光标记、酶标记、亲和素标记和生物素标记的标记。
全文摘要
本披露提供了包含天然和变性人白细胞抗原(HLA)的组合物和制备所述组合物的方法。本披露还提供了检测抗天然HLA抗体的方法和试剂盒。目前为止，天然HLA是所述组合物的主要组分，其通过在混合组合物中利用选择性酶反应的方法富集天然HLA来制备。
文档编号C12P21/00GK102770448SQ201180010106
公开日2012年11月7日 申请日期2011年2月16日 优先权日2010年2月17日
发明者A·伊迪卡, P·I·泰萨奇, 邓纯灿 申请人:美国莱姆德有限公司